La tumorigenèse est influencée par des facteurs génétiques et environmentaux. La surnutrition est une cause d'obésité et d'accumulation pathologique de lipides dans le foie, la stéatose, qui peut évoluer en stéato-hépatite. Obésité et stéato-hépatite contribuent à l'augmentation de l'incidence du diabète dans le monde entier. Le diabète et l'obésité sont des facteurs de risque pour le cancer du foie (El-Serag et al., Clin Gastroenterol Hepatol, 2006). Cet projet de thèse élucide les mécanismes moléculaires liant l'activation de la voie de signalisation de l'insuline, les maladies du foie gras et le développement du cancer du foie, et il propose de nouvelles stratégies thérapeutiques. La délétion hépato-spécifique du gène codant le suppresseur de tumeurs Phosphatase and tensin homolog (PTEN) est un modèle de cancer du foie associé à la stéatose (Horie et al., J Clin Invest, 2004). Nous avons utilisé ce modèle, où la cascade de signalisation PI3K/mTOR est activée, pour démontrer que l'induction de l'expression du facteur de transcription et récepteur nucléaire Peroxysome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) est responsable de la stéatose et de la glycolyse aérobie (effet Warburg). Son activité est spécifiquement dépendente de l'activité d'un effectuer en aval de la voie PI3K/mTOR, la protéine sérine/thréonine kinase, AKT2 (Panasyuk et al., Nat Comm, 2012). Sur la base de ces observations, nous avons construit l'hypothèse que PPARγ est un important régulateur de la croissance pathologique et du développement des adénocarcinomes hépatiques associés aux stéato-hépatites. Avec mon travail de thèse j'ai pu démontrer que l'expression et l'activité de PPARγ sont essentielles pour le développement du cancer du foie dans le modèle de souris invalidées pour PTEN dans les hépatocytes. Par ailleurs, la délétion de PPARγ dans le foie dépourvu de PTEN joue un rôle protecteur de la tumorigenèse, confirmant que PPARγ est effectivement placé en aval de AKT2. De plus, nous avons découvert que PPARγ est induit dans des échantillons de carcinome hépatocellulaire humains. Ces échantillons sont caractérisés par leur agressivité (haut taux prolifératif et bas niveau de différentiation) et aussi par l'activation de la voie PI3K/AKT. L'analyse des échantillons humains au stade pré-carcinome (adénomes) nous a permis de démontrer que l'ARN de PPARγ est le plus exprimé dans les adénomes caractérisés par un haut degré de stéatose. Ils sont caractérisés par la perte de fonction du facteur de transcription Hepatocyte Nuclear Factor 1α (HNF1α). Nous avons identifié HNF1α comment un nouveau régulateur négatif de la transcription de PPARγ. Nous avons aussi découvert que l'expression et l'activité de HNF1α sont inhibées par AKT2, induisant l'expression de PPARγ et son activité pro-tumorigénique. Finalement, la sensitibilité de PPARγ aux ligands, naturels et exogènes, nous a encouragé à tester des traitements pharmacologiques pour moduler son activation. La stimulation de l'activité de PPARγ avec l'agoniste synthétique Pioglitazone a conduit à une aggravation des symptomes dans le foie. Par contre, son inhibition par un antagoniste sélectif, SR2595, était thérapeutique, resultant en une réduction de signes pré-tumoraux et tumoraux dans le foie des souris invalidé par PTEN. En résumé, nos études chez l'humain et la souris, révèlent une nouvelle signature d'interaction entre les facteurs de transcription HNF1α et PPARγ et la voie de signalisation de l'insuline, suggérant de nouvelles stratégies thérapeutiques possibles pour le traitement d'une sous-classe spécifique de cancer du foie lié aux stéato-hépatites. / Tumorigenesis is influenced by genetic and environmental factors. Overnutrition leads to obesity and fatty liver disease, contributing to increase diabetes incidence worldwide. Diabetes and obesity are independent risk factors for liver cancer development (El-Serag et al., Clin Gastroenterol Hepatol, 2006). This PhD project elucidates the molecular mechanisms linking activated insulin signalling pathway, fatty liver disease and liver cancer development and proposes novel therapeutic strategies. The hepatocytes-specific deletion of tumour suppressor Phosphatase and tensin homolog (PTEN) is a model of steatosis-associated liver cancer (Horie et al., J Clin Invest, 2004). Using this model of activated PI3K/mTOR signalling, our laboratory discovered that the nuclear receptor transcription factor Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is induced in PTEN-null liver. My group demonstrated that in the liver PPARγ contributes to steatosis and aerobic glycolysis. Its activity specifically requires a downstream effector in the PI3K/mTOR pathway, the serine/threonine-specific protein kinase AKT2 (Panasyuk et al., Nat Comm, 2012). Based on these observations, we hypothesized that PPARγ might be an important regulator of pathological growth and development of steatohepatitis-associated liver adenocarcinomas. In my PhD work, I demonstrated that PPARγ expression and activity is essential for liver cancer in PTEN mutants. Moreover, PPARγ is induced in human samples of Hepatocellular Carcinoma (HCC) characterized by poor differentiation accompanied by the activation of PI3K/AKT pathway. We could attribute to PPARγ a specific role in tumour formation as it is required for abnormal liver growth and steatosis in mice at pre-tumoral age. In addition, deletion of PPARγ in PTEN mutants protected animals form liver tumorigenesis placing PPARγ downstream of activated AKT2. Analysing human samples of pre-carcinoma lesions characterized by high steatotic rate, we demonstrated that PPARγ transcript levels are increased in a specific subgroup of adenomas characterized by loss-of-function mutations in the Hepatocyte Nuclear Factor 1α (HNF1α). We identified HNF1α as a novel direct negative regulator of PPARγ transcription. We also revealed HNF1α expression and activity inhibited by AKT2 and thereby inducing PPARγ pro-tumorigenic action. Finally, the sensitivity of PPARγ to natural and exogenous ligands encouraged us to perform treatments to pharmacologically modulate PPARγ activity. Further activation of PPARγ with its synthetic ligand pioglitazione dramatically aggravates liver disease. While PPARγ inhibition by selective antagonist SR2595 allowed to reduce the pre-tumoral and tumoral signs of PTEN-null mice. In sum, our studies in men and mice reveal a novel pro-tumorigenic network of transcription factors HNF1α and PPARγ downstream of activated insulin signalling pathway, suggesting possible strategies for treatment of a subgroup of steatohepatitis-associated liver cancer.

Pas de résumé en français / Pas de résumé en anglais

Le cancer du sein touche une femme sur huit dans le monde et représente un problème majeur de santé publique. Alors que la majorité des tumeurs du sein sont aujourd’hui la cible de traitement efficaces, il reste une sous-population de tumeurs (dites triple-négatives) à fort potentiel métastatique qui ne sont pas accessibles aux thérapies ciblées et demeurent de mauvais pronostic. L’élucidation des processus impliqués dans la progression tumorale et la formation de métastases reste un challenge majeur dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer du sein de mauvais pronostic. ATIP3 (AT2-interacting protein 2), produit du gène candidat suppresseur des tumeurs MTUS1 (Microtubule-Associated Tumor Suppressor), a été identifiée par le laboratoire comme étant un biomarqueur des tumeurs du sein les plus agressives. En effet, les résultats précédents de notre équipe ont montré que l’expression d’ATIP3 est diminuée dans 85% des tumeurs de haut grade, 83% des tumeurs triples négatives et dans 62% des tumeurs métastatiques. Il a également été montré qu’ATIP3 inhibe la prolifération cellulaire in vitro, ainsi que la croissance tumorale in vivo. Au niveau moléculaire, ATIP3 a été identifiée comme étant une nouvelle protéine associée aux microtubules (MAP) localisée au centrosome, le long de microtubules dans les cellules en interphase, au fuseau mitotique pendant la division cellulaire et au pont intercellulaire lors de la cytokinèse. La localisation cellulaire d’ATIP3, étroitement associée aux microtubules, prend toute son importance du fait du rôle de ce cytosquelette dans la division et migration cellulaire, deux étapes essentielles du processus tumoral.Mon projet de thèse a pour objectif principal d'évaluer le rôle potentiel d'ATIP3 dans la migration cellulaire et la formation de métastases tumorales. Dans un premier temps, les niveaux d’expression d’ATIP3 ont été analysés dans des séries de puces à ADN issues de trois cohortes indépendantes de patientes atteintes d’un cancer du sein invasif, et les données ont été comparées avec les caractéristiques cliniques des patientes. Ces analyses transcriptomiques ont permis de montrer que l’expression d’ATIP3 est un marqueur pronostic de la survie des patientes et de façon intéressante, qu’ATIP3 est un nouvel indicateur de la progression métastatique. L’effet d’ATIP3 sur la progression des métastases a alors été évalué dans un modèle de bioluminescence in vivo, ce qui a permis de montrer que cette protéine est une molécule anti-métastatique qui réduit la progression, le nombre et la taille des foyers métastatiques. La colonisation métastatique inclut la migration des cellules cancéreuses à travers la matrice extracellulaire (invasion) et l’endothélium vasculaire (extravasation), puis leur prolifération au site secondaire. L’évaluation détaillée de ces étapes a montré qu’ATIP3 diminue tous ces processus. En ce qui concerne la migration, une réduction de vitesse, de la direction de migration et possiblement de la polarité cellulaire, pourraient expliquer les effets inhibiteurs d’ATIP3 sur la migration des cellules. Comme de nombreuses études ont démontré que la migration et la polarité cellulaires dépendent du cytosquelette de microtubules, je me suis intéressée aux effets d’ATIP3 sur la dynamique microtubulaire. Des expériences de vidéomicroscopie ont permis de montrer que l’extinction d’ATIP3 augmente la dynamique des microtubules en incrémentant les épisodes et la vitesse de croissance et en diminuant le temps passé en pause et la fréquence des catastrophes. Ces résultats, couplés à des expériences de dépolymérisation et de re-croissance ont permis de conclure qu’ATIP3 est une MAP qui stabilise les microtubules et diminue leur dynamique pour contrôler la polarité et la migration cellulaires. L’ensemble de ces travaux font l’objet d’une publication parue en 2013 (Molina et al., Cancer Res 73, 2905). (...) / Breast cancer is the most common malignancy in women, affecting one out of eight women worldwide. Even if most of the breast tumors are efficiently treated using targeted therapies, there is still a heterogeneous breast cancer subpopulation known as “triple-negative”, which is highly metastatic and, due to the absence of targeted therapies, of poor prognosis. The elucidation of the processes involved in tumor progression and metastasis remains an important challenge in the search for new therapies against this subtype of breast cancer. Previous results from the laboratory have shown that ATIP3, a major product of the candidate tumor suppressor gene MTUS1, is a microtubule associated protein (MAP), whose expression is decreased in 85% of high grade, 83% of triple negative and 62% of metastatic breast carcinomas. Re-expression of ATIP3 in breast cancer cells significantly reduces cell proliferation in vitro, and tumor growth in vivo. Based on these results, my PhD project aimed at evaluating the role of ATIP3 in tumor cell migration and cancer metastasis. In the first part of my thesis, I will present data showing that ATIP3 is a novel prognostic marker for breast cancer patients’ survival and a new anti-metastatic molecule. By means of DNA microarray analysis, we showed that low ATIP3 expression levels correlate with reduced overall survival of metastatic breast cancer patients. Using an in vivo model for cancer metastasis, we then showed that re-expression of ATIP3 reduces metastatic progression and lowers the number and size of metastatic foci. At the functional level, ATIP3 reduces breast cancer cell migration by reducing cell velocity and directionality. At the molecular level we further showed, using nocodazole washout experiments and MT growing ends tracking, that ATIP3 slows MT regrowth and decreases MT dynamics. Altogether, these studies indicate that ATIP3 is a novel MT stabilizing protein that controls the ability of MT tips to reach the cell cortex during migration, a mechanism that may account for reduced cell migration and metastasis. In the second part of my thesis, I will present data investigating the mechanisms by which ATIP3 regulates MT dynamics. To this end, we searched for new ATIP3-interacting partners. Interestingly, EB1, the core component of plus-end tracking proteins, was found to interact with ATIP3 not at the growing end of the MTs (as most EB1-interacting proteins), but mostly in the cytosol and at the MT lattice. The identification of the EB1-interacting domain of ATIP3 (termed CN) and further characterization of deletion mutants revealed that ATIP3-EB1 interaction is involved in impaired accumulation of EB1 at the plus-end. Based on these results and on FRAP analysis of EB1-GFP fluorescence recovery, a model was proposed in which the interaction between ATIP3 and EB1 may slower EB1 turnover at the MT plus-end, possibly by limiting EB1 association with its recognition site. In line with this model, in ATIP3-depleted cells dynamic EB1 molecules are more prone to accumulate at the growing end to increase MT dynamics. Relevance of this model in human pathology was then tested by evaluating ATIP3-EB1 expression levels in breast tumors, indicating that combined relative expression levels of both proteins may be considered as a prognostic marker of patient survival. Finally, in a third part of my thesis, I will present some preliminary data showing that ATIP3 may interact with the depolymerizing kinesin MCAK and the tumor suppressor APC, both of which are also well-known partners of EB1. The characterization and the implication of these interactions on ATIP3 functions (MT dynamics for MCAK interaction and cell polarity for APC interaction) remains to be investigated.

Les traitements antirétroviraux (ARV) ont profondément amélioré l’espérance de vie des patients infectés par le VIH-1. Cependant, chez ces patients traités par ARV, le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) reste présent dans les réservoirs cellulaires composés notamment de lymphocytes T CD4+ quiescents infectés de façon latente dans lesquels le provirus intégré est transcriptionellement silencieux. L’existence de ces réservoirs très stables au cours du temps et contenant des provirus réactivables compromet la possibilité d’une éradication complète du VIH-1. Le VIH-1 s’intègre préférentiellement dans les régions codantes du génome grâce à l’action de l’Intégrase virale et de son cofacteur cellulaire LEDGF/p75. Bien que la majorité des événements d’intégration se traduisent par l’expression des gènes viraux, une partie des provirus intégrés dans les lymphocytes T CD4+ activés peuvent également être inhibés transcriptionnellement. Au laboratoire, nous avons montré que LEDGF/p75 forme un complexe avec deux autres protéines cellulaires Iws1 (Interacting With Spt6) et Spt6. Ce complexe est recruté au niveau du provirus et participe à l’établissement et au maintien de la latence dans les lymphocytes T CD4+ (Gérard et al, 2015). Iws1 est une protéine qui intervient dans la régulation transcriptionnelle particulièrement au cours de la phase d’élongation de l’ARN polymérase II (ARNPII). Nos travaux indiquent que l’extinction de l’expression d’Iws1 dans des cellules infectées de manière latente induit la réactivation de l’expression virale. L’objectif de ma thèse a été de comprendre comment Iws1 participe au contrôle de l’expression du VIH-1 à la fois lors des étapes post-intégratives conduisant à la latence mais aussi au cours de la réactivation de l’expression des gènes viraux. La purification de la protéine Iws1 suivi de l’identification par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier plusieurs de ses cofacteurs cellulaires. Parmi eux, nous avons identifié PNUTS, Tox4, Wdr82 et la protéine phosphatase 1 (PP1) qui sont les sous-unités du complexe PTW/PP1 récemment décrit comme étant impliqué dans la régulation transcriptionnelle de gènes cellulaires. Le rôle de ce complexe dans la régulation de l’expression du VIH-1 a ensuite été exploré. L’extinction de l’expression des protéines du complexe PTW aboutit à la réactivation du promoteur viral. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) indiquent qu’Iws1, PNUTS et Wdr82 sont présents au niveau du provirus transcriptionnellement inactif. L’activation de l’expression - 2 - virale induite par traitement au phorbol ester corrèle avec une forte augmentation du recrutement d’Iws1 et de PNUTS le long de la région codante du VIH-1 alors que la distribution de Wdr82 n’est pas affectée. Nous avons développé une lignée de cellule J-Lat dans laquelle le gène codant pour Iws1 a été invalidé (J-Lat Iws1 -/-) afin d’étudier son rôle dans le recrutement du complexe PTW/PP1. Au cours de l’activation transcriptionnelle, la déplétion d’Iws1 augmente sensiblement le recrutement de PNUTS et de l’ARNPII le long du génome viral alors que le recrutement de Wdr82 diminue dans sa région 3’. Ces travaux montrent qu’en interagissant avec le complexe PTW/PP1, Iws1 participe à la régulation transcriptionnelle du VIH-1. / No abstract

L’homéostasie des mélanocytes est d'une importance primordiale dans la prévention de la transformation maligne. Les mélanocytes transformés conduisent souvent à un type particulièrement agressif de cancer de la peau, le mélanome, qui est souvent réfractaire au traitement. Plusieurs processus clés impliquant MAPK, PI3K, et les cascades de signalisation WNT, ont été identifiés comme indispensables pour la transition des mélanocytes cellules de mélanome. L'objectif de cette thèse était de décrire le rôle de la signalisation WNT/β-caténine dans la régulation de l'équilibre homéostatique dans la mélanogénèse et sa fonction tout aussi importante dans melanomagénèse. Nous avons identifié un rôle inconnu de la β-caténine dans la production de mélanine. Nous avons démontré que l’activation de la β– caténine avait un impact sur les niveaux d’expression de gènes mélanosomaux clés et que. De plus, nous avons observé que cela n’avait pas simplement un effet sur la production des mélanosomes, mais aussi sur leur migration intracellulaire. Par ailleurs, nous avons été en mesure d'associer cette production dysfonctionnelle avec un phénotype de l'hypopigmentation, observée chez les souris transgéniques qui contiennent de la β-caténine transcriptionnellement active. L’ensemble de ces résultats replacerait ainsi la β-caténine au centre de l’homéostasie mélanocytaire. Enfin, nous avons évalué la conséquence de la perturbation de la signalisation PI3K, par l'intermédiaire de la perte de suppresseur de tumeur PTEN, et par l’activation concomitante de NRAS, l’effecteur des MAPK. Nos résultats démontrent de façon concluante que les mutations NRAS et la perte de PTEN, dans les mélanocytes, peuvent effectivement induire et maintenir la formation de mélanomes. Nous avons également démontré que ce processus est modulé par une boucle de rétro-contrôle positif impliquant la translocation de la membrane des complexes β-catenin/Caveolin-1 et la répression de microARN. Cette partie du travail peut fournir plus de détails sur la complexité de la régulation de la transcription par la β-caténine et que celle-ci ne régule pas seulement l’expression des gènes mais aussi celle ce microARN, au moins dans le mélanome. / Melanocyte homeostasis is of paramount importance in preventing malignant transformation. The transformed melanocytes often lead to a particularly aggressive type of skin cancer, melanoma, which is often unresponsive to therapy. Several key processes, involving the MAPK, PI3K, and WNT signaling cascades, have been identified as indispensable for the transition from melanocyte to melanoma cells. The goal of this PhD thesis was to describe the role of WNT/β-catenin signaling in regulating homeostatic balance in melanogenesis and its equally important function in melanomagenesis. Firstly, we identified an unknown role of β-catenin in melanin production. We demonstrate that β-catenin activation impacts the expression levels of key melanosomal related genes. Additionally, we observed that this effect was not restricted to just melanosome production but also intracellular migration. Moreover, we were able to associate the dysfunctional production with a hypopigmentation phenotype, observed in mice that transgenically contain transcriptionally active β- catenin. Altogether, these findings would place β-catenin again in the center of melanocyte homeostatsis. Lastly, we evaluated the consequence of disrupting PI3K signaling, via loss of the tumor suppressor PTEN, and concomitant activation of the MAPK effector NRAS. Our results conclusively demonstrate that NRAS mutation and loss of PTEN, in melanocytes, can effectively induce and maintain melanoma tumor formation. We could also demonstrate that this process is driven by a positive auto regulatory loop involving β-catenin/Caveolin-1 membrane translocation and repression of microRNAs. This part of the work may provide further details of the complex level of β-catenin transcriptional regulation and that transcription may not be solely gene dependent, at least in melanoma.

Biologie cellulaire et moléculaire / Cell and molecular biology

Les phéochromocytomes et les paragangliomes (PPGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares qui se développent aux dépens des paraganglions et qui sont identiquement déterminées dans 40% des cas. Parmi les gènes de prédisposition, les mutations du gène SDHB qui code pour l’une des sous-unités catalytiques de la succinate déshydrogénase mitochondriale constituent un facteur de risque de phénotype métastatique associé à un mauvais pronostic. Mon travail de thèse avait pour objectif d’élucider le lien entre les mutations du gène SDHB et la malignité des PPGL par l’étude du rôle du microenvironnement tumoral et en particulier de la matrice extracellulaire (MEC) dans le processus métastatique. L’analyse transcriptomique de l’expression de 310 gènes associés a la MEC dans 188 PPGL humains de la cohorte COMETE, a mis en évidence une régulation spécifique de ces gènes dans les tumeurs présentant des mutations SDHx. J’ai utilisé un modèle murin de cellules chromaffines déficientes en succinate déshydrogénase, les cellules Sdhb-/-, en comparaison avec les cellules sauvages (wild-type, WT). Les cellules Sdhb-/‐ possèdent des capacités migratoires et adhésives accrues dues a l’accumulation de succinate inhibant les dioxygénases dépendantes du 2‐oxoglutarate (2‐OG). J’ai mis en évidence que la MEC secrétée par les cellules Sdhb‐/- est capable d’augmenter les capacités migratoires et d’adhésion des cellules WT. Inversement, la MEC secrétée par les cellules WT diminue la migration et l’adhésion des cellules Sdhb-/-. Ainsi, les cellules Sdhb‐/- semblent secréter une matrice qui favorise le replacement des cellules et donc leur potentiel métastatique. Afin d’identifier les acteurs responsables de ce phénotype particulier nous avons analyse le sécrétome de la MEC : le matrisome des cellules Sdhb-/- et des WT, nous permettant d’identifier la fibronectine, cible de l’hypoxie, comme l’une des protéines majeures de la MEC secrétée par les cellules Sdhb-/‐. J’ai montré que la fibronectine augmente de façon drastique la migration et l’adhésion des cellules WT et qu’elle participe a la migration des cellules Sdhb‐/-. L’analyse du transcriptome et du matrisome des cellules Sdhb-/- a également mis en évidence la surexpression de nombreux collagènes et en particulier le gène Col4a2 qui code pour l’un des composants majoritaires des membranes basales. J’ai montré que malgré l’accumulation de succinate dans les cellules Sdhb-/-, les collagènes hydroxylases 2-OG dépendantes, restent probablement actives ce qui permet la maturation des collagènes puis leur sécrétion dans le milieu extracellulaire. Cependant, le collagène IVα2 est fragmenté dans les cellules Sdhb-/- suggérant des modifications après sa sécrétion. J’ai ainsi montré que l’activation de la MMP9 dans les cellules Sdhb‐/-, participe à la dégradation du collagène IVα2. L’ensemble de ces résultats a ainsi révélé l’existence d’un remodelage de la MEC spécifique aux cellules Sdhb‐/- qui favorise le phénotype métastatique en promouvant notamment la migration et l’adhésion cellulaire. En parallèle de ce travail et dans le cadre d’un projet collaboratif, j’ai montré que seules les cellules Sdhb-/- sont capables d’induire le processus d’angiogenèse compare aux cellules WT et de le maintenir en faisant croître des vaisseaux pré-existants en 3-dimensions. Au sein de la même collaboration, j’ai également travaillé sur la mise au point d’une lignée humaine de cellules chromaffines tumorales en 3-dimensions à partir de culture primaire de PPGL humains. Ce travail se poursuit actuellement et pourrait donner lieu à la mise au point des premières conditions expérimentales permettant de cultiver ces cellules in vitro. / Pheochromocytomas and paragangliomas (PPGL) are rare neuroendocrine tumors, which arise from paraganglia and are genetically determined in 40% of cases. Among the predisposition genes, mutations in the SDHB gene, which encodes the catalytic core subunit of the mitochondrial enzyme, succinate dehydrogenase, are associated with malignancy and poor prognosis. The main objective of my thesis project was to elucidate the link between SDHB mutations and PPGL malignancy by studying the role of tumor microenvironment and in particular of the extracellular matrix (ECM) in the metastatic process. The transcriptomic analysis of 310 ECM‐associated genes in 188 human PPGL of the COMETE collection showed a specific regulation of ECM-encoding genes in SDHx-mutated tumors. I used a mouse model of Sdhb deficient chromaffin cells compared to their wild-type (WT) counterparts. Sdhb-/- cells display increased migratory and adhesive capacities cause by succinate accumulation that inhibit 2-oxoglutarate (2--‐OG) dependent dioxygenases. I showed that the ECM secreted by Sdhb‐/- cells is able to increase migration and cell adhesion of WT cells. Conversely, the ECM secreted by WT cells decreases migration and adhesion of Sdhb-/- cells. Hence, Sdhb-/- cells seem to secrete an ECM promoting cell motility and thus their metastatic potential. To identify specific ECM components responsible for this particular phenotype, we analyzed the ECM secretome, i.e. the matrisome, of both cells types. This study identified fibronectin as one of main ECM protein secreted by Sdhb-/- cells. I showed that fibronectin drastically increases migration and adhesion of WT cells and participates to Sdhb- /- cells migration. Sdhb-/- transcriptome and matrisome analyses also highlighted the overexpression of many collagens and in particular Col4a2 encoding one of main component of basement membranes. I demonstrated that despite succinate accumulation in Sdhb‐/- cells, 2-OG dependent collagen hydroxylases remain apparently active, allowing collagen maturation and their subsequent secretion in the extracellular space. Besides, collagen IVα2 is fragmented in Sdhb-/‐ cells suggesting post-excretion modifications. I showed that MMP9 activation in Sdhb‐/‐ cells, participates to collagen IVα2 degradation. Alltogether, these results revealed the existence of Sdhb‐/- specific remodelling of the ECM which may promote mestastatic phenotype by inducing migration cell and adhesion. In parallel, and as a part of a collaborative project, I showed that Sdhb‐/- chromaffin cells (but not WT cells) are able to induce the angiogenic process and to maintain the growth of pre-existing vessels in 3-dimensions. Within the same collaboration, I also worked on the development of a human tumoral chromaffin cells line using 3-dimensions spheroid cultures of human PPGL. This work is ongoing and could lead to the development of the first experimental conditions for growing human PPGL cells in vitro.

L'hépatite virale C est une maladie touchant aujourd'hui aux alentours de 200 millions de personnes dans le monde. C'est la première cause mondiale de greffe hépatique puisque son issue peut être le développement d'un hépatocarcinome. La maladie se déroule en 2 phases, une aigue, asymptomatique, dont environ 30% des maladies guérissent spontanément. Les autres vont voir leur maladie devenir chronique, avec installation d'une fibrose, puis d'une cirrhose et enfin un risque de 3% supplémentaires par an de développer un cancer du foie. Il n'existe à ce jour aucun vaccin préventif. Le traitement standard utilisé est une combinaison d'interféron alpha pégylé et de ribavirine et n'est efficace que dans 50% des cas pour le génotype 1, majoritaire. A ce jour, les mécanismes d'action du traitement lors de la phase chroniques sont très flous. Les objectifs de ce travail ont été d'étudier un panel varié de populations cellulaires périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C chronique afin notamment d'en évaluer les impacts causés par le traitement. Nous avons étudié finement les populations de cellules NK qui sont connues pour avoir certainement un rôle important dans la pathologie ainsi que pour subir de lourdes pressions du virus. Nous avons aussi étudié des facteurs immunitaires avant traitement potentiellement capables de nous indiquer quels malades répondront favorablement à la thérapie et quelles cellules produisaient de l'IFN en phase prétraitement. Nous avons étudié une multitude de paramètres immunologiques durant toutes les phases d'un traitement, avant pendant et 6, mois après, afin de pouvoir conclure sur les effets immunologiques de la bithérapie IFN+ribavirine. Enfin nous avons voulu caractériser et élucider la localisation et les rôles exacts des cellules T régulatrices périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C. Afin d'atteindre les buts que nous nous étions fixé, nous avons utilisé une assez vaste combinaison de technologies. Nous avons étudié les phénotypes des cellules par cytométrie de flux en 4 couleurs, mesuré l'expression d'une grande variété de gènes d'intérêts par RT-PCR, mesuré la sécrétion d'IFN spécifique du virus par elispot et enfin la sécrétion d'un panel de 6 cytokines de profil Th1 par CBA. Nous avons travaillé en étroite collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble qui nous a fourni les échantillons sanguins et les biopsies hépatiques dont nous avions besoin. Nous avons tout d'abord étudié les populations NK intrahépatiques et périphériques ainsi que les corrélations entre leurs fréquences, leur phénotype et les paramètres cliniques. Cette étude a été réalise sur des malades chroniques d'hépatite C, mais aussi des témoins sains et atteints d'hépatite B chronique afin d'en extraire les impacts virus-spécifiques. Nous avons trouvé une augmentation du ratio NK cytotoxiques/NK sécrétrices lors de l'hépatite virale C. Nous avons pu mettre en lumière 2 sous-population particulières de NK, l'une associées au contrôle du virus, CD3-CD56dimNKG2A+, et l'autre a contrario associée aux lésions hépatiques, CD3-CD56brightNKG23A+. Notre étude sur les facteurs prétraitement prédictifs de la réponse thérapeutique a permis de déterminer le taux basal d'expression de l'IFN comme étant corrélé positivement à la réponse au traitement. De plus, il est significativement plus élevé chez les malades chroniques que chez les contrôles sains. Nous avons voulu ensuite savoir dans quel type cellulaire il était exprimé chez les futurs répondeurs. Nous en avons conclu que les cellules productrices d'IFN avant thérapie étaient les lymphocytes TNK. Nous avons ensuite suivi la réponse immunitaire T au cours du traitement contre l'hépatite C. Nous avons mesuré l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ via l'expression du récepteur CD25 (IL-2R), leur sécrétion d'interféron  en présence de peptides viraux par le biais de la technique de l'elispot, l'expression des gènes antiviraux induits par les IFNs par RT-PCR et les évolutions de leur phénotype, en plus de celui des cellules NK, par cytométrie en flux. Pour se faire, nous avons eut accès à une cohorte de malades issus d'un essai clinique financé par l'ANRS en collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble, le projet Gammatri. Celui-ci consistait en l'évaluation de l'impact de l'ajout d'interféron  en injection pour des patients non-répondeurs à la thérapie classique. Nous avons pu avoir des prélèvements sanguins réguliers des malades avant, pendant les 48 semaines de traitement et après un suivi à la semaine 72, d'où nous avons extrait les cellules mononuclées. Nous avons déduits de cette étude que le traitement n'augmentait pas ni n'améliorait la réponse immunitaire spécifiques au VHC. Au contraire, il semble l'annuler, certainement pour laisser le temps à d'éventuels mécanismes indépendants des cellules de l'immunité adaptative de se mettre en fonctions. Nous avons également mis au point un système de culture de lymphocytes en présence de protéines virales permettant de mesurer l'impact direct de molécules sur la réponse spécifique au virus. Ce système a été utilisé sur des cellules de malades non traités, mises en présence d'IFN et de ribavirine à des doses proches des doses reçues in vivo lors du traitement par les cellules intrahépatiques. Dans ce cadre là, les techniques de PCR, de cytométrie en flux et d'elispot nous ont permis d'observer les modifications cellulaires induites par les molécules ajoutées. En étudiant les effets de l'interféron  et de la ribavirine sur les cellules T CD4+ et CD8+ et les cellules NK et TNK. Nous avons pu montrer que le traitement régulait négativement toutes les populations cellulaires testées à l'exception des cellules TNK, et ce seulement aux tout débuts de la culture. Enfin, nous avons étudié les lymphocytes T régulateurs (TReg) pour déterminer leur localisation et leurs rôles durant la maladie. Il s'est avéré que les TReg n'influençaient pas la charge virale, donc à priori n'inhibaient pas les cellules effectrices spécifiques du virus. En revanche, ils sont colocalisés dans les infiltrats hépatiques CD8+ et participent à la protection du foie des lésions en inhibant les cellules cytotoxiques par contact direct. Ceci ne dure néanmoins pas très longtemps puisqu'au-delà d'un certaine état de fibrose (>Metavir A2/F3), les TReg n'ont plus aucun contrôle sur les lésions hépatique, ce qui pourrait être l'une des causes de l'apparition de la cirrhose. Pour conclure, l'influence du virus sur l'immunité de son hôte est extrêmement complexe et fait intervenir un très grand nombre de facteurs. De notre étude, il en est ressorti que les cellules ayant le plus de potentiel dans le contrôle du virus, et donc devraient être prioritairement ciblées par les futures thérapies, sont les cellules NK CD3-CD56dimNKG2A+, corrélées négativement avec la charge virale, et les lymphocytes TNK, étant les seuls à répondre positivement à la thérapie par une sécrétion d'IFN. De plus, il serait nécessaire d'entretenir l'activité des cellules TReg intrahépatiques au-delà du stade A2/F3 pour empêcher la formation de lésions cirrhotiques menant au cancer du foie. Enfin, la mesure du taux d'expression de l'IFN avant traitement pourrait être un bon prédicateur de la réponse thérapeutique et ainsi permettre de mieux prendre en charge les malades.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

L’élongation épithéliale joue un rôle prépondérant au cours du développement. Ce processus morphogénétique peut être décrit schématiquement par trois paramètres : le signal permettant d’orienter l’élongation, la force capable de générer le mouvement et le comportement cellulaire associé. Le follicule ovarien de drosophile, initialement rond s’allonge au cours de son développement résultant en un œuf 2.5 fois plus long que large. J’ai mis en évidence que les follicules traversent au moins trois phases d’élongation successives et je me suis focalisé sur la phase précoce dont les paramètres étaient inconnus. J’ai déterminé que le signal venait d’un groupe de cellules situées aux pôles par la sécrétion du ligand de la voie Jak-Stat puis de l’activation consécutive de cette voie selon un gradient depuis les pôles. La force est apportée par un gradient de pulsations apicales des cellules dépendantes de la voie Jak-Stat générant des forces de traction aux extrémités des follicules. L’élongation est stabilisée par des intercalations cellulaires orientées selon l’axe d’élongation et par un gradient de constriction apicale des cellules. Ces données permettent de proposer un mécanisme où un gradient d’activité d’un facteur de transcription induit une élongation épithéliale indépendamment d’une polarité planaire. / Tissue elongation plays a key role during development. Schematically, this morphogenetic process can be described by three main parameters: the cue orienting the elongation, the movement generating force and the associated cellular behavior. The Drosophila ovarian follicle, initially spherical, elongates as it develops, ending as a 2.5 time longer than wide mature egg. I found that follicles elongate through at least three consecutive phases and I aimed to determine the parameters of the early phase. The signal comes from a cluster of cells located at each pole of the follicle secreting the Jak-Stat pathway ligand and the subsequent activation of the pathway as a gradient from the poles. A pulling force is generated by the Jak-Stat dependent apical pulsations of the cells following the same gradient. The elongation is stabilized by oriented cell intercalations along the elongation axis and a gradient of apical constriction. Our data allow proposing a mechanism where a gradient of transcription factor activity can lead to epithelial elongation without any planar polarity requirement.