Les calpaïnes sont des protéases à cystéine de type papaïne identifiées depuis plusieurs décennies. Parce que leur expression est cytosolique et parce que leur activité est contrôlée par la concentration de Ca2+, il est maintenant admis qu'elles jouent un rôle essentiel dans la signalisation intracellulaire. Elles participent ainsi au contrôle de l'apoptose, de la prolifération, de l'adhérence à la matrice extracellulaire et de la mobilité cellulaire. Il n'est donc pas étonnant qu'elles soient impliquées dans les pathologies lourdes (dystrophies musculaires, ischémies, dégénérescences neuronales, mobilité cellulaire invasive). L'objectif de nos recherches est d'élucider les mécanismes d'activation de différentes calpaïnes (Capn1,Capn2, Capn3) et les voies de signalisation qu'elles mettent en jeu. En effet, l'association de la calpaïne 3 avec la titine est un élément essentiel dans la régulation et l'activation de la protéase. Dans ce cadre, ce travail visait à caractériser les interactions moléculaires des calpaïnes 1 et 3 avec la région N1 de la titine humaine. Nous avons pu montré que cette région pouvait fixer très fortement du calcium permettant la polymérisation des molécules de titine. Cette structuration calcium dépendante conditionne la fixation de la µ-calpaïne sur le domaine I4 de la titine. La seconde partie du travail a permis de caractériser la colocalisation de la calpaïne 3 avec la calpaïne 1 au niveau du domaine I5. A l'inverse de la µ-calpaïne , l'association de la calpaïne 3 ne semble pas dépendre de la structure de la titine mais plutôt des changements structuraux pouvant intervenir sur la protéase elle-même quand elle fixe du calcium. A la lumière de ces résultats, la titine apparaît comme un régulateur de l'action calpainolytique

Neisseria meningitidis est une bactérie diderme qui colonise le nasopharynx humain de façon commensale. Occasionnellement, elle franchit la barrière nasopharyngée et accède à la circulation sanguine où elle peut provoquer un choc septique et/ou une méningite Le pouvoir pathogène de N. meningitidis est lié à sa capacité à interagir avec les cellules endothéliales humaines. Après avoir adhéré aux cellules grâce à des organelles filamenteux, les pili de type IV, les bactéries induisent une déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte sous la forme de protrusions riches en actine ressemblant à des filopodes. Ces protrusions permettent aux bactéries de résister aux forces de cisaillements générées par le flux sanguin et de proliférer à la surface des cellules. Contrairement à de nombreuses autres bactéries pathogènes, cette déformation de la membrane plasmique ne nécessite pas de polymérisation d’actine. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette déformation sont inconnus. Dans cette étude, nous montrons que lorsque des bactéries individuelles adhèrent à la cellule hôte, la membrane plasmique se déforme en adhérant le long des fibres de pili de type IV de façon similaire au mouillage d’un liquide sur un solide. Les pili de type IV agissent donc comme un échafaudage extracellulaire qui guide les protrusions de membrane plasmique indépendamment du cytosquelette d’actine. Nous montrons également que la capacité de la membrane plasmique à se déformer le long de structures adhésives nanométriques est une propriété intrinsèque des cellules endothéliales. Ces travaux décrivent le mécanisme d’une étape importante de la pathophysiologie de N. meningitidis et mettent en évidence des propriétés nouvelles de la membrane plasmique des cellules humaines qui pourraient être impliquées dans d’autres processus fondamentaux de biologie cellulaire. / Neisseria meningitidis is a diderm bacterium that is naturally found in the human nasopharynx as a commensal. Occasionally, it can cross the mucosa and reach the underlying blood vessels where it enters the circulation. Once in the bloodstream, it can cause severe septic shock and/or meningitis. The ability of N. meningitidis to cause disease is tightly linked to its ability to interact with human endothelial cells. In particular, upon bacterial adhesion via filamentous organelles called type IV pili, bacteria remodel the host cell plasma membrane in the form of actin-rich, filopodia-like protrusions. These protrusions allow bacteria to resist blood flow-generated shear stress and proliferate on top of the host cells. Unlike many other bacterial pathogens, plasma membrane remodeling induced by N. meningitidis does not require actin polymerization. Yet, the cellular and molecular mechanisms of this process are unknown. Here, we show that upon adhesion of individual bacteria, the host cell plasma membrane deforms by adhering along type IV pili fibers in a wetting-like fashion. Therefore, type IV pili act as an extracellular scaffold that guide plasma membrane protrusions in an F-actin-independent manner. We further show that the ability of the plasma membrane to deform along nanoscale adhesive structures is an intrinsic property of endothelial cells. Therefore, this study uncovers the mechanism of a key step of N. meningitidis pathophysiology and reveals novel properties of human cell plasma membrane that could be at play in other fundamental cellular processes.

Le récepteur de la progestérone (PR) est un facteur de transcription hormono-régulé qui joue un rôle crucial dans la coordination de tous les aspects de la fonction de reproduction chez la femme. Pour activer ses gènes cibles, PR recrute de façon dynamique, séquentielle et combinatoire différents partenaires moléculaires : les corégulateurs transcriptionnels. Les coactivateurs de la famille p160 (Steroid Receptor Coactivators : SRC-1, -2, -3), dont l’expression est augmentée dans certains cancers hormono-dépendants, sont les partenaires privilégiés de PR. Au cours de ce travail, nous avons étudié les mécanismes d’interaction entre le récepteur de la progestérone et ses corégulateurs ainsi que leurs conséquences fonctionnelles sur l’activité de PR. Nous avons ainsi pu mettre en évidence l’importance de la dégradation des complexes PR/SRC-1 par le protéasome sous l’effet du ligand agoniste de PR, et le caractère nécessaire de cette régulation négative pour l’activation de la transcription des gènes cibles de PR. Nous avons également identifié un candidat possiblement impliqué dans la dégradation des complexes PR/coactivateurs p160 : le corégulateur transcriptionnel Jab1. En effet, il a été décrit comme un coactivateur des complexes PR-SRC-1 au laboratoire, et nous avons pu observer que, hors du cadre de l’activation par l’hormone, Jab 1 régule les niveaux d’expression de SRC-1 et SRC-2. En revanche, ce corégulateur reste sans effet sur SRC-3. Enfin, nous avons mis au point les conditions expérimentales de l’étude de la dynamique des interactions entre PR et ses corégulateurs par la techninique de FRET.Les évidences croissantes de l’implication de PR et de ses cofacteurs (SRC-1, SRC-3, Jab1) dans le développement et les métastases des cancers du sein font de la compréhension de leurs mécanismes d’action un élément important dans la recherche de nouvelles thérapies. La détermination du rôle exact des corégulateurs de PR dans ces processus permettra une éventuelle redéfinition des cibles pharmacologiques dans le traitement de ces maladies, qui représentent un véritable enjeu de santé publique. / The progesterone receptor (PR) is a ligand-activated transcription factor playing a crucial role in female reproduction. To regulate gene expression, PR recruits several coregulators to target gene promoters, in a cyclic and combinatorial manner. Among these coregulators, PR recruits most notably members of the p160 family coactivators (Steroid Receptor Coactivators SRC-1, -2 and -3) which have recently been implicated in several hormono-dependent cancers.Here, we studied the mechanisms of interaction between PR and its coregulators as well as their functional consequences on PR transcriptional activity. We have demonstrated that PR activity is paradoxically coupled to the agonist ligand-dependent down-regulation of PR/SRC-1 complexes. Two degradation motifs found in SRC-1 were identified as signals involved in this proteasome- and ubiquitin-mediated process. We also identified a putative candidate implicated in the degradation of these complexes, namely the transcriptional coregulator Jab1. Indeed, Jab1 has previously been described in our laboratory as a coactivator of PR/SRC-1 complexes. We observed that it can specifically regulate SRC-1 and SRC-2 expression in absence of hormone. Finally, we optimized the experimental conditions of FRET experiments to get new insights on the dynamic interactions between PR and its coregulators. Collectively our findings are consistent with the emerging role of proteasome-mediated proteolysis in the gene-regulating process. Understanding PR mechanisms of action is an important step in the development of new therapies, due to growing evidences of PR and its coregulators implication in breast carcinogenesis and metastasis. Deciphering precisely the role of PR coregulators in these processes will permit to define new pharmacological targets for the treatment of these diseases, which represent a serious public health problem.

L'adhésion et la migration des cellules jouent un rôle important dans de nombreux mécanismes cellulaires qui vont de la morphogenèse à la prolifération tumorale en passant par la réparation des tissus. Il est maintenant bien établi que l'environnement physique et mécanique des cellules a une grande influence sur de nombreuses fonctions cellulaires comme l'adhésion et la migration ainsi que sur leur devenir et donc leur différentiation. Pour contrôler les propriétés de l'environnement cellulaire, nous avons choisi de combiner des méthodes de micro-fabrication issues de la microélectronique aux techniques de biologie cellulaire et moléculaire. Nous nous sommes notamment intéressés à l'influence de la rigidité du support sur la migration cellulaire et les forces mécaniques exercées par les cellules, des fibroblastes, sur la matrice. Pour cela, nous avons utilisé un substrat constitué de micro-piliers flexibles, qui ont servi de micro-capteurs de force. Nous avons montré que les cellules employées adaptent les forces qu'elles exercent sur leur support à la rigidité de ce dernier. Nous avons ensuite étudié l'influence de la topographie du substrat sur la migration cellulaire. Nous avons pour cela également utilisé des micro-piliers, mais dont le diamètre est 5 à 10 fois supérieur aux précédents. Les cellules, en migrant, rencontrent donc alternativement des surfaces lisses et rugueuses. Nous avons montré que dans ces environnements, les cellules adoptent un comportement s'approchant de celui observé dans un gel tridimensionnel et que le noyau joue un rôle dans cette migration. Enfin, nous avons abordé l'étude de l'étalement cellulaire dans ces environnements texturés.

Aujourd'hui la recherche en biologie dispose d'une masse d'informations génomiques considérable qu'il faut comprendre fonctionnellement pour faire émerger de nouveaux concepts, qui formeront le berceau de nouvelles thérapies. Ces études mettent en jeu des mécanismes contrôlés à l'échelle moléculaire et nécessitent le traitement d'informations à haut-débit et de manière parallèle. Les travaux pluridisciplinaires présentés ont permis de mettre au point une technologie miniaturisée de culture de cellules en gouttes matricées sur supports solides, pour tester l'action des molécules sur le comportement de cellules.<br />Après avoir mis au point un démonstrateur macroscopique validé par des transfections de molécules nucléiques, nous avons développé un protocole de fabrication de substrats miniaturisés capable de maintenir 100 nano-gouttes par cm² à l'aide d'un différentiel de tension de surface. Un robot de dispense de pico-gouttes a été intégré pour réaliser les gouttes de culture cellulaire de manière automatique. Le comportement des cellules au sein des gouttes est évalué par microscopie en fluorescence à haut-contenu après fixation. Chaque cellule de chaque goutte est caractérisée par des dizaines de paramètres de manière individuelle.<br />Cette nouvelle approche analytique a été appliquée dans le cadre d'un projet multipartenaire de criblage de siRNA visant à étudier l'impact de gènes sur la chimiorésistance de glioblastomes. Par ailleurs nous avons montré l'utilisation de la spectrométrie de masse comme méthode de phénotypage multiparamétrique. Cette technologie de puce à cellules est particulièrement adaptée à l'étude à haut-débit des comportements fins de cultures cellulaires.

Les Quantum Dots (QDs) sont des nanocristaux de semiconducteurs qui possèdent des propriétés optiques hors du commun. Leur utilisation comme sondes en biologie nécessite leur solubilisation dans l'eau, grâce à une chimie de surface adaptée, qui influence la taille finale du QD, ses propriétés optiques et son interaction avec l'environnement biologique. Nous avons développé un nouveau ligand, l'acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB), qui permet d'obtenir des QDs à la fois petits, stables dans une vaste gamme de pH, dans des solutions saturées en sel et dans le temps, et avec une très faible adsorption non spécifique sur les cellules. Nous avons observé et caractérisé le comportement intracellulaire des QDs DHLA-SB au cours du temps et nous l'avons comparé à celui de deux autres classes de QDs : cette étude a clairement montré l'influence de la chimie de surface sur le devenir intracellulaire des nanoparticules et a révélé une stabilité accrue des QDs DHLA-SB. Nous nous sommes également intéressés à la fonctionnalisation des QDs avec la streptavidine (SA) ou la biotine afin de marquer spécifiquement des cellules vivantes ou fixées. Les QDs-SA DHLA-SB obtenus ont permis de suivre un récepteur membranaire ou encore de marquer de façon spécifique une protéine biotinylée à l'intérieur de cellules vivantes, bien plus efficacement qu'avec les QDs-SA commerciaux (Invitrogen). Enfin, nous avons proposé d'utiliser les QDs DHLA-SB pour améliorer une technique de microscopie à illumination structurée, la microscopie HiLo bicouleur, et obtenir une coupe optique (type image confocale) d'échantillons biologiques épais en une seule image.

La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte inflammatoire et possédant des propriétés à la fois pro-inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu'elle induit l'apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l'expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d'autres protéines et dans plusieurs contextes la responsabilité de l'interaction galectine-9/TIM-3 n'a pas été formellement démontrée. Le développement d'un anticorps neutralisant les effets de la galectine-9 permettrait de préciser son rôle exact dans ces contextes. Par ailleurs, le blocage des voies de signalisations inhibitrices du système immunitaire est aujourd'hui un enjeu majeur en oncologie, comme le démontre le succès récent de la neutralisation du récepteur inhibiteur CTLA-4 pour le traitement des mélanomes. Nous avons produit de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine 9 par immunisation de souris avec la partie C-terminale de la protéine. Parmi ces anticorps, 1G3 permet la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d'une manière très sensible et spécifique en immunohistochimie. Son utilisation nous a permis de confirmer l'expression constante et intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé et la forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de l'hépatite C. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l'hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n'avait pas été démontré jusqu'à présent. Nous avons également caractérisé les capacités fonctionnelles de nos anticorps lors de tests in vitro. L'anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, neutralise l'apoptose induite par la galectine-9 sur cellules de lymphomes T humaines et réduit considérablement l'augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat. Ces effets de la galectine-9 sont indépendants de TIM-3 dans ce modèle cellulaire. L'anticorps 2E12 constitue un outil puissant pour étudier les fonctions de la galectine-9 à la fois dépendantes et indépendantes de TIM-3.

Les facteurs de transcription STAT3 sont des protéines cytoplasmiques qui induisent l'activation de gènes en réponse à une stimulation de facteurs de croissance ou de cytokines. A la suite d'une phosphorylation sur son résidu tyrosine 705, STAT3 se dimérise et est transloqué dans le noyau afin d'activer ses gènes cibles spécifiques impliqués dans la progression de la phase G1 vers la phase S du cycle cellulaire. Néanmoins, en absence de phosphorylation du résidu tyrosine 705, STAT3 est capable d'induire l'activation de ses gènes cibles, ces observations ont été corrélées avec la phosphorylation du résidu sérine 727 localisée dans le domaine de transactivation. Dans ce cas, il a été montré que les gènes cibles sont différents de ceux activés par STAT3 phosphorylé sur son résidu tyrosine. Ces résultats suggèrent que les modifications post-traductionnelles de STAT3 jouent un rôle important dans la spécificité de son activité transcriptionnelle. Nous avons observé que le facteur de transcription est phosphorylé sur son résidu sérine 727 en réponse à un traitement génotoxique par la kinase Cdk5. Dans ces conditions, cette voie Cdk5- STAT3 permet la diminution de l'expression de gènes impliqués dans la progression de la phase G1 du cycle cellulaire comme la cycline D1 et c-Myc afin de favoriser l'expression des gènes de réparation tel que Eme1. En parallèle, nous avons montré que STAT3 est également phosphorylé sur son résidu sérine 727 lors de la phase G2 et de la mitose. Cette phosphorylation, due à la kinase Cdk1, permet de réguler l'expression de gènes impliqués dans le déroulement des phases G2 et M du cycle cellulaire, tels que PLK1, STIL, RIC8A, FoxM1, NuMa, Cdc25C. Par ailleurs, grâce à une étude immunohistochimique, nous avons remarqué que STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 dès les stades précoces du cancer colorectal. L'ensemble de ces résultats suggère que la sérine 727 est un site de phosphorylation majeur dans le cancer colorectal. Cette phosphorylation lui permet d'activer deux voies distinctes : la réparation des dommages de l'ADN en réponse à un traitement génotoxique et la progression du cycle cellulaire de la phase G2 vers la mitose.

Le récepteur à l'IGF1 (IGF-1R) ainsi que ses voies de régulation sous-jacentes ont été largement étudié pour leur importance au cours du développement et leur rôle mitotique sur divers types cellulaires. A l'échelle de la peau, l'IGF-1R contribue à l'homéostasie épidermique et est souvent associé au compartiment basal pour son effet pro-prolifératif. Très peu d'études ont montré son implication au niveau de la différenciation épidermique et celles-ci présentent des résultats contradictoires. Au cours du vieillissement, la peau s'amincit et la barrière épidermique présente des défauts de perméabilité. Parallèlement, l'activité de l'IGF- 1R, maximale à l'adolescence, diminue avec l'âge. Cette étude a contribué à éclaircir le rôle de l'IGF-1R sur la différenciation épidermique et à montrer un lien entre vieillissement, perte en qualité de la peau et diminution d'activité de l'IGF-1R. L'élaboration de modèles 2D et 3D mimant le vieillissement par diminution d'activité de l'IGF-1R, nous a permis de confirmer le rôle mitotique de l'IGF-1R sur les kératinocytes et les progéniteurs et de démontrer son effet régulateur sur la différenciation épidermique par augmentation ou diminution de ces marqueurs. L'IGF-1R renforce l'adhésion cellulaire sur différentes matrices, impliquant de possibles interactions avec les intégrines α6 et β1. Ces résultats ont été corrélés aux observations de biopsies de peaux jeunes et âgées. Nous avons aussi montré que l'IGF-1R conférait un état sénescent aux cellules soumises à de fortes doses d'H2O2. Ces travaux montrent ainsi que l'IGF-1R est nécessaire pour le processus de différenciation épidermique et pour en assurer sa protection face au stress oxydant

Le développement d'une réponse innée est essentiel pour lutter contre les infections virales. Elle se traduit par la production de cytokines antivirales, parmi lesquelles les interférons-alpha (IFN-). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont les principales cellules productrices d'IFN-Nous avons démontré que les virus libres d'HTLV-1 induisaient une réponse innée se traduisant par une forte production d'IFN-. Les pDC non stimulées sont dans un état de quiescence avec des taux du ligand pro-apoptotique TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand) intracellulaire très élevés, rapidement mobilisés à la surface des pDC sous activation de la voie du Toll-like receptor 7. Les pDC acquièrent alors un phénotype de cellules tueuses, les IKpDC (Interferon producing killer pDC). C'est la première fois qu'une réponse innée induite par les particules libres d'HTLV-1 a été mise en évidence.Il a été montré que des taux sériques d'IFN- apparaissaient dans les phases tardives du SIDA, suggérant un rôle de l'IFN- dans la pathologie du VIH. La voie d'apoptose régulée par TRAIL/DR5 est impliquée dans la déplétion massive des LTCD4+ des patients infectés par le VIH. Les patients " HIV Controllers " (HIC) sont des patients infectés par le VIH mais qui contrôlent la charge virale et la mort de leurs LTCD4+. Nous avons alors étudié la voie IFN/TRAIL/DR5 chez ces patients. Notre analyse protéique et génomique de DR5 a révélé un défaut d'expression de DR5 à la surface des LTCD4+ des patients HIC par rapport aux patients virémiques. Le séquençage du gène DR5 a révélé l'existence d'une substitution homozygote dans l'exon 1 du gène des HIC. Cette substitution génomique a pour conséquence le changement d'un acide aminé dans la région leader de la protéine DR5 entrainant la séquestration intracellulaire de DR5. Cette mutation associée au profil des patients HIC pourrait expliquer le maintien du nombre de leurs LTCD4+, ainsi que la non-progression vers la phase SIDA.