La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate. / The relationship between obesity and cancer, although established by epidemiological studies, remains relatively unknown. However, about 25 % of cancers could be attributed to obesity. Among cancers that are affected by obesity, colon cancer, post-menopausal breast cancer and prostate cancer are the more frequent. Studies on animal models have suggested a positive association between high fat diets and de development of mammary and prostate cancer. We have studied the molecular mechanisms by which fatty acids influence breast and prostate cancer cells fate. This work has shown that unsaturated fatty acids, including oleate, can induce cellular proliferation while saturated fatty acids, including palmitate, reduce proliferation. An oleate treatment stimulates lipid droplets formation in the cytoplasm of breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145 while a palmitate treatment induces apoptosis. The action mechanism of oleate on proliferation was studied more closely. Using pharmacological inhibitors, we determine that oleate-induced cell proliferation involves PI3K/Akt signaling pathway, ERK1/2 signaling pathway and the activation of one or many G protein coupled receptor(s) (GPCR). Oleate induces rapid Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145. In the last few years, two GPCRs were identified as being activated by medium and long chain fatty acids, GPR40 and GPR120. GPR40 being expressed in many breast and prostate cancer cell lines while GPR120 expression was null in most cell lines tested, we studied the role of GPR40 in oleate-induced proliferation. Human epithelial mammary cells in primary culture did not express GPR40 nor GPR120 and failed to respond to oleate-induced cell proliferation or activation of signaling pathways. Akt and ERK1/2 signaling pathways activation by oleate in MDA-MB-231 and DU145 cells is potentiated by GPR40 over-expression and inhibited by the use of an siRNA directed against that receptor. However, oleate-induced cell proliferation does not seem to be affected by the presence of the siRNA directed against GPR40. Oleate being a fatty acid, it can enter cells freely by crossing the plasma membrane and part of its effects on proliferation could be attributed to its metabolism. A GPR40 agonist, GW9508, is able to activate GPR40 without entering the cells nor activating oleate’s metabolism. GW9508 stimulates Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145, but does not induce cell proliferation as does oleate. These results help us to understand the action mechanism of oleate in breast and prostate cancer cells. Oleate induces GPR40 signalization which is involved in the rapid Akt and ERK1/2 signaling pathways activation. On the other hand, oleate-induced cell proliferation is carried out by a GPR40-independent mechanism, possibly linked to oleate’s metabolism.

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / The eukaryotic translation initation factor eIF4E (4E) is a potent oncogene due to its ability to facilitate export and/or translation of certain transcripts, many of which are, themselves, oncogenes. 4E has many protein-binding partners including the 4E transporter protein (4ET). The ability to alter the subcellular localization of 4E via 4E-T could offer a mechanism by which to alter the oncogenic potential of a cell. Overexpression of 4E-T in osteosarcoma cells leads to formation of larger and more numerous P-bodies that can effectively colocalize with 4E than either a vector control (E) or a less efficient 4E-binding version of 4E-T (Y30A). However, the overexpression of 4E-T did not affect the 4E’s function as determined by examining global levels of transcription, polysome profile, cytoplasmic/nuclear distribution, or protein levels of most of the transcripts tested. The observation that there was cytoplasmic enrichment and reduced loading of ribosomes on cyclin D1 and ODC transcripts (polysome profile) in the 4ET line suggests a possible 4ETmediated cytoplasmic sequestration of certain transcripts by an as yet to be determined mechanism.

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.

La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hôte. La signalisation par le TcR est essentielle à la sélection positive pour générer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dépendant de l’activité de la Src kinase Lck et de son habileté à lier la queue cytoplasmique des corécepteurs CD4 et CD8. Nous avons précédemment trouvé que l’expression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une sévère déplétion des thymocytes et une baisse d’expression du corécepteur CD4 à la membrane. Nous avons également montré que Nef bloque la génération des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus d’altérer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phénotype est récupérable par plusieurs approches dont le croisement d’une souris transgéniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les résultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altérée par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la génération des cellules CD4+ dans le thymus demeurent très imprécis. Dans cette étude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouvé que les thymocytes transgéniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgré cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable d’atteindre la membrane plasmique. Cette fraction était significativement accumulée dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgéniques exprimant Nef. Également, en utilisant la technique d’essai kinase in vitro, nous avons trouvé que l’activité kinase de Lck est significativement augmentée dans les thymocytes transgéniques mais demeure stable suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4. Également, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgéniques était résistante à la dégradation suite à une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal régulateur négatif de Lck, nous avons montré que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgré son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer l’échec de la dégradation de Lck. En plus, nous avons trouvé que suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminuée, résultant d’une importante baisse de l’activité kinase de Zap-70 et d’un bloc des premiers évènements de la voie de signalisation par le TcR. Ces données indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la présence de Nef. / HIV-1 Nef protein plays an essential role in the HIV-1 pathogenesis by modulating the host signaling transduction pathways. TcR signalling is important for the thymic selection process to CD4 and CD8 single positive T cells and is greatly dependent on the activity of Src kinase Lck and its ability to bind to CD4 and CD8 cytoplasmic tail. We previously found that expression of HIV or SIV Nef can induce severe thymocytes depletion and downregulation of CD4 expression in Nef+ mice. We also recently showed that Nef blocks generation of double positive thymocytes and impairs DP to CD4+ SP T cells transition. The reversal of this phenotype was accomplished by several approaches, among them by crossing Nef+ mice with mice expressing constitutively active Lck Y505F. These results imply that the maturation of CD4+ T cells is disrupted due to impairment of Lck-mediated CD4 receptor signaling. However, the molecular mechanisms by which Nef contributes to the impairment in thymic CD4 generation remains largely unclear. In this study, using confocal microscopy and biochemical approaches, we found that Nef+ thymocytes express more Lck than the Nef- control. Despite of this increase, a significant portion of Lck molecules were unable to reach to the plasma membrane. It was significantly accumulated in the intracellular endosomal compartment of the Nef+ thymocytes. Moreover, using IVKA we found that the activity of Lck is significantly increased in Nef+ thymocytes but was not further increased upon stimulation by α-CD3ε, α-CD4 or α-CD3ε + α-CD4. Moreover, compared to Nef- controls, Lck kinase in Nef+ thymocytes was resistant to degradation upon stimulation. Examining the status of c-Cbl, the main negative regulator of Lck, showed that c-Cbl localized with Lck poorly, despite his constitutive hyperphosphorylation. This explains the failure of Lck degradation. In addition, we found that upon stimulation, Zap-70 phosphorylation at tyrosine 493 by Lck is decreased, resulting by a decrease of Zap-70 kinase activity and TcR proximal event block. These data indicate that CD4-Lck signaling was interrupted by the presence of Nef.

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire. / Endothelial cell permeability is a crucial step of angiogenesis. The main actors behind permeability are endothelial cells who accomplish this in response to permeabilizing factors, most notably Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). In a pathological context, migrating tumor cells produce great quantities of VEGF that stimulate an increase of vascular permeability, which allows them to intravasate into the vasculature. Src has been shown to mediate this process. Our laboratory has previously shown that the protein tyrosine phosphatase DEP-1 is involved in the regulation of VEGF-dependant activation of Src. These data thus suggested that DEP-1 might play a role in endothelial cell permeability. Here, we show through siRNA experiments that DEP-1 is important for the regulatory phosphorylation of VE-Cadherin which is critical for the induction of permeability. The impact of DEP-1 on intercellular junction dissociation is also demonstrated through immunofluorescence microscopy of endothelial cells. We further show that DEP-1 is absolutely required for the VEGF-dependent increase of permeability as illustrated by in vitro permeability assay on siRNA-transfected endothelial cells. Finally, we show that tyrosine residues in DEP-1’s carboxy-terminal tail, which are crucial for mediating Src activity in response to VEGF, are implicated in VEGF-dependant increase in permeability by transfecting plasmids coding for DEP-1 mutants of these tyrosine residues. These findings shed light on a novel potential key regulator of in vivo permeability.

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant. / Background: Although mitochondrial dysfunction and oxidative stress are key mechanisms in various pathological conditions, they have not been extensively studied in the gastrointestinal tract, which is known to be constantly exposed to luminal oxidants from ingested foods and pathogens. Key among these is the simultaneous ingestion of iron salts and ascorbic acid, which can cause oxidative damage to macromolecules. The protein ‘’Nuclear factorerythroid 2- related factor’’ (Nrf2) is an important redox-sensitive transcription factor, which protects against oxidative stress by inducing antioxidant and detoxifying genes through binding with antioxidant response element (ARE). Many of Nrf2 antioxidant protective and anti-inflammatory functions have been established in various cells and tissues. However, limited information is available on its role in the gastrointestinal tract. Objectives: The objectives are to evaluate how iron-ascorbate (FE/ASC)-mediated lipid peroxidation affects mitochondrion functioning in Caco-2/15 cells, and to mechanistically determine the role of Nrf2. Methods: Caco2/15 cells were treated with 0.2mm/2mm of FE/ASC to induce oxidative stress. To increase Nrf2 expression, cultured Caco2/15 cells were pre-treated with 50 μM Olitpraz (OPZ). To down regulate the Nrf2 function, Nrf2 gene was knocked down by transfecting Caco-2/15 cells with a pGFP-RS lentiviral vector containing shRNA against Nrf2. 4 RESULTS: Our results show that the treatment of Caco-2/15 cells with FE/ASC (0.2 mm/2 mm): increased the levels of malondialdehyde (MDA), a marker of oxidative stress; reduced ATP production; raised mitochondrial calcium content; regulated the protein expression of cytochrome C and apoptotic inducing factor (AIF); decreased mitochondrial respiratory chain complexes I, II, III and IV activity; prevented mtDNA damage as illustrated by the raised levels of 8-OHdG; lowered DNA Glycosylase, and altered the gene expression and protein mass of mitochondrial transcription factors (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Furthermore, our observations indicate that the induction and activation of Nrf2 in Caco2/15 cells resulted in an augmentated endogenous antioxidants enzymes (catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase), a reduction of nuclear factor-kappaB (NFκβ) and Tumor Necrosis Factor- Alpha (TNF-α), an increase in the ATP production, mitochondrial respiratory complexes (I, II, III, VI), PGC1α , and a regulation of the mitochondrial Prohibitin, anti-apoptotic Bcl-2 protein, and Occludin level. CONCLUSION: Findings indicate that acute exposure of Caco-2/15 cells to FE/ASC-catalyzed peroxidation produces pathological effects on mitochondrial functions and DNA integrity, which were diminished by Nrf2 induction. It appears that Nrf2 plays a critical cytoprotective role in intestinal epithelial cells against oxidative stress.

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients. / The adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common deformity in paediatric orthopaedics. It is a disease that generates complex deformations of the spine, thorax and pelvis and severely affecting mainly girls at puberty. Despite many years extensive research into the field of AIS, the cause of this disorder has still not been resolved. OBJECTIFS: We have demonstrated a differential melatonin signaling dysfunction through G inhibitory (Gi) proteins in osteoblasts isolated from AIS patients. This led to a stratification of AIS patients into three distinct functional groups. The goal of this project is to establish molecular expression profiles corresponding to each functional group. The specific objective is to identify genes responsible for the initiation of the AIS and the differential dysfunction in the signaling of Gi protein-coupled receptors. METHODES: Osteoblasts isolated from AIS patients of each functional subgroup were selected and compared to osteoblasts obtained from healthy controls. In addition, blood cells (PBMCs) isolated from a pair of monozygotic discordant twins of scoliosis was studied to compare their gene expression profiles. We used DNA chips with 54,000 probe sets that allow analysis of expression level of over 47,000 transcripts and variants from over 30,000 well-characterized human genes (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). The identified genes were subsequently validated by qPCR in a larger number of patients in order to test the specificity of expression profiles for each group of patients using bone cells derived during surgery. RESULTS: The molecular profiling will establish the molecular basis of AIS according to the functional test developed by Moreau et al., and identify new genes associate with AIS. This project may allow us to identify genes involved in the dysfunction of Gi protein signaling which present in all three groups of patients. Also genes associated specifically with a particular group, can contribute to the development of certain AIS co-morbidities and/or to a risk of aggravation of spine deformities. The preliminary study of monozygotic discordant twins of scoliosis revealed a limited number of genes potentially associated with the signaling defect observed in the scoliotic twin, the gene expression could be influenced by epigenetic changes related to the environment. CONCLUSION: The data obtained by transcriptomic approaches further support our functional method of AIS patients’ stratification, also allowed the identification of novel genes associated with AIS. Such results would provide us a better understanding of the mechanisms and factors involved in the etiology of AIS. In this regard, our results would help to identify potential and specific therapeutic targets and personalized treatments based on the distinct molecular profiles observed in each patient group.

Tout au long de la vie d’un individu, il existe un nombre optimal de cellules à produire et de progéniteurs à conserver en réserve. On parle de maintien de l’homéostasie tissulaire. De façon générale, l’organisme a cinq possibilités pour réguler l’homéostasie : l’autorenouvellement et la quiescence, souvent utilisés pour maintenir un ‘pool’ fonctionnel de progéniteurs, la différenciation qui permet de produire des cellules effectrices, l’apoptose et la sénescence, qui permettent de limiter la production de cellules ou encore d’en faire diminuer le nombre quand elles sont en excès. La régulation de ces quatre mécanismes peut se faire de façon extrinsèque en passant par différentes voies de signalisation combinées à l’action intrinsèque de facteurs de transcription comme Ikaros et GATA1. Le facteur de transcription Ikaros joue un rôle critique dans le devenir des cellules progénitrices et la différenciation des lignages hématopoïétiques. Cependant, il demeure surtout connu pour son influence sur la voie Notch dans les cellules lymphoïdes, notamment les lymphocytes T. Les cellules érythroïdes sont hautement sensibles à l’environnement et donc, particulièrement adaptées à l’étude des régulations de l’homéostasie. Les résultats de différentes études ont permis de démontrer qu’Ikaros et la voie Notch influencent l’érythropoïèse. Cependant le détail de leurs actions demeure en grande partie inconnu à ce jour. Au cours de notre étude nous avons voulu déterminer l’action d’Ikaros dans le maintien de l’homéostasie des cellules érythroïdes et si son rôle passe par un dialogue avec la voie Notch. Nous avons voulu décrypter les mécanismes de régulation transcriptionnelle utilisés par Ikaros et par Notch au cours de l’érythropoïèse et leurs effets. Notre étude montre qu’Ikaros réprime à l’aide de GATA1 le gène Hes1, une cible importante de la voie Notch, en recrutant un complexe de la famille Polycomb, le PRC2 ii (Polycomb Repressive Complex 2). Cette répression permet la promotion de la différenciation des cellules érythroïdes. Au niveau du maintien de l’homéostasie par régulation de l’apoptose, Ikaros est connu pour cibler l’anti-apoptotique Bcl2l1 dans les lymphocytes. Puisque Gata-1, partenaire préférentiel d’Ikaros cible Bcl2l1 dans les cellules érythroïdes, nous avons caractérisé leur effet sur l’expression de Bcl2l1. Nous avons découvert qu’Ikaros active de façon directe Bcl2l1 et qu’il recrute sur le gène deux complexes partenaires d’élongation : un de la famille SET1/MLL, et le complexe P-TEFb-NuRD. En l’absence d’Ikaros, le fragment intracellulaire de Notch (NICD) et son cofacteur RBP-J remplacent Ikaros et favorisent l’hyper-activation de l’expression de Bcl2l1. Ceci est associé à la modification du complexe d’élongation recruté, ainsi qu’à la mise en place de modifications épigénétiques distinctes de celles observées avec Ikaros ce qui modifie l’élongation transcriptionnelle du gène. Ikaros et Notch sont fréquemment mutés ou présentent des fonctions altérées dans les leucémies. Notre étude montre un dialogue Ikaros/Notch influençant aussi bien la différenciation que l’apoptose et met en évidence l’existence d’un circuit génétique dont le dérèglement pourrait favoriser l’apparition d’une hématopoïèse maligne. / Throughout the life of an individual, there is an optimal count of cells to produce and progenitors to conserve in stock. This is the tissue homeostasis maintenance. In a general fashion the organism has five means to regulate the homeostasis. Self-renewal and quiescence, often used in order to maintain a functional progenitors pool. Differentiation enhances effector cells production. Apoptosis and senescence can limit cell production and reduce cell number in case of excess. These regulation mechanisms can be performed in an extrinsic fashion using different signaling pathways combined with the action of transcription factors like Ikaros and GATA1. The transcription factor Ikaros is critical for progenitor cells fate and hematopoietic lineages differentiation. However, Ikaros is mostly known for its influence on Notch signaling in lymphoid cells, notably T lymphocytes. Erythroid cells are highly sensitive to the environment thus, particularly adapted to study homeostasis maintenance regulation. Results obtained in different studies showed Ikaros and Notch signaling influencing erythropoiesis. However, the detail of their effect remains mainly unknown to day. Our aim was to determine Ikaros effect on erythroid cells homeostasis maintenance and if its role involved a cross-talk with Notch signaling. We will decipher transcription regulation mechanisms used by Ikaros and Notch during erythropoiesis and their effects. We show Ikaros uses GATA1 to repress Hes1, a major Notch target by recruiting a Polycomb family complex, the PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2). This repression promotes erythroid cells differentiation. At the apoptosis mediated control of homeostasis level, Ikaros is known to target Bcl2l1 in lymphocytes. As GATA1, Ikaros preferential partner, targets Bcl2l1 in erythroid cells, we assessed their effect on Bcl2l1 expression. We discovered Ikaros directly activates Bcl2l1 iv and recruits two elongation associated complexes: one from SET1/MLL complex family, and the P-TEFb-NuRD complex. In the absence of Ikaros, the intracellular fragment of Notch (NICD) and its cofactor RBP-J replace Ikaros and favors Bcl2l1 overactivation. This is associated with a switch of recruited elongation associated complex and the establishment of distinct epigenetic modifications from those observed with Ikaros, which modifies the gene transcriptional elongation. Ikaros and Notch are frequently mutated or present altered functions in leukemia. Our works present an Ikaros/Notch cross-talk influencing as well differentiation as apoptosis and reveal the existence of a genetic circuit for which a malfunction could favor hematologic disorders. Keywords : transcription, homeostasis, erythropoiesis

La pourriture grise causée par Botrytis cinerea est l'une des principales maladies de la vigne. La principale solution pour faire face à cette maladie est l'utilisation de produits chimiques, mais la lutte chimique cause des dommages environnementaux et conduit au développement de souches de B. cinerea résistantes. Une stratégie alternative consiste à stimuler les mécanismes de défense naturelle de la vigne. Cependant, B. cinerea est connu pour contourner les défenses de la plante (El Oirdi et Bouarab, 2011) et à ce jour aucun éliciteur n'a montré d'effet protecteur probant contre B. cinerea. De plus, les résultats prometteurs observés au laboratoire se révèlent souvent décevants au vignoble et à ce jour aucun produit stimulateur de défense ne confère à la vigne une protection acceptable contre la pourriture grise. Pour développer des éliciteurs efficaces contre la pourriture grise, il s'avère donc essentiel de caractériser des marqueurs de protection qui permettraient de distinguer stimulation des défenses et protection efficace de la vigne contre B. cinerea. Pour ce faire des analyses comparatives ont été réalisées par 2D-PAGE afin de comparer au niveau protéique l'effet d'éliciteurs induisant une protection et l'effet d'éliciteur n'induisant pas une protection. Les recherches se sont concentrées sur l'apoplaste, qui est un réseau continu dans les plantes créant une interface avec l'environnement. Après la cuticule, l'apoplaste est ainsi la première barrière contre les attaques d'agents pathogènes (Agrawal et al., 2010). Afin d'obtenir un aperçu du protéome constitutif de l'apoplaste (secrétome), une méthode d'infiltration-centrifugation a été optimisée afin de recueillir le fluide apoplastique à partir de feuilles de vigne. Les profils protéiques apoplastiques ont ensuite été comparés aux profils protéiques de feuilles entières par 2D-PAGE et les protéines identifiées par spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d'établir une carte protéique des feuilles entières et du secrétome de la vigne. A notre connaissance, cette étude fournit la première carte protéique du secrétome de la vigne. Cette étude nous donne ainsi un aperçu des protéines les plus abondantes de l'apoplaste de feuilles de vigne. Une prédiction de la fonction des protéines nous a permis de conclure que l'apoplaste de vigne contient principalement (i) des protéines liées aux stress, (ii) des protéines impliquées dans le métabolisme de la paroi cellulaire et (iii) des protéases. Pour confirmer la qualité des extractions, l'analyse prédictionnelle de la sécrétion des protéines a révélé une forte proportion de protéines secrétées de manière classique et non classique (Leaderless Secreted Proteins, LSP). Cette approche offre un grand nombre de protéines candidates impliquées dans les diverses fonctions physiologiques de l'apoplaste. (…)Parallèlement cette étude présente les travaux préliminaires entrepris, également par 2D-PAGE, pour (i) mettre en évidence des marqueurs de potentialisation chez la vigne, (ii) mettre en évidence les bouleversements, au niveau protéique, causés par une infection de B. cinerea sur la vigne et (iii) comprendre comment un traitement avec un éliciteur protecteur pourrait limiter ces effets néfastes. La validation de ces marqueurs par différentes approches permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes de défense des plantes et le développement d'outils pour le criblage de nouveaux éliciteurs candidats pour leurs effets protecteurs contre la pourriture grise et pour le suivi des défenses de la vigne directement au vignoble. / Grey mould caused by Botrytis cinerea infection is one of the main diseases affecting grapevine. The main solution to cope with this disease is the use of chemicals, but chemical control cause environmental damages and lead to the development of B. cinerea resistant strains. An alternative strategy to prevent diseases consists in stimulating plant defense mechanisms. Nevertheless B. cinerea is known to manipulate plant defenses (El Oirdi and Bouarab, 2011) and to date no elicitors have shown expected protective effect against B. cinerea even if they stimulate defense markers. Moreover despite that numerous studies showed an excellent efficacy of elicitors in laboratory conditions, in vineyard the obtained results are often disappointing.Thus it is necessary to distinguished elicitors inducing protection (protective elicitor) from elicitors inducing defense but no protection (non protective elicitors). For that it appears crucial to characterize markers which would enable to discriminate grapevine defense stimulation from effective protection against B. cinerea. To reach this goal, comparative analyses were performed by 2D-PAGE in order to compare the effect of protective elicitors from non protective elicitors against B. cinerea on grapevine apoplastic fluids. Those biomarkers could be defined as protection biomarkers.Researches were focused on the apoplast, which is a continuous network in plants and creates an interface with the environment. After the cuticle, apoplast is the first barrier against pathogen attacks (Agrawal et al., 2010). In order to obtain an overview of the constitutive apoplastic proteome (secretome), a vacuum-infiltration-centrifugation method was optimized to collect the apoplastic fluid from grapevine leaves. Apoplastic protein profiles were compared to whole-leaf protein profiles by 2D-PAGE and protein identifications were performed by tandem mass spectrometry. This approach allowed us to establish a well-defined proteomic map of whole-leaf and apoplastic leaf. To our knowledge, it is the first time that the apoplastic fluid is recovered from grapevine to characterize its protein content. This study provides a comprehensive overview of the most abundant proteins present in grapevine apoplast. Protein function prediction allowed us to conclude that the grapevine apoplast mainly contains a high proportion of (i) stress-related proteins, (ii) proteins involved in cell wall metabolism, (iii) proteases. To confirm quality of extractions, proteins secretion prediction tools revealed a high proportion of classical and non-classical secreted proteins namely Leaderless Secreted Proteins (LSP). This approach provides thus a large number of candidate proteins involved in physiological functions of the apoplast under various stresses.Differential analyses let us to highlight 7 putative markers, namely an aspartyl protease, a β-1,3 glucanase, an isoflavone reductase for induced markers and an another aspartyl protease, an another β-1,3 glucanase, a germin-like protein and a serine pyruvate amino transferase for repressed markers. This proteins could act in a concert manner to (i) regulate reactive oxygen species homeostasy and dercease programmed cell death, (ii) counteract B. cinerea virulence factors, (iii) increase plant cell wall stiffening, (iv) cause fungal membrane leakage and (v) participate in the induction of systemic defence responses.In addition, this study provides preliminary research performed to highlight (i) priming biomarkers in grapevine, (ii) damages caused by B. cinerea infection on grapevine proteome and (iii) how a protective elicitor treatment could limit those damages.Further functional analyses of these proteins will improve the understanding of plant defense mechanisms and tools development for large scale screening of new elicitors regarding their protective effects against grey mould disease and for following grapevine defenses in vineyard.

Les Ecdysozoaires sont des organismes caractérisés par une croissance discontinue composée de plusieurs stades morphologiques séparés par des mues. Parmi eux, certains groupes présentent un intérêt épidémiologique important en santé humaine et/ou animale, notamment les nématodes parasites gastro-intestinaux des ruminants et les phlébotomes vecteurs de leishmanies, qui font l’objet de ce travail. L’étude de la systématique de tels organismes constitue un élément de base essentiel à toute recherche appliquée à la biodiversité, l’écologie et la physiologie, ainsi qu’à leurs relations avec les autres acteurs de leur cycle biologique. Pourtant, l’identification morphologique de certaines espèces s’avère délicate voire impossible étant donnés les stades de croissance, le dimorphisme sexuel et l’existence de morphes, de complexes d’espèces, d’espèces jumelles et d’hybrides, ne concordant pas toujours avec la définition biologique de l’espèce. L’essor de la biologie moléculaire offre un panel d’outils performants au service de la systématique par l’étude de la variabilité génétique. L’objectif de la thèse est de répondre à des problématiques rencontrées en systématique (phylogénie, taxonomie, histoire évolutive d’une espèce) en étudiant la variabilité génétique de ces organismes, à l’aide d’outils moléculaires appropriés. Ce travail a permis la résolution de cas d’études concrets tels que l’inférence d’une phylogénie, l’identification d’espèces proches et l’étude de la variabilité génétique intraspécifique, pour suivre les flux de gènes et en déduire la structure génétique de populations, afin de mieux appréhender l’espèce, son histoire et son évolution dans son environnement. / Ecdysozoans are organisms characterized by discontinuous growth composed of several morphological stages separated by moults. Among them, some groups have a significant epidemiological interest in human and/or animal health, including the gastrointestinal nematodes, parasites of ruminants and phlebotomine sandflies, vectors of Leishmania, which which we focus on. The study of the systematics of such organisms is an essential basic element of any research applied to biodiversity, ecology and physiology, as well as to their relationships with other actors in their life cycle. However, the morphological identification of some species is difficult or even impossible given the stages of growth, sexual dimorphism and the existence of morphs, species complexes, sibling species and hybrids, not concordant always with the biological definition of the species. The rise of molecular biology offers a range of powerful tools for systematics by studying genetic variability. The aim of the thesis is to answer the problems encountered in systematics (phylogeny, taxonomy, evolutionary history of a species) by studying the genetic variability of these organisms, using appropriate molecular tools. This work allowed the resolution of concrete case studies such as the inference of a phylogeny, the identification of closely related species and the study of intraspecific genetic variability, to follow gene flow and deduce the structure population genetics, to better understand the species, its history and its evolution in its environment.