Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Ribosomes are cellular nanomachines responsible for protein production in all living cells. When ribosome biogenesis is compromised, or ribosome function unfaithful, it causes diseases called ribosomopathies. The primary goal of my PhD was to understand the consequences of ribosome biogenesis dysfunction on translation. I have contributed to this understanding through four different projects which were aimed to understand how ribosome function affects the different steps of protein translation in the cell. In my first project, we tested if a ribosomal RNA sugar methylation present on the large ribosomal subunit plays a role in translation. We found that the loss of the modification does not grossly inhibit ribosome production or growth. However, these mutants are resistance towards G418, and make fewer decoding errors as compared to the control cells. In my second project, I studied a methyltransferase called Mtq2, which methylates the translation termination release factor eRF1. We found that Mtq2 is directly involved in late steps of large ribosomal subunit maturation and that the catalytic activity of Mtq2 is required for efficient 60S subunit production and for pre-60S export. In project 3, I studied a natural, plant-derived alkaloid called haemanthamine (HAE). We showed that HAE binds the peptidyl transferase center of the large subunit of the eukaryotic ribosome, where it interacts with the 25S rRNA. We also showed that HAE inhibit early stages of pre-rRNA processing and elicit nucleolar stress response in the cells. In project 4, I studied a long non-coding RNA called SAMMSON. SAMMSON plays a crucial role in melanoma survival. We found that depletion of SAMMSON adversely affects ribosome biogenesis. We also demonstrated that by modulating the binding affinity of a single protein, namely CARF, SAMMSON rewires the RNA-protein network and promotes a synchronized increase in rRNA maturation both in the cytosol and mitochondria, thereby boosting translation in both the cellular compartments. / Les ribosomes sont des nanomachines cellulaires responsables de la production de protéines dans toutes les cellules vivantes. Lorsque la biogenèse des ribosomes est compromise ou que la fonction des ribosomes est infidèle, elle provoque des maladies appelées ribosomopathies. L'objectif principal de ma thèse était de comprendre les conséquences du dysfonctionnement de la biogenèse des ribosomes sur la traduction. J'ai contribué à cette compréhension par le biais de quatre projets différents visant à comprendre comment la fonction des ribosomes affecte les différentes étapes de la traduction des protéines dans la cellule. Dans mon premier projet, nous avons voulu determiner si une méthylation sur l’ARN ribosomique d’un sucre présente sur la grande sous-unité ribosomique joue un rôle dans la traduction. Nous avons constaté que la perte de cette modification n'inhibait pas grossièrement la production ou la croissance des ribosomes. Cependant, ces mutants sont résistants à G418 et font moins d’erreurs de décodage par rapport aux cellules contrôles. Dans mon deuxième projet, j'ai étudié une méthyltransférase appelée Mtq2, qui méthyle le facteur de libération de la terminaison de la traduction, eRF1. Nous avons constaté que Mtq2 est directement impliqué dans les dernières étapes de la maturation des grandes sous-unités ribosomiques et que l'activité catalytique de Mtq2 est nécessaire pour une production efficace de sous-unités 60S et pour une exportation antérieure à 60S. Dans le cadre du projet 3, j'ai étudié un alcaloïde naturel d'origine végétale appelé hémanthamine (HAE). Nous avons montré que HAE lie le centre de la peptidyl transférase de la grande sous-unité du ribosome eucaryote, où il interagit avec l'ARNr 25S. Nous avons également montré que HAE inhibe les stades précoces du traitement pré-ARNr et induit une réponse au stress nucléolaire dans les cellules. Dans le projet 4, j'ai étudié un long ARN non codant appelé SAMMSON. SAMMSON joue un rôle crucial dans la survie du mélanome. Nous avons constaté que sa perte d’expression affecte négativement la biogenèse des ribosomes. Nous avons également démontré qu'en modulant l'affinité de liaison d'une protéine unique, à savoir CARF, SAMMSON réarme le réseau ARN-protéine et favorise une augmentation synchronisée de la maturation de l'ARNr à la fois dans le cytosol et les mitochondries, renforçant ainsi la traduction dans les deux compartiments cellulaires. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Trois types d'eau du fjord Saguenay ont été échantillonnés: de l'eau douce de la rivière Saguenay au niveau de Chicoutimi et de l'eau saumâtre et marine du fjord au niveau de Ste-Rose-du-Nord. Après filtration sur filtre Millipore, 0.45 um, les échantillons ont été élues séquentiellement sur trois ou quatre colonnes chromatographiques contenant du gel Séphadex G-10, G-15, G-25, et G-50. La distribution de la matière organique dissoute en fonction du poids moléculaire nominal a ainsi été obtenue pour ces types d'eau. En général, la limite supérieure du poids moléculaire nominal de ces distributions se situe autour de 5000. L'analyse des données chromatographiques semble démontrer l'agglomération possible de la matière organique dissoute provenant des eaux douces, lorsque ces eaux entrent en contact avec les eaux marines du fjord. Dans le cas des eaux saumâtres et marines, la présence de sel marin et de bicarbonate invalide le dosage de la matière organique.

Trois types d'eau du fjord Saguenay ont été échantillonnés: de l'eau douce de la rivière Saguenay au niveau de Chicoutimi et de l'eau saumâtre et marine du fjord au niveau de Ste-Rose-du-Nord. Après filtration sur filtre Millipore, 0.45 um, les échantillons ont été élues séquentiellement sur trois ou quatre colonnes chromatographiques contenant du gel Séphadex G-10, G-15, G-25, et G-50. La distribution de la matière organique dissoute en fonction du poids moléculaire nominal a ainsi été obtenue pour ces types d'eau. En général, la limite supérieure du poids moléculaire nominal de ces distributions se situe autour de 5000. L'analyse des données chromatographiques semble démontrer l'agglomération possible de la matière organique dissoute provenant des eaux douces, lorsque ces eaux entrent en contact avec les eaux marines du fjord. Dans le cas des eaux saumâtres et marines, la présence de sel marin et de bicarbonate invalide le dosage de la matière organique.

HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l'endocytose médiée par la clathrine, l'apoptose et la mitose. Elle induit l'assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l'actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l'ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d'HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu'HIP1R participe principalement à l'internalisation des plaques de clathrine et qu'HIP1R n'induit pas l'activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d'HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'apoptose est un processus de mort cellulaire contrôlé génétiquement qui joue un rôle fondamental dans la maintenance de l'homéostasie cellulaire. Des deregulations de l'apoptose sont impliquées dans la tumorigénèse et la progression des cellules tumorales. Dans le traitement des cancers, la plupart des drogues utilisées en chimiothérapie induisent la mort des cellules tumorales par apoptose. Par conséquent, les gènes impliqués dans le contrôle de l'apoptose peuvent déterminer la réponse et la sensibilité des cellules tumorales aux drogues utilisées en chimiothérapie. Un contrôle défectif de l'apoptose représente une nouvelle forme de résistance aux traitements. Les gènes de la famille des ced9/egl-l/bcl jouent un rôle déterminant dans la phase d'engagement de l'apoptose. Parmi les produits de ces gènes, certains uihibent et d'autres stimulent l'apoptose et de nombreux travaux suggèrent que le niveau d'expression des protéines Ced-9/Egl-l/Bcl modulent la sensibilité des cellules tumorales aux agents cytotoxiques utilisés en chimiothérapie. Dans le but d'étudier la fonction et le mode d'action de certains membres de la fainille des Ced-9/Egl-l/Bcl, nous avons exprimé dans les cellules tumorales humaines Namalwa et U937, les protéines Bcl-xL et Bax-a ainsi que deux nouvelles isof ormes, Bcl-xES et Bax-o, que nous avons identifiées et clonées. Les cinétiques de fragnientation de l'ADN associée à l'apoptose, dans les cellules témoins et transfectées, montrent que Bcl-xL et Bcl-xES protègent les cellules face à l'apoptose induite par différentes drogues anticancéreuses telles que la camptothécine, l'étoposide, la vinblastine, le cisplatine et le taxol. En revanche, Bax-a ainsi que Bax-a, sensibilisent les cellules à l'effet cytotoxique de certaines de ces drogues. La quantification des complexes de clivage induits par la camptothécine ainsi que les mesures du taux d'inhibition de la synthèse de l'ADN dans les cellules transfectées et les cellules témoins, indiquent que Bcl-xL et Bax-a n'interfèrent pas avec le mécanisme d'action primaire de la drogue. Les mitochondries jouent un rôle central dans l'activation de l'apoptose. Suite à un dommage à l'ADN, la libéradon du cytochrome e par les mitochondries conduit à l'activation des caspases impliquées dans l'exécution du processus de mort cellulaire. L'utilisation d'un système acellulaire, la mesure des activités des caspases à l'aide de substrats fluorescents spécifiques ainsi que des analyses par buvardage Western, nous ont permis de démontrer que Bcl-xL et Bcl-xES retardent la libération du cytochrome e et l'activation subséquente des caspases alors que Bax-a et Bax-o exercent l'effet opposé. Nous montrons également que l'expression de la protéine Bcl-xL dans les cellules Namalwa modifie la réponse cellulaire face aux dommages induits par la camptothécine d'une part, en inhibant l'activation du programme apoptotique et d'autre part en permettant la restauration d'un point-contrôle du cycle cellulaire à la transidon G2/M. Des expériences de co-immunoprécipitations in vivo montrent que Bcl-xL interagit avec les complexes cdc2/cdkl-cycline A/B1 impliqués dans la progression S/G2 et la régulation de la transition G2/M du cycle cellulaire. De plus, la protéine recombinante Bcl-xL(ATM) inhibe de façon dose-dépendante l'activité kinase de cdc2/cdkl in vitro. Des expériences de compétition in vitro avec des peptides correspondant à des séquences spécifiques de Bcl-xL, ont permis de détenniner un domaine d'interaction de Bcl-xL avec les complexes cdkl/cdc2-cycline A/B1, localisé dans la région flexible de Bcl-xL. Ces résultats suggèrent, qu'en plus de son activité anti-apoptotique au niveau des mitochondries, Bcl-xL participe à un point-contrôle du cycle cellulaire en réponse à un doiiunage à l'ADN.