Depuis que les radicaux libres ont été découverts, leur implication dans certains processus physiologiques, de même que dans une multitude de pathologies, a été mise en évidence. Aussi, plusieurs méthodes ont été mises au point pour mesurer le potentiel antioxydant de molécules d'origine alimentaire, mais aussi pour en découvrir de nouvelles provenant de diverses sources. L'oxydation et la protection contre l'oxydation impliquant plusieurs modes d'action, aussi la qualification du potentiel antioxydant d'une nouvelle molécule demeure problématique. À ce jour, aucune méthode d'évaluation n'est totalement représentative du potentiel antioxydant global d'une molécule donnée; la plupart des méthodes in vitro ne tiennent pas compte du contexte biologique dans lequel les antioxydants seront ultimement utilisés. Aussi, ce document présente une nouvelle méthode originale, à large spectre de sensibilité, réalisé sur des cellules en culture pour détecter et mesurer le potentiel antioxydant de molécules pures ou de mélanges complexes. Cette méthode a été validée dans le cadre de ce projet de maîtrise en l'utilisant conjointement à un autre test couramment cité dans la littérature, à savoir le test ORAC. La méthode a ensuite été utilisée pour mettre en évidence le potentiel antioxydant d'extraits végétaux, plus spécifiquement des extraits de conifères de la forêt boréale. Parmi tous les extraits testés, les extraits de conifères se sont démarqués des extraits d'origine alimentaire (fruits et légumes). De plus, cette méthode originale s'est avérée adéquate pour comparer l'impact de diverses méthodes d'extraction sur le potentiel antioxydant mesuré.

Cette thèse en bioinformatique a été réalisée entre 2010 et 2015 dans le groupe du Pr. Vincent Detours à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire. Nous avons analysé des données génomiques et transcriptomiques provenant de carcinomes papillaires de la thyroïde (CPTs) et leurs tissus non-cancéreux adjacents. La première partie étudiait les différences transcriptomiques entre CPTs post-Tchernobyl et CPTs sporadiques, et leur tissus non-cancéreux adjacents. Dans notre cohorte, les cas sporadiques étaient en moyenne et significativement un an plus jeunes. Après un ajustement des données transcriptionnelles pour l'âge, près de 400 gènes étaient plus exprimés dans les tissus adjacents des patients exposés aux radiations. Cependant, nous n’avons pu détecter aucune surreprésentation de groupe de gènes participant à des fonctions biologiques connues. Il était possible de distinguer les cas sporadiques des cas post-Tchernobyl sur base des transcriptomes de leurs tissus adjacents, avec une précision de ~70%. Cette surexpression de gènes dans les tissus non-cancéreux adjacents pourrait être liée à une radiosensibilité accrue dans le groupe des patients exposés aux radiations de Tchernobyl. Dans la deuxième étude, nous avons intégré des données provenant des patients de la première partie, incluant les nombres de copies d'ADN des CPTs, le génotype de plus de 400.000 SNPs dans le sang et les données transcriptionnelles des CPTs et leurs tissus non-cancéreux adjacents. En reproduisant les résultats d'une étude précédente, nous avons retrouvé la région 7q11.23 dupliquée exclusivement dans un tiers des patients exposés aux radiations. Dans une étude indépendante, un autre groupe a montré que la duplication de cette région était plus fréquente dans une population de lignées cellulaires radiosensibles que dans la population humaine normale. Cependant, en analysant les transcriptomes des patients présentant cette duplication, nous n'avons pas détecté de différence d’expression des gènes codés dans cette région génomique. En outre, aucun génotype de SNP n'était significativement lié à l'exposition aux radiations. En conclusion, les résultats confirment qu'un tiers des CPTs post-Tchernobyl ont des traces d'un dégât radio-sensibilsant dans leur ADN. Dans une troisième étude, nous avons étudié les différences transcriptionnelles entre CPTs et leurs métastases ganglionnaires (MGs) associées, ainsi qu'entre des CPTs développant des MGs (N+) et des CPTs ne développant pas de MGs (N0). Des études précédentes comparant les MGs et leurs tumeurs associées impliquant d’autres organes ont montré une surexpression de gènes dans les MGs, liés aux cellules immunitaires. Ce signal provient du tissu contaminant environnant les MGs. Pour se défaire de ce signal contaminant, d’autres études ont microdisséqué au laser les parties tumorales des MGs. Cependant, la microdissection retire aussi le stroma associé à la tumeur, alors que celui-ci est justement impliqué dans la progression tumorale. Grâce à une méthode originale, nous avons corrigé nos données d’expression des MGs pour leur contenu en contaminant ganglionnaire non-cancéreux. Après cette correction, l’expression de gènes liés au stroma était plus élevée dans les MGs que dans leurs CPTs. Les différences d’expression entre N0 et N+ n’étaient pas reproductibles entre 4 jeux de données indépendants de CPTs. Ceci démontre l’absence d’un signal transcriptionnelle lié au statut nodal dans ces données. Cependant, en utilisant des données publiques comprenant des centaines de tumeurs, il est possible de prédire le statut nodal (N0 ou N+) des CPTs ainsi que des cancers du sein et du colon à partir de leurs transcriptomes. Des études précédentes montraient des taux de prédiction presque parfaits (>90%) du statut nodal à partir des données transcriptomiques. Nous avons décelés dans ces études le même biais technique de sélection des gènes, qui peut expliquer ces taux artificiellement élevés. Dans notre étude, ce biais n’était pas présent et la précision de nos prédictions était limitée (<70%), questionnant l’intérêt clinique de telles prédictions. La présence d’un signal permettant de prédire le statut nodal et l’irreproductibilité de ce signal dans des jeux de données indépendants peuvent s'expliquer par l’association entre le statut nodal et des caractéristiques d'agressivité des tumeurs, qui pourraient, elles, avoir une influence reproductible sur les transcriptomes. Dans notre dernière étude, nous avons analysé les différences entre CPTs, liées à la présence de BRAFV600E, une mutation commune à 60% des CPTs. En utilisant un jeu de données public, nous avons montré que les CPTs présentant la mutation étaient plus dédifférenciés, et plus infiltrés en stroma, probablement en lymphocytes et fibroblastes; et que ces CPTs présentaient plus de fibrose et proliféraient sans doute plus. Tout ceci suggère que les CPTs mutés pour BRAF constituent un groupe de CPTs plus agressif. Des caractéristiques d’agressivité pourraient être détectées au front invasif, c’est-à-dire la périphérie de la tumeur définissant son contact avec le stroma, notamment la présence de regroupement de cellules isolées du reste de la tumeur. Dans les CPTs, ces îlots cellulaires isolés sont observés sur des lames histologiques 2D et pourraient être expliqués soit par un détachement cellulaire, signe d’agressivité lié au processus métastatique, soit une conformation complexe compatible avec une tumeur connexe en 3D. Dans un CPT, nous avons analysé la conformation 3D du front invasif d'un CPT muté. Nous avons reconstruit son volume 3D grâce à une méthode originale. Les groupes de cellules cancéreuses qui semblaient isolées sur les images 2D d’histopathologie, étaient en fait connectés en 3D. L’hypothèse de la présence de détachement cellulaire suite à la transition épithélio-mésenchymateuse n’est donc pas requise pour expliquer la présence de ces îlots cellulaires en 2D. La forme 3D du front invasif impliquait une surface de contact entre tumeur et stroma bien plus importante qu'impliquée par la forme ellipsoïde habituellement décrite. Les fibroblastes participaient autant à la création de la masse tumorale que les cellules cancéreuses, puisque ces deux groupes de cellules proliféraient à la même vitesse. A l'avenir, le séquençage du matériel génétique de cellules individuelles facilitera notre interprétation des signaux génomiques et transcriptomiques, qui jusqu’alors provenaient de tissu complet, i.e. un mélange de populations de cellules tumorales, stromales et de contaminant. Une signature de radiation pourrait être extraite des profils mutationnels de cellules individuelles exposées aux radiations et à l’H2O2 in vitro et comparée à la signature des CTPs post-Tchernobyl. Les cellules tumorales et stromales individuelles des MGs pourraient être comparées aux cellules tumorales et stromales invividuelles des CPTs. De même les cellules individuelles mutées pour BRAFV600E pourraient être comparées aux cellules non mutées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La microfluidique en gouttes permet l’analyse de systèmes biochimiques à grand débit, en utilisant de faibles volumes réactionnels, à faible coût. Dans l’état de l’art, le volume des gouttes varie entre 2 pL et 4 nL, un millier à million de fois inférieur au volume d’un puit de microplaque. Miniaturiser d’avantage les volumes réactionnels permettrait d’augmenter encore les débits d’analyse, de d’avantage réduire les coûts et ouvre également l’accès à de nouvelles études, telles que les études sur molécule unique ou la délivrance de médicaments. La première partie de ce travail de thèse concerne la miniaturisation des opérations classiques de la microfluidique en gouttes à l’échelle femtolitrique: production, stabilité, biocompatibilité, mélange en gouttes, coalescence, tri, division de gouttes, production à la demande ont été démontrés avec succès sur des gouttelettes femtolitriques. Le tout a été permis en restant dans les limites de la technologie PDMS et des standards classiques de la lithographie. La seconde partie s’intéresse à certaines applications biologiques issues du couplage de gouttelettes picolitriques et femtolitriques. Une plateforme permettant l’encodage in situ de gouttes à l’aide de codes barres d’ADN lisibles par séquençage a été construite. Deux autres applications ont été envisagées: un projet concernant l’émergence des chromosomes dans un monde prébiotique qui nécessitait des facteurs de dilution de l’ordre de 1:1000 et un projet de cartographie génotype-phénotype sur une enzyme qui nécessitait deux dilutions par 10 ont bénéficié de la miniaturisation à l’échelle femtolitrique. / Droplet-based microfluidics has demonstrated its multiple advantage over standard microtiter plates technologies by increasing analysis throughputs, decreasing costs and enabling the encapsulation of single cells into individual reservoirs. In the state-of-the-art, droplet volumes usually range from 2 pL to 4nL, one thousand to one million times smaller than microtiter plate wells. This PhD work focuses on the miniaturization of biological reservoirs down to the femtoliter scale which would enable an increase of throughputs of analysis and open up access to new studies, such as single-molecule studies or drug delivery. The first part of this manuscript concentrates on the miniaturization of elementary operations of droplet-based microfluidics down to the femtoliter scale. Production, mixing, electrocoalescence, DEP sorting, splitting, drop-on-demand, stability, biocompatibility were successfully demonstrated on droplets of a few micrometers diameter. The second part of this manuscript focuses on some biological applications that were developed with the LBC. A platform for the in situ encoding of droplets with DNA barcodes readable per sequencing was developped. Two other applications were envisioned: a project studying the conditions that prevailed the apparition of chromosomes in an early RNA world and a genotype-phenotype mapping project benefited from downscaling to the femtoliter scale.

Depuis que les radicaux libres ont été découverts, leur implication dans certains processus physiologiques, de même que dans une multitude de pathologies, a été mise en évidence. Aussi, plusieurs méthodes ont été mises au point pour mesurer le potentiel antioxydant de molécules d'origine alimentaire, mais aussi pour en découvrir de nouvelles provenant de diverses sources. L'oxydation et la protection contre l'oxydation impliquant plusieurs modes d'action, aussi la qualification du potentiel antioxydant d'une nouvelle molécule demeure problématique. À ce jour, aucune méthode d'évaluation n'est totalement représentative du potentiel antioxydant global d'une molécule donnée; la plupart des méthodes in vitro ne tiennent pas compte du contexte biologique dans lequel les antioxydants seront ultimement utilisés. Aussi, ce document présente une nouvelle méthode originale, à large spectre de sensibilité, réalisé sur des cellules en culture pour détecter et mesurer le potentiel antioxydant de molécules pures ou de mélanges complexes. Cette méthode a été validée dans le cadre de ce projet de maîtrise en l'utilisant conjointement à un autre test couramment cité dans la littérature, à savoir le test ORAC. La méthode a ensuite été utilisée pour mettre en évidence le potentiel antioxydant d'extraits végétaux, plus spécifiquement des extraits de conifères de la forêt boréale. Parmi tous les extraits testés, les extraits de conifères se sont démarqués des extraits d'origine alimentaire (fruits et légumes). De plus, cette méthode originale s'est avérée adéquate pour comparer l'impact de diverses méthodes d'extraction sur le potentiel antioxydant mesuré.

Le cancer du poumon occupe la première position en termes de fréquence de décès imputables au cancer. La majorité des cas de cancer du poumon diagnostiqués sont des cas de cancers du poumon dits « non-à-petites cellules » (CPNPC). Il n’existe actuellement aucun traitement capable d’éradiquer complètement le CPNPC ce qui lui confère le statut de maladie incurable. Ce projet avait pour objectif principal d’évaluer le potentiel anticancéreux d’un extrait enrichi d’une plante endémique de la Géorgie, Helleborus caucasicus, pour traiter le CPNPC. L’activité anti-tumorale de cet extrait a été évaluée in vitro au niveau cellulaire et moléculaire dans des cellules d’adénocarcinome pulmonaire humain A549 et in vivo chez des souris C57BL/6 NCrl porteuses de tumeur du carcinome pulmonaire de Lewis. Les résultats ont montré que l’extrait étudié possédait une activité anticancéreuse pertinente in vitro et in vivo et ainsi, qu’il constituait une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement du CPNPC.

Toutes les cellules de l’organisme relarguent de façon constitutive des nucléotides dans l’espace extracellulaire. Ces nucléotides extracellulaires agissent comme des molécules de signalisation, entre autres, via les récepteurs P2Y (P2YRs) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les P2YRs sont exprimés, pour la majorité, de façon ubiquitaire dans l’organisme. L’analyse phénotypique des lignées de souris knockout pour les P2YRs (P2YR-/-) a permis de confirmer l’importance de cette voie de communication dans différents processus physio/pathologiques. Au sein de notre laboratoire, grâce à l’utilisation de souris P2YR-/-, nous étudions depuis quelques années le rôle de ces récepteurs dans la biologie des cellules stromales mésenchymateuses multipotentes (MSCs). Ces cellules se caractérisent par une faible immunogénicité et surtout par la propriété de multipotence, i.e. capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires (adipocytes, chondroblastes, ostéoblastes). Cette dernière propriété suscite l’intérêt de la médecine régénérative qui vise à exploiter la multipotence de ces cellules en thérapie cellulaire. Toutefois, leur utilisation à des fins thérapeutiques est encore limitée, notamment parce que les mécanismes régulateurs de ces processus de différenciation sont encore mal compris. Il est donc fondamental de continuer à étudier les voies de signalisation régulant les processus de différenciation de ces cellules pour leurs applications cliniques.Dans ce travail de recherche, nous avons investigué l’implication de la signalisation dépendant des P2YR dans le modèle expérimental des MSCs dérivées du tissu adipeux sous-cutané inguinal (ATMSCs) murin. D’abord, nous avons montré que parmi les 7 sous-types connus de récepteur P2Ys, les ATMSCs expriment le P2Y2R (récepteur à l’ATP et l’UTP) et le P2Y6R (récepteur à l’UDP) et que ces récepteurs sont fonctionnels. Par une approche combinant l’analyse quantitative de leur expression, l’effet de leur activation pharmacologique et enfin l’effet de l’invalidation de leur gène (P2ry2 ou P2ry6), nous avons montré que ces deux récepteurs influencent à des degrés divers le processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs in vitro.Concernant le P2Y2R, nos données montrent que l’expression de son messager diminue dans les ATMSCs différenciées en adipocytes tandis que son activation et que l’invalidation de son gène sont sans effet sur l’intensité de différenciation adipogénique. Par ailleurs, après une différenciation ostéoblastogénique, le niveau d’expression du messager codant P2Y2R n’est pas modifié. Par contre, les ATMSCs P2Y2R-/- ont un potentiel de différenciation ostéoblastogénique diminué par rapport aux WT. Cet effet pourrait être lié à une diminution de l’expression de gènes codant des facteurs de signalisation des voies Wnt et/ou BMP, connues pour contrôler la production d’ostéoblastes à partir des MSCs.Le récepteur P2Y6R semble intervenir à la fois dans l’adipogénèse et l’ostéoblastogénèse des ATMSCs. En effet, l’expression du messager codant P2Y6R n’est pas modulée dans les adipocytes matures et l’activation du récepteur n’a pas d’effet sur le processus de différenciation adipogénique. Par contre, les ATMSCs P2Y6R-/- ont un potentiel de différenciation adipogénique réduit ce qui est corrélé à une diminution de l’expression du messager codant PPARγ2. D’autre part, nous avons constaté que l’augmentation de tissu adipeux est moindre chez les souris P2Y6R-/- âgées sous régime normal ou riche en graisse. Par ailleurs, l’expression du messager codant P2Y6R est diminuée après différenciation ostéoblastogénique. L’activation de P2Y6R par l’UDP altère la maturation complète des ATMSCs en ostéoblastes et l’invalidation du gène P2ry6 augmente l’activité principale de cette phase tardive, c’est-à-dire la production de minéralisation. Ces données suggèrent que la voie UDP-P2Y6R régule négativement le processus de différenciation ostéoblastogénique dans le modèle cellulaire étudié dans ce travail.Avec le modèle pathologique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs), modélisant une différenciation ectopique, nous avons montré que l’invalidation des gènes P2ry2 et P2ry6 affecte la transdifférenciation de ces cellules en cellules minéralisantes.En résumé, notre travail a permis de définir les rôles des P2Y2R et P2Y6R dans les processus de différenciation adipogénique et ostéoblastogénique des ATMSCs et de transdifférenciation des VSMCs en cellules calcifiantes. Des études complémentaires devront être réalisées pour établir la signification physio/pathologique de ces données expérimentales. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La spécification de l’identité ventrale ou dorsale des progéniteurs au cours du développement du télencéphale est la première étape cruciale du développement du cortex cérébral. Les gènes doublesex and mab-3 related (Dmrt) Dmrt3 et Dmrt5 codent pour des facteurs de transcription à doigt de Zinc. Ces gènes sont coexprimés selon un gradient fort caudomédialement à plus faible rostrolatéralement dans le primordium du cortex cérébral. Nous avons d’abord démontré qu’ils étaient tous deux nécessaires pour la formation normale de l’hème corticale, l’hippocampe et le néocortex caudomédian. Nous avons plus récemment adressé le rôle de Dmrt3 et Dmrt5 dans le contrôle de la régionalisation dorsale/ventrale du télencéphale chez la souris, en comparant les phénotypes d’embryons simple knock out (KO) aux double KO (dKO), et par une expression ectopique de Dmrt5 dans le télencéphale ventral. Nous avons mis en évidence que DMRT3 et DMRT5 agissent comme des régulateurs critiques de l’identité dorsoventrale des cellules progénitrices en réprimant les régulateurs ventralisants. Les régulateurs transcriptionnels précoces de la destinée ventrale exprimés dans la partie dorsale de l’éminence ganglionnaire latérale tel que Gsx2 sont régulés positivement dans le télencéphale dorsal embryons dKO et régulés négativement lorsque les progéniteurs du télencéphale ventral expriment Dmrt5 de manière ectopique. La surexpression conditionnelle de Dmrt5 au sein du télencéphale entier génère un profil d’expression et des défauts très similaires à ceux observés lors d’une activité Gsx2 diminuée. De plus, les embryons Emx2 ;Dmrt5 double KO montrent un phénotype similaire à celui des embryons dKO. DMRT3, DMRT5 et le facteur de transcription à homéobox EMX2 peuvent se lier à un enhancer spécifique du télencéphale ventral dans le locus Gsx2. Ensemble, nos résultats montrent des fonctions coopératives de DMRT3, DMRT5 et EMX2 dans la distinction entre identité dorsale et ventrale au sein du télencéphale. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Nous avons analysé l'activité immortalisante de l'anugène grand T du virus du polyome marin. Landgène grand T du virus du polyome est en mesure d'interagir avec pRb in vitro et son activité immortalisante semble dépendre de sa capacité à lier pRb par le biais d'une séquence contenue entre les acides aminés 141-146. Cette région contient la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) et est homologue à la région conservée 2 de la protéine E1A d'adénovirus qui est non seulement capable d'interagir avec pRb mais aussi avec la protéine pl 07 et pl 30. Dans un premier temps, nous avons ciblé la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome. Nous avons démontré que la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome est nécessaire pour la liaison de pRb, pl 07 et pl 30 in vitro. Nous avons ensuite examiné la nature des interactions entre pRb, pl 07 et la région conservée 2 de l'amigène grand T du virus du polyome marin et corrélé la formation de complexes avec l'aaivité immortalisante de la protéine. Pour ce faire, nous avons généré une série d'antigènes grand T mutants dans la région conservée 2 en introduisant des mutations ponctuelles au coeur de la séquence consensus de liaison à pRb et dans sa région C-terminale. Ces antigènes grand T mutants nous ont permis de démontrer que chaque acide aminé conservé du coeur de la séquence consensus de liaison à pRb (D/N-L-X-C-X-E) est absolument nécessaire pour la liaison de pRb et de pl 07 in vitro. De plus, la substitution de résidus non-conservés dans la région flanquant le coeur de la séquence de liaison à pRb peut aussi influencer la liaison de pRb et de pl 07 à l'antigène grand T de polyome in vitro. Les antigènes grand T mutants incapables de former des complexes avec pRb à des niveaux significatifs in vitro, sont également incapables d'immortaliser des cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de rat in vivo. Nos résultats suggèrent que la liaison de pl 07 nest pas nécessaire pour conférer à l'antigène grand T de polyome l'habileté à immortaliser des cellules primaires de rat. Nous avons donc pu démontrer qu'il y a une corrélation étroite entre la capacité de l'antigène grand T de polyome à lier pRb in vitro et à immortaliser des cellules embryonnaires de rat in vivo. Cependant le niveau absolu de liaison de pRb et de pl 07 in vitro par l antigène grand T n'a aucune influence sur l'activité IV 0 immortalisante de la protéine in vivo mais semble plutôt afFeaer les caractéristiques de croissance des lignées cellulaires dérivées de ces transfections en leur permettant d'atteindre de plus fortes densités de saturation. Nous avons aussi démontré l'importance du motif de phosphorylation par la CKII, flanquant la séquence consensus de liaison à pRb, dans l'activité immortalisante de l'antigène grand T du virus du polyome. Ainsi, l'addition de résidus acides dans ce motif vient doubler la fréquence d'immonalisation de la molécule hybride. De plus, nous avons démontré que la région conservée 2 de l'antigène grand T de SV40 peut remplacer la région conservée 2 de l'antigène grand T du virus du polyome marin. La molécule hybride est en mesure d'immortaliser des cellules embryonnaires de rat à une fréquence équivalente à l'antigène grand T de polyome sauvage. La deletion des acides aminés correspondant à la position du domaine de liaison à pRb chez l'antigène grand T de SV40 génère un antigène grand T mutant qui est en mesure d'immortaliser des cellules embryonnaires de rat à une fréquence deux fois plus élevée que l'anrigène grand T sauvage. Les lignées cellulaires dérivées des transfections avec ces trois antigènes grand T mutants possèdent des phénotypes particuliers. Ces lignées cellulaires sont toutes en mesure de former des colonies en agar mou à une fréquence élevée. L'ensemble de nos résultats révèle une corrélation intéressante entre la capacité de lier les protéines pRb et pl 07 in vitro et l'activiré immortalisante de l'antigène grand T de polyome in vivo. En efFet, les antigènes grand T mutants capables de lier pRb à des niveaux équivalents ou supérieurs à la protéine sauvage et dont la capacité de lier pl 07 est diminuée, démontrent tous une fréquence d'immortalisation supérieure à l'anugène grand T sauvage. Ces observations nous amènent à suggérer un modèle d'immortalisation cellulaire par l'anrigène grand T de polyome où le rapport entre la quantité de pRb et de pl 07 lie par l'antigène grand T du virus du polyome pourrait avoir un effet sur l'activité immortalisante de la protéine. u v 0 Dans la troisième partie de cette étude, nous avons examiné la contribution du motif de doigt de zinc à l'activité immortalisante de l'antigène grand T de polyome. Un fragment N-terminal de 219 acides aminés est en mesure d'immonaliser des cellules embryonnaires de rat mais à une fréquence équivalente à seulement 22% de l'antigène grand T sauvage. La formation de complexes de hauts poids moléculaires, qui nécessite le motif de doigt de zinc, pourrait être importante pour la pleine activité immortalisante de la protéine. Nous avons delete le motif de doigt de zinc de l'antigène grand T de polyome et déterminé l'activité immortalisante de la protéine in vivo. Nos résultats indiquent que la deletion du motif de doigt de zinc ne diminue pas la capacité de l'andgène grand T mutant à immortaliser des cellules embryonnaires de rat mais augmente plutôt sa fréquence relative d'immortalisation. Le motif de doigt de zinc n'est donc pas nécessaire pour l'immortalisation de cultures primaires de cellules embryonnaires de rat. Ces résidtats suggèrent que d'autres domaines de la protéine sont néoessaires pour conférer à l'antigène grand T de polyome sa pleine activité immortalisante.

Breast cancer is the most common malignancy in women, affecting one out of eight women worldwide. Even if most of the breast tumors are efficiently treated using targeted therapies, there is still a heterogeneous breast cancer subpopulation known as "triple-negative", which is highly metastatic and, due to the absence of targeted therapies, of poor prognosis. The elucidation of the processes involved in tumor progression and metastasis remains an important challenge in the search for new therapies against this subtype of breast cancer. Previous results from the laboratory have shown that ATIP3, a major product of the candidate tumor suppressor gene MTUS1, is a microtubule associated protein (MAP), whose expression is decreased in 85% of high grade, 83% of triple negative and 62% of metastatic breast carcinomas. Re-expression of ATIP3 in breast cancer cells significantly reduces cell proliferation in vitro, and tumor growth in vivo. Based on these results, my PhD project aimed at evaluating the role of ATIP3 in tumor cell migration and cancer metastasis. In the first part of my thesis, I will present data showing that ATIP3 is a novel prognostic marker for breast cancer patients' survival and a new anti-metastatic molecule. By means of DNA microarray analysis, we showed that low ATIP3 expression levels correlate with reduced overall survival of metastatic breast cancer patients. Using an in vivo model for cancer metastasis, we then showed that re-expression of ATIP3 reduces metastatic progression and lowers the number and size of metastatic foci. At the functional level, ATIP3 reduces breast cancer cell migration by reducing cell velocity and directionality. At the molecular level we further showed, using nocodazole washout experiments and MT growing ends tracking, that ATIP3 slows MT regrowth and decreases MT dynamics. Altogether, these studies indicate that ATIP3 is a novel MT stabilizing protein that controls the ability of MT tips to reach the cell cortex during migration, a mechanism that may account for reduced cell migration and metastasis. In the second part of my thesis, I will present data investigating the mechanisms by which ATIP3 regulates MT dynamics. To this end, we searched for new ATIP3-interacting partners. Interestingly, EB1, the core component of plus-end tracking proteins, was found to interact with ATIP3 not at the growing end of the MTs (as most EB1-interacting proteins), but mostly in the cytosol and at the MT lattice. The identification of the EB1-interacting domain of ATIP3 (termed CN) and further characterization of deletion mutants revealed that ATIP3-EB1 interaction is involved in impaired accumulation of EB1 at the plus-end. Based on these results and on FRAP analysis of EB1-GFP fluorescence recovery, a model was proposed in which the interaction between ATIP3 and EB1 may slower EB1 turnover at the MT plus-end, possibly by limiting EB1 association with its recognition site. In line with this model, in ATIP3-depleted cells dynamic EB1 molecules are more prone to accumulate at the growing end to increase MT dynamics. Relevance of this model in human pathology was then tested by evaluating ATIP3-EB1 expression levels in breast tumors, indicating that combined relative expression levels of both proteins may be considered as a prognostic marker of patient survival. Finally, in a third part of my thesis, I will present some preliminary data showing that ATIP3 may interact with the depolymerizing kinesin MCAK and the tumor suppressor APC, both of which are also well-known partners of EB1. The characterization and the implication of these interactions on ATIP3 functions (MT dynamics for MCAK interaction and cell polarity for APC interaction) remains to be investigated.

Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1