Le méthane (CH4) est un des principaux gaz à effet de serre. L’élevage est à l’origine d’un tiers du CH4 produit par l’activité humaine en Europe. En plus, la production de CH4 représente une perte de 2% à 12 % de l’énergie consommée par l’animal. La méthanogenèse est le résultat de l’activité d’un groupe de microorganismes particuliers - les Archaea méthanogènes. La production de CH4 permet de d’éliminer du milieu ruminal l’hydrogène produit au cours de la fermentation des aliments par les autres microorganismes (bactéries, protozoaires, champignons). En effet, l’accumulation d’hydrogène affecte le fonctionnement optimal du rumen. La réduction des émissions de CH4 par les ruminants présente donc un intérêt économique et environnemental non négligeable et passe inévitablement par une modification de l’écosystème microbien du rumen. L’objectif de ce travail de thèse était de relier la production de CH4 avec la structure et l’activité de la communauté méthanogène du rumen. Différents modèles de manipulation de l’écosystème microbien ruminal comme la défaunation (élimination des protozoaires) et l’utilisation d’aliments connus pour modifier la méthanogenèse ont été utilisés. Le rumen étant un écosystème complexe, les interactions fonctionnelles entre les Archaea méthanogènes et les autres microorganismes présents (bactéries et protozoaires) ont également été étudiées. Dans cette optique, des outils de biologie moléculaire, permettant de cibler les principales communautés microbiennes, ont été optimisés. Nos travaux permettent de conclure sur l’absence de relation claire entre le nombre (et/ou la concentration) des Archaea méthanogènes et la méthanogenèse dans le rumen. Cependant les réductions des émissions de CH4 ont été attribuées aux changements dans la diversité de la communauté méthanogène et la disponibilité en hydrogène. Ce travail de thèse a mis en évidence que les modifications de la composition et/ou de l’activité métabolique de la communauté des Archaea méthanogènes seraient à l’origine des réductions des émissions de CH4 par les ruminants. Une meilleure connaissance des mécanismes microbiens impliqués dans la production de méthane permettra d’envisager de nouvelles pistes pour diminuer les émissions chez les ruminants. / Methane (CH4) is a major greenhouse gas. Livestock contributes to one third of CH4 produced by human activity in Europe. Methanogenesis is the result of the activity of a specific group of microorganisms, the methanogenic Archaea. This natural process prevents hydrogen accumulation in the rumen, which may affect the optimal feed degradation, but it represents a loss of 2% to 12% of energy consumed by the animal. Reduction of CH4 emissions from ruminants presents therefore economic and environmental benefits and inevitably involves a change in rumen microbial ecosystem. However microbial mechanisms of CH4 production in the rumen are still poorly understood. The objective of this thesis was to relate the production of CH4 with the structure and/or the activity of the methanogenic rumen community. Different models of manipulation of the rumen microbiota such as defaunation (removal of protozoa) and the use of feed known to affect methanogenesis were used. Interactions between methanogenic Archaea and other microorganisms (bacteria and protozoa) were also studied in the complex rumen ecosystem. In this context, tools of molecular biology, to identify key microbial communities, were optimized. Our work allows to conclude that there is no clear relationship between the number of methanogenic Archaea and methanogenesis rate in the rumen. However, reduction in CH4 emissions could be attributed to changes in the diversity of the methanogenic community and the availability of hydrogen. This thesis has shown that changes in the composition and / or metabolic activity of methanogenic Archaea community were associated to the reductions in CH4 emissions observed in our animal trials. A better understanding of microbial mechanisms involved in the production of methane will consider new ways to reduce emissions in ruminants.

Ce travail s’inscrit dans un projet de recherche global qui consiste en une caractérisation moléculaire des tumeurs thyroïdiennes papillaires (PTC) afin de déterminer des signatures diagnostiques et pronostiques potentielles, et d’identifier des cibles thérapeutiques. Le PTC est le cancer thyroïdien le plus fréquent des cancers endocriniens, et son incidence ne cesse d’augmenter avec les années. Il présente un bon pronostic de survie malgré un pourcentage non négligeable de patients qui récidivent et qui développent des métastases distantes. A l’heure actuelle, le diagnostic et le pronostic d’un PTC sont réalisés sur base de ponctions à l’aiguille fine visant des nodules thyroïdiens dont 30% des diagnostics restent toutefois incertains. Il est donc incontestable que des patients sont opérés inutilement pour éviter les risques d’un diagnostic douteux. La thérapie actuelle pour un PTC est basée sur une thyroïdectomie totale, suivie d’un traitement au radioiode I131 afin d’éliminer toute cellule cancéreuse résiduelle. Les cas de récidives sont en réalité associés à une résistance à ce traitement par radioiode, de par l’état dédifférencié des cellules cancéreuses. La plupart des autres cancers ont leur métabolisme énergétique qui est caractérisé, ce qui permet de les diagnostiquer et les pronostiquer par des techniques d’imagerie avec des métabolites marqués tels que le glucose. Enfin, tout un pan de la recherche scientifique essaie de caractériser davantage les dérégulations moléculaires impliquées dans le métabolisme pour proposer des alternatives thérapeutiques. Aujourd’hui il existe en effet une série d’inhibiteurs qui sont utilisés pour enrayer la machinerie énergétique des cellules cancéreuses. Très peu de données métaboliques existent actuellement sur les cancers thyroïdiens, alors qu’il semble évident que ces recherches pourraient contribuer à améliorer leur diagnostic et leur traitement. Par analyse protéomique, nous avons montré que les PTC ont un métabolisme mitochondrial oxydatif augmenté par rapport aux cellules thyroïdiennes normales. Nous avons identifié la pyruvate carboxylase comme étant une enzyme clé dans l’anaplérose, de par sa surexpression dans tous les PTC analysés, et de par son rôle dans la prolifération, la migration et l’invasion de lignées cellulaires thyroïdiennes cancéreuses. Une mesure de consommation d’oxygène a montré que les lignées avaient un profil métabolique oxydatif. D’autre part, nous avons caractérisé l’augmentation d’autres voies métaboliques telles que la glutaminolyse, la dégradation des acides gras, ou la gluconéogenèse. L’hétérogénéité des PTC, due notamment à la présence de fibroblastes associés au cancer (CAFs), nous a aussi permis de proposer le modèle de l’effet Warburg inverse. Celui-ci se caractérise par la libération de lactate dans le microenvironnement tumoral par les CAFs, disponible pour les cellules tumorales qui le métabolisent via le cycle de Krebs. Toutes ces signatures métaboliques, déjà proposées dans d’autres cancers comme marqueurs d’agressivité, ou comme cibles thérapeutiques, pourraient être davantage investiguées dans les cancers thyroïdiens.Un second projet, à visée purement thérapeutique, a été mené pour tenter de solutionner la problématique de résistance d’une fraction des cancers thyroïdiens au traitement par radioiode. Nous avons étudié le rôle de la colforsine dans l’activation de la voie AMPc, et sur la réexpression de l’ARNm du transporteur d’iode (NIS), dont la protéine correspondante n’est plus exprimée à la membrane des PTC dédifférenciés. Nous avons démontré dans des expériences in vitro et in vivo que la colforsine était capable de réinduire l’expression de NIS, et d’augmenter les niveaux de captation de radioiode dans les cellules thyroïdiennes. Une combinaison du traitement à la colforsine pour redifférencier les cellules, avec un traitement déjà développé sur l’inhibition de BRAF pour bloquer la dédifférenciation cellulaire, pourrait être une nouvelle perspective thérapeutique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les Heat Shock Proteins 70 kDa (HSP70) sont considérées comme les membres les plus conservés de la superfamille des HSP. Ces protéines chaperonnes sont indispensables à tous les organismes vivants par leur implication dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire et dans la gestion de multiples facteurs de stress environnementaux (température, pollution, salinité, radiation). Largement utilisée en écologie comme biomarqueur de stress, la famille des HSP70 constitue également une cible thérapeutique privilégiée dans les recherches contre les maladies neurodégénératives et les cancers. Dans le cytosol, une large variété de HSP70 a été observée chez quelques espèces modèles (drosophile, levure, humain). Néanmoins, cette diversité reste méconnue au sein du phylum Arthropoda, et plus particulièrement chez les décapodes. La diversité des HSP70 cytosoliques a été étudiée à partir de 735 séquences issues 198 espèces d’arthropodes, dont 142 séquences de décapodes obtenues durant ces travaux. Les analyses de phylogénie moléculaire ont permis la description d’au moins trois groupes distincts de HSP70 cytosoliques chez les arthropodes, comprenant chacun plusieurs subdivisions méconnues jusqu’à présent. Une nouvelle classification et un modèle évolutif des HSP70 cytosoliques sont proposés pour le phylum Arthropoda. Les profils d’expression observés dans ces groupes remettent en cause la catégorisation des HSP70 selon leurs caractère constitutif (HSC70) ou inductible (HSP70). Les spécificités structurales géniques et protéiques observées pour chacune de ces formes reflèteraient différentes capacités d’interaction des HSP70 avec leurs co-chaperons et autres cofacteurs. / The 70 kDa Heat Shock Proteins (HSP70) are considered the most conserved members of the HSP family. These molecular chaperones are primordial to living beings, because of their implications in many cellular pathways and the management of multiple environmental stress factors (e. g., temperature, pollutants, salinity, radiations). Widely used in ecology as a biomarker of environmental stress, the HSP70 family is also a privileged therapeutic target for neurodegenerative diseases and cancers. In the cytosol, a wide variety of HSP70 is observed in few model species (Drosophila, human, yeast). Nevertheless, the diversity of cytosolic HSP70 remains unclear amongst the Arthropoda phylum, especially within decapods. The diversity studies of cytosolic HSP70 were based on 735 sequences from 198 arthropod species, including 142 sequences from decapods obtained during this work. Molecular phylogeny analyses revealed at least three distinct groups of HSP70 within arthropods, comprising several unrecognised subdivisions. This study proposes a new classification and an evolutionary model of cytosolic HSP70 amongst the Arthropoda phylum. The expression profiles observed in each group lead to reconsider the HSP70 classification according to their constitutive (HSC70) or inducible (HSP70) features. The observed structural specificities of genes and proteins, relative to each form of HSP70, will probably have to be linked to distinct interactions with cochaperones or other co-factors.

Maged1 appartient à la famille des gènes Mage (pour Melanoma antigen gene). Bien que les gènes Mage aient tout d'abord été découverts dans des cellules tumorales, le gène Maged1 est également exprimé dans un grand nombre de tissus sains et particulièrement dans le système nerveux central, aussi bien au cours du développement que chez l'animal adulte. Les fonctions exercées par la protéine Maged1 dans le système nerveux restent actuellement fort méconnues bien que des études aient pu mettre en évidence son implication dans des processus tels que l'homéostasie du rythme circadien, certaines formes d'apprentissages, les comportements sociaux et sexuels ainsi que dans des pathologies telles que la dépression et l'obésité. Au laboratoire, nous avons pu montrer que la délétion de l'allèle Maged1 chez la souris cause une diminution d'activité locomotrice spontanée et un déficit de coordination motrice. Les animaux ne possédant plus l'allèle Maged1 montrent également une absence complète de réponse à l’administration de drogues comme la cocaïne et la morphine. Au cours de ce travail de thèse, nous avons recherché les mécanismes liant le gène Maged1 et ces comportements. La dopamine étant un neurotransmetteur connu pour réguler à la fois les comportements moteurs et les comportements liés à la dépendance aux drogues, nous avons tout d'abord fait l'hypothèse qu'un déficit en dopamine pouvait expliquer les phénotypes observés. En effet, des expériences de microdialyse in vivo ont montré que l'augmentation de concentration en dopamine dans le nucleus accumbens suite à une injection de cocaïne était significativement réduite chez les souris dépourvues de l'allèle Maged1. L'implication directe de Maged1 dans la physiologie des neurones dopaminergiques a été étudiée par la génération de souris transgéniques dont la délétion du gène Maged1 a été ciblée spécifiquement dans ces neurones. Cependant, cette lignée de souris ne récapitule pas les phénotypes observés chez les souris entièrement dépourvues de l'allèle Maged1. Ces résultats indiquent que l'expression de Maged1 dans les neurones dopaminergiques n'est pas nécessaire au contrôle moteur et à la réponse comportementale à l'administration de cocaïne. Nous avons ensuite étudié les régions innervées par les neurones dopaminergiques en réalisant des enregistrements électrophysiologiques sur tranches de cerveaux en survie. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une altération de la transmission glutamatergique entre le cortex préfrontal et le nucleus accumbens chez les souris dépourvues du gène Maged1. La délétion spécifique de l'allèle Maged1 dans chacune de ces deux régions a ensuite été effectuée. Les souris dont la délétion de Maged1 a été ciblée dans les neurones du striatum n'ont pas montré d'altération comportementales. Cependant, lorsque la délétion de Maged1 est effectuée spécifiquement dans le cortex préfrontal, les souris montrent un déficit d'apprentissage moteur ainsi qu'une réduction de l'effet de sensibilisation à des injections répétées de cocaïne. Chez ces mêmes souris, la réduction de sensibilisation est accompagnée d'une réduction de la réponse dopaminergique à la cocaïne telle qu'observée au cours d' expériences de microdialyse in vivo. Au cours de ce travail, nous avons donc pu montrer que la présence de la protéine Maged1 dans le cortex préfrontal est nécessaire à l'apprentissage moteur et à l'expression de la sensibilisation comportementale à la cocaïne. Cette protéine exerce probablement sa fonction en régulant la neurotransmission au niveau du compartiment présynaptique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The central hypothesis supporting the present work is that the effectiveness of radiation therapy for cancer is often limited due to defects in key apoptosis regulators, such as Bcl-2 family members, that contribute to cancer ability to evade apoptosis. One way to bypass this resistance to radiotherapy is to target cell death pathways, aiming to sensitize tumours to radiation and enhance the therapeutic ratio in cancer. To test this central hypothesis, we took a dual approach: one targeted apoptosis and the other targeted autophagy. / First, we focused on the apoptotic signaling. The Bcl-2 family comprises antiapoptotic members, such as Bcl-2, Mcl-1, and Bcl-XL, and proapoptotic members, such as Bax, Bak, and Bid. The Bcl-2 family controls the integrity of the outer mitochondrial membrane and is critical in determining the susceptibility of cells to apoptosis induced by the intrinsic pathway. The balance between cell survival and cell death is modulated by the ratios and interactions of antiapoptotic and proapoptotic Bcl-2 family proteins. Overexpression of Bcl-2 or Bcl-XL is observed in several cancers, including lung, colorectal, prostate, and breast cancers, and has been shown to confer resistance to various anticancer agents, including radiotherapy. In cancer cells, alterations in the amounts of these antiapoptotic Bcl-2 proteins promote cell survival, among others by contributing to their evasion from treatment-induced apoptosis. We made the observation that lung cancer cells have different radiosensitivity. On the basis of their relative response to radiotherapy, we stratified lung cancer cells into two groups (higher or lower sensitivity), and selected a representative cell line of each group for more in-depth study: A549 (resistant) and HCC2429 (sensitive). We found that the expression levels of Bcl-XL expression, which is antiapoptotic, was dramatically higher in A549, whereas almost not detected in HCC2429. We then hypothesized that AT-101, a pan-Bcl-2 inhibitor, had the potential to radiosensitize lung cancer by restoring radiation-induced apoptosis. When administered alone, AT-101 resulted in increased apoptosis in a concentration-dependent manner in both groups, with enhanced activity in HCC2429 even at lower concentration. Furthermore, AT-101 promoted radiosensitivity of A549 and HCC2429 cells (p < 0.005). A549 cells required increased AT-101 dose to achieve the same level of cytotoxicity than HCC2429 cells. These investigations suggest that the Bcl-2 family members may serve as effective therapeutic targets in lung cancer. However, the potential of AT-101 as an agent that enhances the therapeutic ratio of radiotherapy varies depending on the lung cancer clone. / Next, we turned to a different approach, focusing on the inhibition of apoptosis instead of its promotion. This work hypothesis was based on previous observations looking at the role of radiation-induced apoptosis by knockdown of Bak and Bax. The radiosensitivity of breast and lung cancer in vitro was increased through autophagy, an alternate type of programmed cell death. Consistently, radiation-induced apoptosis accounts for a minor portion of cell death in irradiated solid tumors. The hypothesis of our work was that apoptosis inhibition would increase radiation-induced autophagy and tumor sensitivity to radiation. To block apoptosis, we used Z-VAD, a broad-spectrum caspase inhibitor, and examined its in vitro and in vivo effects on breast and lung cancer models. Z-VAD markedly radiosensitized breast and lung cancer cells in vitro, with a radiation dose enhancement ratio of 1.31 (P < 0.003). The enhanced tumor cytotoxicity was associated with induction of autophagy. In both breast and lung cancer mice xenograft models, the administration of Z-VAD concurrent with radiation produced a significant tumor growth delay compared with radiation alone and was well tolerated. Interestingly, Z-VAD also had a dramatic antiangiogenic effect when combined with radiation both in vitro and in vivo. Thus, Z-VAD represents an attractive anticancer therapeutic strategy. We further explored the potential of apoptosis inhibition as a way to sensitize cancer to radiation using a more selective chemical, M867, which is a reversible caspase-3 inhibitor. In an in vivo mouse hind limb lung cancer model, the administration of M867 with ionizing radiation was well tolerated, and produced a significant tumor growth delay compared with radiation alone. A dramatic decrease in tumor vasculature and tumor cell proliferation was observed with M867 despite the reduced levels of apoptosis. The radiosensitizing effect of M867 through the inhibition of caspases was validated using a caspase-3/-7 double-knockout (DKO) mouse embryonic fibroblasts (MEF) cell model. Consistent with our previous results, autophagy contributed to the mechanism of increased cell death, following inhibition of apoptosis. Finally, we investigated the mechanism by which radiation triggers autophagy in caspase-3/7-deficient cells, and found the involvement of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER activates a survival pathway, the unfolded protein response, which involves ER-localized transmembrane proteins such as protein kinase-like ER kinase (PERK), inositol-requiring enzyme-1, and activating transcription factor-6. In this study, we found that PERK is essential for radiation-induced autophagy and radiosensitivity in caspase-3/7 double-knockout cells. Irradiation of these cells increased expression of phosphorylated-eIF2a. Similar results were seen after administration of tunicamycin (TM), a well-known ER stress inducer. We found that the administration of TM with radiation in MCF-7 breast cancer cells, which are lacking functional caspase-3 and are relatively resistant to many anticancer agents, enhances radiation sensitivity. Our findings revealed ER stress as a novel potential mechanism of radiation-induced autophagy in caspase-3/7-deficient cells and as a potential strategy to maximize efficiency of radiation therapy in breast cancer. Our data suggested that caspase-3 has a critical role in modulating the PERK/eIF2a pathway after radiation. / Many cancers exhibit multiple deregulations in cell death pathways, allowing for the subsequent promotion of tumor cell survival, and contributing to a relatively low response rate to therapies based on the use of pro-apoptotic strategies. As we have showed, there is a potential for novel anticancer strategies to overcome resistant cancer cells with defective apoptosis machinery in order to improve overall therapeutic outcomes. Such novel approach is to drive cancer cells towards autophagy, as demonstrated by our experiments that studied the effect of radiation on the induction of autophagy in caspase-deficient models. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

This thesis describes the work that I have carried out in the Laboratory of Neurophysiolgy at the Université Libre de Bruxelles, under the supervision of Prof. Serge Schiffmann, in collaboration with Prof. Stéphane Schurmans of Université of Liège.The work is divided in two distinct but related projects and the results section is thus divided into two main chapters. The results described are presented in the form of two manuscripts, the first chapter is named “Ciliary phosphoinositides regulation by INPP5E controls Shh signaling by allowing trafficking of Gpr161 in neural stem cells primary cilium”.The second is named “Regulation of phosphoinositides ciliary levels controls trafficking and ciliogenesis in ependymal cells”.Since both manuscripts are comprehensive regarding the results, and methods, these are inserted as such into the thesis.An expanded introduction to the field, placing the results into context, precedes these two chapters. An extended discussion section follows each chapter; it presents some elements of discussion not included in the manuscripts, the implications of the results and the scope for further research. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ces dernières décennies, les populations, civiles en général et professionnelles en particulier, ont été soumises à une exposition croissante aux champs électriques (EF) et magnétiques (MF) d'extrêmement basses fréquences (ELF). Différentes réponses biologiques ont été observées sur différents types de cellules et de tissus exposés à des courants et des champs ELF. Ces études permettent une meilleure connaissance de notre environnement électromagnétique mais les mécanismes biologiques précis et les implications des fréquences ELF sur la santé restent peu connus. Il est nécessaire de développer des protocoles de recherche pour répondre à ces questions. La revue exhaustive de la littérature met clairement en avant :- le manque de connaissance des mécanismes cellulaires activés après stimulation ELF;- l'importance de leur étude pour toutes recherches liées à l'utilisation de la stimulation ELF;- l'efficacité des techniques omiques qui permettent l'identification de ces mécanismes cellulaires;- l'importance du choix des modèles expérimentaux utilisés afin de faciliter l'extrapolation des résultats chez l'homme.Pour répondre à ces observations, nous avons recherché les gènes et les mécanismes cellulaires impliqués lors de la stimulation ELF sur un modèle de culture d'explants de kératinocytes humains mis en culture sur support dermique dévitalisé et stimulé par un courant électrique pulsé. Nous pensons que la recherche sur un modèle humain in vitro permet d'obtenir des résultats plus intéressants pouvant être extrapolés plus facilement aux études épidémiologiques ou cliniques.Les résultats préliminaires obtenus sur ce modèle de culture par Hinsenkamp et al. aboutissent à la même conclusion que leurs études des effets des champs sur le tissu osseux. Ils ont observés à partir de différents modèles, une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des tissus embryonnaires. Les analyses microarrays ont été réalisées sur 288 explants d'épiderme provenant de 3 cultures cellulaires indépendantes utilisant l'épiderme de 3 sujets différents. La première analyse des résultats montre que, pour un certain nombre de sondes, la valeur du taux d'expression est différente lorsque l'on compare deux à deux les conditions d'échantillonnage. Cette observation est valable pour l'évolution naturelle au cours du temps des cultures témoins (J4T/J1T :296 sondes; J7T/J1T :702 sondes; J12T/J1T :1006 sondes) ou des cultures stimulées (J4S/J1T :941 sondes; J7S/J1T :625 sondes; J12S/J1T :946 sondes) ainsi que pour la comparaison d'un temps stimulé à son temps témoin (J4S/J4T :304 sondes; J7S/J7T :220 sondes; J12S/J12T :496 sondes).L'analyse de l'évolution des résultats au cours du temps (comparaison de Jx à J1) pour le groupe témoin et stimulé montre que, si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation n'est généralement pas suffisante pour statistiquement inverser le sens de la régulation naturellement observée dans le temps. Seuls 3 gènes (EPS8, ADAMTS1, NOS1) ne suivent pas cette règle.De plus, la comparaison des listes de gènes aux 3 temps d'échantillonnage J4, J7 et J12, montre que 3 gènes sont systématiquement exprimés dans les trois groupes stimulés comparés à leur témoin respectif :TXNRD1, ATF3 et MME. Ils sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation et la mitose. L'analyse du rôle joué par DKK1 et MACF1 au temps J4 montre que la sur-expression de DKK1 et la sous-expression de MACF1 ont pour effet l'inhibition du "pathway Wnt" ce qui provoque une diminution de la prolifération et une augmentation de la différenciation terminale. Parmi les variations intéressantes, BMP-2 est sur-exprimée au temps J12. Cette protéine est connue pour jouer un rôle important dans l'ostéogenèse, l'angiogenèse et la maturation cellulaire.Une analyse par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-expression de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé), auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. Parmi ces gènes, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération et la différenciation; UBE2D3 est actif dans la voie de signalisation de la BMP-2; les autres gènes sont actifs dans la mitose, le développement cellulaire et la réplication de l'ADN.Nous avons ensuite utilisé des outils informatiques qui permettent une analyse sans apriori des résultats :L'analyse du graphe orienté acyclique généré par WebGestalt sur base des données de GO a mis en évidence les processus biologiques impliquant les gènes présents dans nos résultats et dont la régulation a été modifiée. Ces gènes ont des fonctions dans les mécanismes du cycle cellulaire, de la mitose, de la prolifération ou de la différenciation. Ces résultats sont cohérents avec les résultats macroscopiques précédents et les premières observations présentées ci-dessus.Pour mettre en évidence les voies de signalisation actives dans les processus biologiques, nous avons utilisé KEGG qui indique que les voies "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" utilisent un nombre statistiquement significatif de gènes présents dans nos résultats. Le cycle cellulaire et la mitose sont impliqués dans la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque ce sont les cellules filles qui deviendront des cellules matures. La "voie de signalisation p53" est également active dans le cycle cellulaire, la différenciation, l'apoptose et le maintien de l'intégrité cellulaire. L'analyse des voies connexes à "p53" et à "cycle cellulaire", utilisant des gènes présents dans nos résultats, a mis en avant plusieurs cascades dont certaines utilisent des gènes actuellement connus pour n'avoir de rôle que dans une seule cascade. Ces gènes sont des candidats potentiels à la fonction de marqueur de la stimulation ELF. On y retrouve entre autre FoxO :régulé par JNK (membre des MAPK), actif avec TGF-β1 dans la migration cellulaire et la diminution de l'apoptose; Jak/STAT qui active la voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utile lors de la prolifération, différenciation, migration, apoptose et survie cellulaire; Wnt qui régule la prolifération, la différenciation ainsi que la mobilité cellulaire. D'autres voies d'intérêt mais n'utilisant pas de gène ayant une fonction unique ont été listées :PI3K/Akt, en partie régulée par la phosphorylation de FoxO, a une fonction dans la prolifération cellulaire.Les différentes analyses réalisées avec Pathway studio confirment qu'une grande majorité des gènes présents dans nos résultats sont actifs dans les processus de prolifération, différenciation, croissance cellulaire, cycle cellulaire, mitose, apoptose, migration et survie cellulaire. Plusieurs gènes et mécanismes discutés précédemment (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) ont été isolés par le programme. La recherche des mécanismes utilisant les gènes isolés lors de l'analyse par triangulation les relie à la prolifération, la différenciation, l'adhésion cellulaire, la réplication de l'ADN et la mort cellulaire.Pathway Studio nous a permis de localiser dans la cellule les protéines qui devraient finalement être traduites suite à la modification de l'expression de leurs gènes. Cette analyse permet d'étudier les interactions entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule ainsi que rechercher les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. La protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET-1), codée par le gène EDN1, agit sur 9 protéines membranaires différentes :EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK; PDGFRA; GLUT-3 (exprimé à partir du gène SLC2A3); COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2); EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4); PLAUR et les gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduits en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers les protéines membranaires différentes. L'analyse des résultats met en évidence 840 interactions entre une protéine extracellulaire et une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Les protéines membranaires recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires sont EGFR et FAS. C'est également EGFR, une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire, qui transmet le plus d'informations aux protéines cytoplasmiques. FAS est capable de réguler l'apoptose et la prolifération en fonction du taux de fixation de son ligand.A l'aide d'un screening par la technique des microarrays de l'expression des gènes réalisé sur des échantillons témoins et stimulés, nous avons :- vérifié la cohérence des résultats avec les études historiques;- mis en évidence les processus biologiques responsables de la réponse cellulaire observée;- isolé une liste de gènes "marqueurs potentiels" impliqués spécifiquement dans ces mécanismes:- vérifié l'hypothèse que la stimulation ELF accélère dans le temps l'apparition de phénomènes qui seraient apparus naturellement mais avec une latence plus longue.Les observations faites dans le cadre de cette étude ont mis en évidence un nombre important d'informations. Plusieurs d'entre elles nécessitent des recherches complémentaires afin de préciser et de confirmer les résultats. Il serait intéressant :- de comparer et de grouper les résultats de la littérature montrant des effets similaires même si la stimulation ou le modèle de culture sont différents;- de développer les techniques de microdosimétrie afin de connaître avec précision la stimulation reçue par la cellule;- de développer l'étude des signaux afin de découvrir la composante active qui déclenche la réaction de la cellule;- de mettre en place un protocole étudiant la voie métabolique Wnt sur des cellules sanguines en incluant un dosage de la β-caténine pour étudier l'effet de la stimulation sur la leucémie infantile. Il faudra vérifier que les gènes exprimés dans nos résultats soient finalement traduits en protéines actives afin de confirmer leur rôle comme marqueurs de la stimulation ELF. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cancer est un groupe de maladies génétiques opérationnellement défini par uneprolifération cellulaire incontrôlée, impliquant une défaillance del'homeostasie de l'organisme. La recherche sur le cancer vise à fournir desoutils diagnostics précis et des traitements ajustés pour chacune de cesmaladies. La technologie microarray permet la quantification de l'expression detous les produits de transcription du génome humain et constitue donc un outilpour mieux comprendre la nature polygénique du cancer. La technologiemicroarray permet à la fois de découvrir de nouvelles classes de cancers et deprédire l'issue de maladie en fonction de profils d'expression préalables. Enoutre, l'utilisation de signatures d'expression géniques en tant que marqueursreprésentatifs de certains processus physiologiques moléculaires permetl'emploi de données microarray pour tester des hypothèses biologiques.Cette dissertation a deux objectifs: (a) établir la mesure dans laquelledes marqueurs d'expression génique de la différenciation et de la proliférationcellulaire peuvent contribuer à la classification des maladies cancéreuses; et(b) d'évaluer l'étendue des signaux pronostiques dans les transcriptomescancéreux.Nous avons mis au point une méthode objective pour extraire des signatures dedifférentiation organe-spécifiques à partir de données d'expression génique.Nous avons ensuite démontré qu'une signature génique de différentiationtissu-spécifique est capable de distinguer avec précision entre des sous-typeshistologiques de difficile classification dans un modèle thyroïdien. Ceci faitpreuve du potentiel valeur clinique et diagnostique des signatures dedifférentiation dans le domaine oncologique.Nous montrons aussi qu'une fraction non négligeable des transcriptomes cancéreuxest capable de prédire l'issue des respectives maladies, à la suite d'uneanalyse systématique de 114 cohortes de profiles d'expression cancéreuxenglobant 19 types de cancers différents. Cet observation est probablement liéeà une vaste structure de corrélation parmis les profils d'expression cancéreux,partiellement expliquée par des variables techniques et biologiques. Cetteevidence met en cause l'utilisation généralisée d'associations statistiquesentre des marqueurs d'expression géniques et les issues de chaque maladie parmisplusieurs patients afin d'en déduire l'implication de mécanismes biologiquesparticuliers dans la progression du cancer. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

À ce jour, il est connu que le succès des traitements chimiothérapeutiques, outre l’effet cytotoxique direct sur les cellules tumorales, repose sur la contribution du système immunitaire. Nos travaux de recherche montrent que le traitement au cyclophosphamide de souris DBA/2 porteuses du mastocytome P815 induit le rejet de la tumeur, ainsi qu’une protection à long terme, de façon dépendante de la présence des lymphocytes T CD4+ et CD8+. De plus, le rejet du mastocytome P815 corrèle avec une augmentation de l’infiltration au sein de la tumeur de lymphocytes T CD8+ spécifiques d’un antigène muté. Lors de ce travail, nous avons tenté d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le rejet du mastocytome P815 induit suite à un traitement au cyclophosphamide. Dans ce but, les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène muté, infiltrant un mastocytome P815 en progression ou en régression (suite à un traitement au cyclophosphamide), ont été analysés afin de mettre en évidence des caractéristiques phénotypiques et/ou fonctionnelles associées à ces populations de cellules T CD8+. Le traitement au cyclophosphamide conduit à l’infiltration de lymphocytes T CD8+ effecteurs en phase terminale de différenciation (KLRG1+ CD27- Eomes+ Perforin+) au sein de la tumeur, alors que les lymphocytes T CD8+ présents dans le microenvironnement tumoral du mastocytome P815 en progression possèdent un phénotype de cellules dysfonctionnelles (PD-1+ LAG-3+ Ki67-). Les IFN-I sont impliqués, au moins partiellement, dans l’acquisition du phénotype effecteur des cellules puisque leur inhibition entraine une augmentation de l’expression du récepteur PD-1.Ces résultats amènent à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le cyclophosphamide régule l’amplitude et la qualité des réponses immunes spécifiques de la tumeur. Outre un effet quantitatif qui se traduit par l’expansion et l’infiltration dans la tumeur de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène muté, cet agent chimiothérapeutique contribue au rejet du mastocytome P815 en favorisant le développement de lymphocytes T CD8+ effecteurs. La compréhension des effets immunomodulateurs d’un traitement chimiothérapeutique présente un intérêt majeur pour l’amélioration des thérapies en oncologie, tant en ce qui concerne l’immunothérapie que les combinaisons de traitement. / An important question is how chemotherapy may (re-)activate tumor-specific immunity. In this study, we provide a phenotypic, functional and genomic analysis of tumor-specific CD8+ T cells in tumor (P815)-bearing mice, treated or not with cyclophosphamide. Our data show that chemotherapy favors the development of effector-type lymphocytes in tumor bed, characterized by higher KLRG-1 expression, lower PD-1 expression and increased cytotoxicity. This suggests re-engagement of T lymphocytes into the effector program since most T cells are dysfunctional in the tumor microenvironment before cyclophosphamide treatment. IFN-I appears involved in this remodelling. Our findings provide some insight into how cyclophosphamide regulates the amplitude and quality of tumor-specific immune responses. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez les vertébrés, le système cardiovasculaire est composé d’un réseau hiérarchisé de vaisseaux sanguins couplés à la pompe cardiaque. Ce système tubulaire se ramifie dans chaque organe afin d’y acheminer l’oxygène et les nutriments et d’éliminer les sous-produits métaboliques. Au-delà de cette fonction ancestrale et malgré sa continuité anatomique, les segments constituant ce système sont fortement hétérogènes, s’adaptant localement à la fonction de chaque organe. Cette spécification organotypique se manifeste le plus distinctement par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un ensemble de propriétés protectrices adoptées par l’endothélium cérébral. Il est établi que tant la formation du système vasculaire cérébral que sa maturation en BHE résultent d’une intense et complexe communication entre le système neural et vasculaire, et que cette communication reste active jusque chez l’adulte.Au cœur de cette thématique, le GPR124, un GPCR d’adhésion orphelin, fut caractérisé à l’entame de ce travail de thèse comme le premier facteur endothélial spécifiquement impliqué dans la vascularisation du système nerveux central chez les mammifères. Malgré cette découverte pionnière pour le domaine, la nature des signaux activant le Gpr124 ainsi que les mécanismes de signalisation de ce récepteur restaient totalement élusifs et ont été explorés au cours de ce travail de doctorat.Nous avons ainsi déterminé que le Gpr124 est requis pour l’activation de la voie Wnt/β-caténine dans l’endothélium cérébral et que cette voie est essentielle à l’angiogenèse cérébrale en contrôlant sélectivement les cellules de tête du bourgeon angiogénique. Nous avons également identifié Reck comme partenaire d’interaction essentiel du Gpr124. Le complexe Gpr124/Reck confère aux cellules la capacité unique de discriminer parmi les différents membres de la famille de ligands Wnt et ainsi de transduire spécifiquement les signaux Wnt7a/b angiogéniques dérivant du système neural.Notre étude a permis de développer un modèle moléculaire et cellulaire intégratif expliquant le contrôle neural de l’invasion vasculaire cérébrale chez les vertébrés. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished