Dans cette thèse, nous proposons un langage formel, le gk-calcul, issu de la famille des algèbres de processus. Ce langage se distingue notamment des langages concurrents habituels par la rupture de la dissymétrie inhérente à la notion d'émetteur et de récepteur traditionnellement considérée. Cette rupture permet alors de voir les interactions entre les éléments du langage comme des phénomènes de collisions, approche bien adaptée aux questions d'auto-organisation qui font l'objet de la première partie de cette thèse.<br /><br />La question qui se pose est celle de la construction concurrente et décentralisée de formes géométriques abstraites (arbres et graphes) ainsi que de phénomènes plus génériques décrits sous forme de transfert d'information dans des systèmes à base de réécriture de graphes, éventuellement hiérarchisés dans l'optique d'une application à la biologie moléculaire. Cette première partie s'accompagne notamment d'une implémentation en Ocaml simulant un algorithme d'auto-assemblage de graphes.<br /><br />Dans un second temps, nous développons un sous-ensemble du langage présenté, en enrichissant une version restreinte aux interactions binaires avec une notion de membrane et d'interactions entre membranes. Ce nouveau langage se montre à même de décrire une biologie moléculaire simplifiée, qualitative, basée sur les interactions entre protéines et membranes. Cette partie de la thèse s'attache alors à montrer la valeur descriptive de ce langage sur quelques exemples et à explorer des définitions pertinentes d'équivalence entre solutions biologiques.

Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu'elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l'analyse du transcriptome d'une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j'ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j'ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l'EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d'expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j'ai par ailleurs validé l'induction transcriptionnelle de l'EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l'EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l'analyse des données de méthylation globale de l'ADN nous a permis d'observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l'ADN et des histones par le succinate, qui s'accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l'extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l'EMT, comme le gène KRT19 (l'un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J'ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d'une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j'ai confirmé l'activation de l'EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m'a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J'ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m'ont permis de conclure à l'implication de la kératine 19 dans les processus d'adhésion, de migration et d'invasion. Cependant je n'ai pas pu expliquer l'ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l'implication d'autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l'activation de l'EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l'inactivation de la succinate déshydrogénase.

Les microARN, ARN courts non codants, jouent un rôle primordial dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes. Une modification d'expression de ces ARN peut donc contribuer à la tumorogenèse et au développement tumoral par dérégulation de l'expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Nous avons souhaité mettre en évidence des signatures spécifiques (i) du phénotype d'invasion des méningiomes et (ii) du phénotype d'aggressivité des gliomes par étude des oligodendrogliomes (gliomes de bas grade) et glioblastomes (gliomes de haut grade). (i) Les profils d'expression des microARN dans des méningiomes invasifs montrent des différences par rapport à ceux des méningiomes non invasifs ; confirmant l'intérêt de ces explorations moléculaires pour une application diagnostique directe. (ii) Dans le cas des gliomes, plusieurs miARN ont été détectés et validés et constituent des signatures spécifiques des gliomes en comparaison aux échantillons contrôles. Certains permettent également une distinction aisée des oligodendrogliomes et glioblastomes. Des études génomiques et épigénétiques ont été menées pour rationaliser, du point de vue de la physiopathologie des cellules, les différences d'expression des miARN entre les différents tissus. Au niveau du protéome, des dérégulations d'expression de cibles des miARN identifiés ont été mises en évidence comme celles de MDH1, SIRT1, STAT3 ou PTBP1, protéines clés de la physiologie cellulaire et nous avons pu décrire des voies moléculaires pertinentes du développement tumoral des gliomes.

De nos jours, le scénario d’une pandémie à l’échelle mondiale est de plus en plus surveillé par l’Organisation mondiale de la santé en plus d’être exploité par le cinéma et les médias à sensations fortes. La réalité est que plusieurs épidémies ont ravagé la population sur terre à travers les époques telle que ce fut le cas lors de l’éclosion de la peste noire au XIV siècle en Europe et en Asie ou encore le VIH en Afrique encore aujourd’hui. La grande majorité des populations étant concentrée dans des mégalopoles et le transport international étant toujours plus développé et accessible rend une simple épidémie susceptible de se transformer rapidement en pandémie. Plus récemment, l’éclosion de la grippe aviaire H5N1 a décimé d’importantes populations d’oiseau en Asie et certains cas de contamination humaine fatale ont même été répertoriés. Comme les virus mutent rapidement, il serait donc pertinent de connaître leurs mécanismes de prolifération et tenter de les maîtriser afin de les neutraliser avant l’éclosion d’une souche se propageant d’humain à humain. Or, il a été découvert qu’une famille d’endoprotéases à sérines, les proprotéines convertases, sont impliquées dans diverses pathologies dont l’influenza-A H5N1. La furine, première proprotéine convertase à avoir été découverte, semble à l’origine de l’activation de ces virus. Nous avons donc choisi d’entreprendre la conception de divers inhibiteurs de furine dans le but de développer un agent antiviral contre cette pathologie. En ayant une approche impliquant la biologie structurelle et en effectuant une conception rationnelle d’inhibiteurs, nous avons développé des inhibiteurs de furine ayant à la fois une bonne affinité pour l’enzyme ainsi qu’une bonne stabilité en milieu biologique, tout en tentant de comprendre les principes fondamentaux de la liaison avec ces enzymes. Nos résultats ont démontré que diverses techniques peuvent être exploitées afin de concevoir des composés pouvant cibler la furine avec une bonne affinité. Le rationnel derrière la conception de ces composés a été démontrée à l’aide d’outils modernes de visualisation tridimensionnels de biomolécules en mettant en évidence les fonctionnalités importantes des complexes enzymes-substrat et enzyme-inhibiteurs afin de bien vulgariser la biologie structurelle inhérente au projet.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a common genetic disorder affecting 1:500 people worldwide, independently from sex and origin. ADPKD is characterized by formation of large bilateral kidney cysts affecting all segments of the nephron and increasing progressively in size and number leading to end stage renal failure by mid-fifty. Moreover, this systemic disease includes several extrarenal symptoms such as intracranial aneurysms, valvular defects and cysts formation in the liver and the pancreas. PKD1 and PKD2 genes mutations are involved in 85 and 15 % of the clinical cases. PKD genes encode polycystin-1 (PC-1) and -2 (PC-2), which both form a complex at the cell and ciliary membrane of renal epithelial cells. PC-1 is a large transmembrane protein with a small intracellular tail including a coiled-coil motif implicated in PC-1/PC-2 interaction in-vitro. Interestingly, specific mutations affecting the coiled-coil motif cause ADPKD in humans. The pathogenetic mechanism of ADPKD is unknown. In mice, both ablation (Pkd1-/-) or overexpression (SBPkd1TAG) of Pkd1 cause ADPKD, suggesting a dosage model. Ciliary anomalies are also linked to polycystic kidney disease. Herein, we evaluated in-vivo the role of Pkd1 in the development of renal and extrarenal manifestations of ADPKD and more specifically, the role of the coiled-coil motif in cystogenesis. We generated two constructions, wildtype Pkd1 (Pkd1TAG) and coiled-coil deleted Pkd1 (Pkd1ΔCoiled-coil), by homologous recombination from the wildtype Pkd1-BAC comprising the whole Pkd1 murine sequence. Three Pkd1TAG mice lines have been generated by microinjection and show expression patterns correlating with the copy number of the transgene (2, 5 and 15 copy). All Pkd1TAG mice develop renal cysts affecting all nephron segments as in ADPKD and longer primary cilia compared to wildtype mice. Physiologic analysis supports renal failure by increased urinary output and decreased of urinary proteins, osmolality and creatinin levels. Pkd1TAG mice also show cysts in the liver, cardiac and valvular anomalies associated with calcium deposition and cerebral aneurysms. The severity of the phenotype increased with Pkd1 expression suggesting a dosage model. Importantly, the Pkd1TAG transgene rescue embryonic lethality of Pkd1-/- mice. Furthermore, we generated 4 lines of Pkd1ΔCoiled-coil mice of 2 and 15 copies of the transgene correlating also to the level of expression. Compared to age-matched Pkd1TAG, Pkd1ΔCoiled-coil mice develop no cysts and show normal cilia length. To gain more insights on the role of coiled-coil motif in absence of endogenous Pc-1, we mated Pkd1ΔCoiled-coil with Pkd1-/- mice. Compared to the lethal embryonic Pkd1-/- mice, Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- live ~ 10 to 14 days. They show severe renal and pancreatic cysts as well as growth retardation and pulmonary defects. My study demonstrates that Pkd1 overexpression is a pathogenic mechanism to induce ADPKD renal and extrarenal phenotype. Moreover, this work shows that the coiled-coil motif of polycystin-1 is a critical determinant in ADPKD cystogenesis.

Le morphogène Sonic hedgehog (Shh) est requis pour le guidage axonal des neurones commissuraux lors du développement de la moelle épinière, phénomène impliquant des événements de réorganisation du cytosquelette d’actine. Bien qu’il soit généralement admis que le cytosquelette d’actine soit régulé via les petites GTPases de la famille Rho, un effet de Shh sur ces protéines n’a jamais été observé dans aucun contexte physiologique. Nous démontrons que Shh active les petites GTPases Rac1 et Cdc42 et que cette activation est rapide et donc, compatible avec les effets de guidage induits par Shh sur les neurones commissuraux. En parallèle, nous avons étudié l’activation de la protéine Boc, qui est un récepteur de Shh requis pour le guidage axonal des neurones commissuraux. Ces résultats contribuent à raffiner notre compréhension de la transduction cellulaire induite par Shh lors du guidage axonal des neurones commissuraux. / Sonic hedgehog (Shh) is required for axon guidance of commissural neurons during spinal cord development, which involves reorganization of the actin cytoskeleton. Even if it is known that this process is regulated by small Rho GTPases, an effect of Shh on these proteins has not been clearly demonstrated. In this study, we show that Shh activates the small GTPases Rac1 and Cdc42. This activation occurs rapidly, which is compatible with the guidance effects of Shh on commissural neurons. In parallel, we characterized the Shh-dependent activation of Boc, which is a Shh receptor required for commissural axon guidance. Taken together, these results help refine our understanding of the signal transduction mediated by Shh during axon guidance of commissural neurons.

Les évènements moléculaires en amont et en aval de la petite GTPase Rac1 menant à la migration cellulaire sont encore mal compris. La première partie du projet consiste à utiliser une approche protéomique non-biaisée pour tenter d’identifier les partenaires de Rac. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de purification efficace et rapide de manière à maintenir les complexes protéiques transitoires intacts. Dans un deuxième temps, nous avons identifié des sites de phosphorylation sur la RacGEF atypique Dock5 en aval des intégrines. Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation de cette protéine, nous avons criblé une banque de kinases ce qui nous a permis d’identifier 14 kinases pouvant phosphoryler la région PXXP de Dock5. D’après nos résultats, ceci aurait comme effet de diminuer l’interaction entre Dock5 et ses partenaires contenant des domaines SH3. Ainsi, la phosphorylation de Dock5 régulerait la formation de complexes et le recrutement de Dock5 par des protéines adaptatrices. / The molecular events upstream and downstream of Rac leading to cell migration and still to date not fully understood allthough more than 20 effectors have been identified for this GTPase. The first part of our project is to use a non-biased proteomic approach to try to identify novel binding partners of Rac1. In order to do so, we developped a novel purification strategy that enabled us to purify Rac and its binding partners in a timely manner. The second part of our project is to understand the role of Dock5 phosphorylation downstream of the integrins. We identified phosphorylated residues in the PXXP region of the atypical RacGEF upon fibronectin stimulation and found 14 kinases able to phosphorylate this region. According to our results, Dock5 phosphorylation does not affect its GEF activity but diminishes its interaction with various SH3 domain-containing proteins. Thus, our data suggest that Dock5 phosphorylation would regulate complex formation and recruitment of this protein by adaptor proteins.

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate. / The relationship between obesity and cancer, although established by epidemiological studies, remains relatively unknown. However, about 25 % of cancers could be attributed to obesity. Among cancers that are affected by obesity, colon cancer, post-menopausal breast cancer and prostate cancer are the more frequent. Studies on animal models have suggested a positive association between high fat diets and de development of mammary and prostate cancer. We have studied the molecular mechanisms by which fatty acids influence breast and prostate cancer cells fate. This work has shown that unsaturated fatty acids, including oleate, can induce cellular proliferation while saturated fatty acids, including palmitate, reduce proliferation. An oleate treatment stimulates lipid droplets formation in the cytoplasm of breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145 while a palmitate treatment induces apoptosis. The action mechanism of oleate on proliferation was studied more closely. Using pharmacological inhibitors, we determine that oleate-induced cell proliferation involves PI3K/Akt signaling pathway, ERK1/2 signaling pathway and the activation of one or many G protein coupled receptor(s) (GPCR). Oleate induces rapid Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145. In the last few years, two GPCRs were identified as being activated by medium and long chain fatty acids, GPR40 and GPR120. GPR40 being expressed in many breast and prostate cancer cell lines while GPR120 expression was null in most cell lines tested, we studied the role of GPR40 in oleate-induced proliferation. Human epithelial mammary cells in primary culture did not express GPR40 nor GPR120 and failed to respond to oleate-induced cell proliferation or activation of signaling pathways. Akt and ERK1/2 signaling pathways activation by oleate in MDA-MB-231 and DU145 cells is potentiated by GPR40 over-expression and inhibited by the use of an siRNA directed against that receptor. However, oleate-induced cell proliferation does not seem to be affected by the presence of the siRNA directed against GPR40. Oleate being a fatty acid, it can enter cells freely by crossing the plasma membrane and part of its effects on proliferation could be attributed to its metabolism. A GPR40 agonist, GW9508, is able to activate GPR40 without entering the cells nor activating oleate’s metabolism. GW9508 stimulates Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145, but does not induce cell proliferation as does oleate. These results help us to understand the action mechanism of oleate in breast and prostate cancer cells. Oleate induces GPR40 signalization which is involved in the rapid Akt and ERK1/2 signaling pathways activation. On the other hand, oleate-induced cell proliferation is carried out by a GPR40-independent mechanism, possibly linked to oleate’s metabolism.

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / The eukaryotic translation initation factor eIF4E (4E) is a potent oncogene due to its ability to facilitate export and/or translation of certain transcripts, many of which are, themselves, oncogenes. 4E has many protein-binding partners including the 4E transporter protein (4ET). The ability to alter the subcellular localization of 4E via 4E-T could offer a mechanism by which to alter the oncogenic potential of a cell. Overexpression of 4E-T in osteosarcoma cells leads to formation of larger and more numerous P-bodies that can effectively colocalize with 4E than either a vector control (E) or a less efficient 4E-binding version of 4E-T (Y30A). However, the overexpression of 4E-T did not affect the 4E’s function as determined by examining global levels of transcription, polysome profile, cytoplasmic/nuclear distribution, or protein levels of most of the transcripts tested. The observation that there was cytoplasmic enrichment and reduced loading of ribosomes on cyclin D1 and ODC transcripts (polysome profile) in the 4ET line suggests a possible 4ETmediated cytoplasmic sequestration of certain transcripts by an as yet to be determined mechanism.

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.