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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a common genetic disorder affecting 1:500 people worldwide, independently from sex and origin. ADPKD is characterized by formation of large bilateral kidney cysts affecting all segments of the nephron and increasing progressively in size and number leading to end stage renal failure by mid-fifty. Moreover, this systemic disease includes several extrarenal symptoms such as intracranial aneurysms, valvular defects and cysts formation in the liver and the pancreas. PKD1 and PKD2 genes mutations are involved in 85 and 15 % of the clinical cases. PKD genes encode polycystin-1 (PC-1) and -2 (PC-2), which both form a complex at the cell and ciliary membrane of renal epithelial cells. PC-1 is a large transmembrane protein with a small intracellular tail including a coiled-coil motif implicated in PC-1/PC-2 interaction in-vitro. Interestingly, specific mutations affecting the coiled-coil motif cause ADPKD in humans. The pathogenetic mechanism of ADPKD is unknown. In mice, both ablation (Pkd1-/-) or overexpression (SBPkd1TAG) of Pkd1 cause ADPKD, suggesting a dosage model. Ciliary anomalies are also linked to polycystic kidney disease. Herein, we evaluated in-vivo the role of Pkd1 in the development of renal and extrarenal manifestations of ADPKD and more specifically, the role of the coiled-coil motif in cystogenesis. We generated two constructions, wildtype Pkd1 (Pkd1TAG) and coiled-coil deleted Pkd1 (Pkd1ΔCoiled-coil), by homologous recombination from the wildtype Pkd1-BAC comprising the whole Pkd1 murine sequence. Three Pkd1TAG mice lines have been generated by microinjection and show expression patterns correlating with the copy number of the transgene (2, 5 and 15 copy). All Pkd1TAG mice develop renal cysts affecting all nephron segments as in ADPKD and longer primary cilia compared to wildtype mice. Physiologic analysis supports renal failure by increased urinary output and decreased of urinary proteins, osmolality and creatinin levels. Pkd1TAG mice also show cysts in the liver, cardiac and valvular anomalies associated with calcium deposition and cerebral aneurysms. The severity of the phenotype increased with Pkd1 expression suggesting a dosage model. Importantly, the Pkd1TAG transgene rescue embryonic lethality of Pkd1-/- mice. Furthermore, we generated 4 lines of Pkd1ΔCoiled-coil mice of 2 and 15 copies of the transgene correlating also to the level of expression. Compared to age-matched Pkd1TAG, Pkd1ΔCoiled-coil mice develop no cysts and show normal cilia length. To gain more insights on the role of coiled-coil motif in absence of endogenous Pc-1, we mated Pkd1ΔCoiled-coil with Pkd1-/- mice. Compared to the lethal embryonic Pkd1-/- mice, Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- live ~ 10 to 14 days. They show severe renal and pancreatic cysts as well as growth retardation and pulmonary defects. My study demonstrates that Pkd1 overexpression is a pathogenic mechanism to induce ADPKD renal and extrarenal phenotype. Moreover, this work shows that the coiled-coil motif of polycystin-1 is a critical determinant in ADPKD cystogenesis.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a common genetic disorder affecting 1:500 people worldwide, independently from sex and origin. ADPKD is characterized by formation of large bilateral kidney cysts affecting all segments of the nephron and increasing progressively in size and number leading to end stage renal failure by mid-fifty. Moreover, this systemic disease includes several extrarenal symptoms such as intracranial aneurysms, valvular defects and cysts formation in the liver and the pancreas. PKD1 and PKD2 genes mutations are involved in 85 and 15 % of the clinical cases. PKD genes encode polycystin-1 (PC-1) and -2 (PC-2), which both form a complex at the cell and ciliary membrane of renal epithelial cells. PC-1 is a large transmembrane protein with a small intracellular tail including a coiled-coil motif implicated in PC-1/PC-2 interaction in-vitro. Interestingly, specific mutations affecting the coiled-coil motif cause ADPKD in humans. The pathogenetic mechanism of ADPKD is unknown. In mice, both ablation (Pkd1-/-) or overexpression (SBPkd1TAG) of Pkd1 cause ADPKD, suggesting a dosage model. Ciliary anomalies are also linked to polycystic kidney disease. Herein, we evaluated in-vivo the role of Pkd1 in the development of renal and extrarenal manifestations of ADPKD and more specifically, the role of the coiled-coil motif in cystogenesis. We generated two constructions, wildtype Pkd1 (Pkd1TAG) and coiled-coil deleted Pkd1 (Pkd1ΔCoiled-coil), by homologous recombination from the wildtype Pkd1-BAC comprising the whole Pkd1 murine sequence. Three Pkd1TAG mice lines have been generated by microinjection and show expression patterns correlating with the copy number of the transgene (2, 5 and 15 copy). All Pkd1TAG mice develop renal cysts affecting all nephron segments as in ADPKD and longer primary cilia compared to wildtype mice. Physiologic analysis supports renal failure by increased urinary output and decreased of urinary proteins, osmolality and creatinin levels. Pkd1TAG mice also show cysts in the liver, cardiac and valvular anomalies associated with calcium deposition and cerebral aneurysms. The severity of the phenotype increased with Pkd1 expression suggesting a dosage model. Importantly, the Pkd1TAG transgene rescue embryonic lethality of Pkd1-/- mice. Furthermore, we generated 4 lines of Pkd1ΔCoiled-coil mice of 2 and 15 copies of the transgene correlating also to the level of expression. Compared to age-matched Pkd1TAG, Pkd1ΔCoiled-coil mice develop no cysts and show normal cilia length. To gain more insights on the role of coiled-coil motif in absence of endogenous Pc-1, we mated Pkd1ΔCoiled-coil with Pkd1-/- mice. Compared to the lethal embryonic Pkd1-/- mice, Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- live ~ 10 to 14 days. They show severe renal and pancreatic cysts as well as growth retardation and pulmonary defects. My study demonstrates that Pkd1 overexpression is a pathogenic mechanism to induce ADPKD renal and extrarenal phenotype. Moreover, this work shows that the coiled-coil motif of polycystin-1 is a critical determinant in ADPKD cystogenesis.

Miriam Scheller Therapeutischer Effekt von Rapamyzin auf die Entwicklung der polyzystischen Nierenerkrankung in der PKD2-mut-Ratte Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und Zentrum für Medizinische Forschung der medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg Eingereicht in 2017 (100 Seiten, 43 Abbildungen, 42 Tabellen, 189 Literaturangaben, 1 Anhang) Schlüsselwörter: ADPKD, PKD2-mut-Ratte, Rapamyzin, Zystenniere Die autosomal dominant vererbte polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist die am häufigsten vorkommende genetisch bedingte Nierenerkrankung mit einem Auftreten von 1:500 bis 1:1000 bei Neugeborenen. In 85 % der Fälle liegt eine Mutation im PKD1-Gen auf Chromosom 16 und in 15% der Fälle eine Mutation des PKD2-Gens auf Chromosom 4 vor. Es kommt zu einer Volumenzunahme der Nieren infolge multipler Zysten, vor allem in den proximalen Tubuli, sowie einer interstitiellen Fibrose mit Entzündungszellinfiltration. Desweiteren kann es zu extrarenalen Zysten, vor allem in Leber, Pankreas und Hoden, kommen, ebenso können sich auch intrakranielle Aneurysmen und Herzklappenanomalien ausbilden. Die Nierenfunktion verschlechtert sich progressiv und führt meist in einem Lebensalter von 60 Jahren zu einem terminalen Nierenversagen. Ziel der vorliegenden Studie war es, den therapeutischen Effekt von Rapamyzin auf die Entwicklung der ADPKD in der PKD2-mut-Ratte zu untersuchen und zu klären, ob es einen Therapieerfolg im Vergleich der männlichen und weiblichen Früh- und Spättherapierten und deren Kontrollgruppen gab, und falls ja, ob dieser auch noch nach 2 Monaten Therapiepause bestand. Darüber hinaus sollte geklärt werden, ob eine Geschlechtsdisposition vorlag. Die PKD2-mut-Ratten (n=77) wurden in 10 Gruppen aufgeteilt, die sich in Therapietiere, darunter männliche und weibliche Früh- (mit und ohne Pause) und Spättherapierte, und in deren Kontrollgruppen aufsplitteten. Alle Frühtherapierten erhielten ab Lebenswoche (LW) 3 über einen Zeitraum von 5 LW 0,3 mg/kg KG/d Rapamyzin per os. Den Spättherapierten wurde nach Ablauf des 3. Lebensmonats über einen Zeitraum von 5 LW die gleiche Dosis appliziert. Die Kontrollgruppen erhielten zeitlich entsprechend ein Vehikel. Während der Versuchszeit wurden von allen Tieren an 2 bzw. 3 Zeitpunkten, folgende Parameter zur Evaluierung der Nierenfunktion bestimmt: Blut- (Harnstoff, Kreatinin, Kalzium, Phosphat, Protein, Kalium, Natrium, GOT, GPT, ALP, Cholesterin und Glukose im Plasma) und Urinproben (Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und Exkretion) und Erhebung von Stoffwechselkäfigdaten (Körpergewicht, Kot- und Urinvolumen/24h, Futter- und Wasseraufnahme/24h). Für den statistischen Teil wurde das Programm SAS (Version 9.1, SAS Institut, Cary, NC) verwendet. Nach Ablauf der Versuchsdauer in LW 8 (Frühtherapierte) bzw. LW 17 (Frühtherapierte mit Pause und Spättherapierte) fand eine histologische Beurteilung der mit HE- und Azan-Färbung gefärbten Gewebeschnitte, und eine Einteilung mittels eines Gradings bezüglich des Entzündungsgrades, dem Grad der Fibrose (in Mark, Rinde und Übergangsbereich) und der Zystenausprägung (Zystenanzahl und -fläche) statt. Es stellte sich heraus, dass Rapamyzin weder zu einer statistisch signifikanten Reduktion von Harnstoff und Kreatinin im Plasma noch zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und Reduktion der Exkretion über den Urin führte. Insgesamt waren die Resultate der Nierenfunktionsparameter bei den Spättherapierten besser als bei den Frühtherapierten. Nicht korrelierend hierzu, hatten die Frühtherapierten mit Pause weniger Zysten, ein geringeres Nierengesamtgewicht und eine deutlich geringer ausgeprägte Fibrose in den Nieren als die Spättherapierten, die Ergebnisse waren ebenfalls nicht statistisch signifikant. Mit einzelnen Ausnahmen kam es bei allen zu einem Anstieg von Harnstoff und Kreatinin im Plasma, zu einer Abnahme der Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und einer Zunahme der Harnstoff- und Kreatinin-Exkretion, das heißt einer Progression der PKD. Die Mittelwerte genannter Parameter der Therapietiere waren bis auf wenige Ausnahmen geringgradig schlechter als die der Kontrollgruppen, lagen aber immer noch im Normbereich (abgesehen von einzelnen Spättherapierten), was bedeutet, dass die Nierenfunktion bis zum Versuchsende in der 8. bzw. 17. LW noch nicht eingeschränkt war. Die z.T. über den Versuchsverlauf stagnierenden oder auch im Vergleich mit den Kontrolltieren statistisch signifikant besseren Ergebnisse bei den Spättherapierten lassen Rückschlüsse zu, dass der Wirkstoff Rapamyzin bei einer Langzeitbehandlung einen positiven Einfluss auf das Voranschreiten der PKD haben könnte. Grundsätzlich zeigte sich erwartungsgemäß, dass bei sämtlichen untersuchten Parametern, sowohl im Plasma und Urin als auch histologisch, eine deutliche Geschlechtsdisposition bestand, die einen schwereren Krankheitsverlauf bei den Männchen belegte. Ebenso konnte die bekannte negative Körpergewichtsentwicklung durch Rapamyzin belegt werden. In keinem Tier wurden Zysten bzw. eine fibrotische Umgestaltung der Leber nachgewiesen, was die Frage offen lässt, ob es in diesem Ratten-Stamm zu keiner Ausprägung extrarenaler Zysten kommt oder womöglich Rapamyzin hierauf einen positiven Effekt hatte. Zusammenfassend sollten die Ergebnisse jedoch kritisch betrachtet werden, da eine starke Variabilität der PKD-Ausprägung bestand und die Frage der statistischen Signifikanz bei vorliegender Gruppengröße bedingt fraglich ist.

Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation und Assoziation nierenpathogener Gen-Varianten mit dem klinischen Phänotyp einer chronischen Niereninsuffizienz (CKD) durch chronisch tubulo-interstitielle Nephritis (CIN) unbekannter Ursache bei Erwachsenen. Die Auswahl der Studienkohorte erfolgte anhand festgelegter histologischer und klinischer Kriterien (prädominante CIN unklarer Ursache), die sich in 52 von 785 Biopsie-Befunden aus den Jahren 1983 bis 2013 finden ließen. Insbesondere aufgrund fehlender Kontaktierbarkeit infolge des langen Beobachtungszeitraums konnten letztlich 10 der 52 Probanden rekrutiert und in die genetische Analyse inkludiert werden. Nach der Durchführung einer Exom-Sequenzierung wurden die Rohdatensätze jedes einzelnen Probanden auf ausschließlich seltene Varianten gefiltert. Der verbliebene Datensatz wurde dann auf seltene Varianten in 199 bekannten mit hereditären Nephropathien assoziierten Gene hin untersucht (virtuelles CKD-Genpanel). Zunächst konzentrierten wir uns auf Gene die mit tubulo-interstitiellen Nephropathien assoziiert sind (NPHP-RC, ARPKD, ADTKD). Im weiteren Verlauf inkludierten wir Gene für glomeruläre Nephropathien (FSGS und COL4-Nephropathie/Alport-Syndrom) und kongenitale Nierenanomalien (CAKUT). Die dabei detektierten genetischen Varianten wurden auf mögliche Pathogenität anhand der ACMG-Klassifizierung final bewertet. Daraus resultierten bei vier Probanden insgesamt fünf wahrscheinlich pathogene Varianten der ACMG-Klasse 4 und 5 (pathogenic, likely pathogenic) in den Genen NPHS2, COL4A4, COL4A3 und DSTYK. Die diagnostisch bedeutsamen Varianten wurden in der Literatur bereits im Zusammenhang mit hereditäre FSGS, Kollagen-IV-Nephropathie und CAKUT beschrieben. Bei einem Probanden (A5204) mit pathogenen Varianten im NPHS2-Gen konnten wir mittels Segregationsanalyse der Eltern den klinischen Phänotyp eindeutig zuordnen. Des Weiteren konnten wir 12 Varianten unklarer Signifikanz (VUS) bei insgesamt sechs Probanden ausfindig machen, welche sich teilweise in funktionell bedeutsamen Genregionen befinden. Hier zu nennen sind insbesondere die gefundenen VUS-Varianten in den Genen TNXB und FN1, die eine Pathogenität nahelegen, deren Bedeutung aber für die Entwicklung einer chronischen Niereninsuffizienz in der vorliegenden Studie nicht abschließend beurteilt werden konnte. Zusammenfassend demonstriert diese Arbeit die häufig fehlende Übereinstimmung von histologischen Diagnosen (vordergründig tubulo-interstitielle Nephropathie) und genetischen Diagnosen (vordergründig glomeruläre Nephropathie) in der Abklärung einer chronischen Niereninsuffizienz. Insbesondere zeigt sich in der vorliegenden Arbeit der Wert einer breiten genetischen Analyse zur genaueren ätiologischen Abklärung von CKD-Patienten mit unspezifischen nephropathologischen Veränderungen, wie der der chronisch-interstitiellen Nephritis.:1 Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................................... 1 2 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................... 3 3 Einführung ....................................................................................................................................... 6 3.1 Chronische Niereninsuffizienz (CKD) ...................................................................................... 6 3.1.1 Bedeutung der Nierenbiospie ......................................................................................... 8 3.1.2 CIN – chronische interstitielle Nephritis .......................................................................... 9 3.2 Hereditäre chronische Nephropathien .................................................................................. 9 3.2.1 Hereditäre tubulo-interstitielle Nephropathien ............................................................ 11 3.2.1.1 Nephronophthise (NPHP) / Nephronophthise-assoziierte Ziliopathien .................... 11 3.2.1.2 ADPKD – autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung ........................... 14 3.2.1.3 ARPKD – autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung ............................... 15 3.2.1.4 ADTKD – autosomal dominante tubulo-interstitielle Nierenerkrankung .................. 15 3.2.2 Hereditäre Glomerulopathien ....................................................................................... 16 3.2.2.1 Alport-Syndrom / Syndrom der dünnen Basalmembran (TBMD, TBMN) ................. 16 3.2.2.2 FSGS – fokal segmentale Glomerulosklerose ............................................................ 17 3.2.3 CAKUT ............................................................................................................................ 17 4 Aufgabenstellung .......................................................................................................................... 18 5 Material und Methoden ............................................................................................................... 19 5.1 Studienaufbau ....................................................................................................................... 19 5.1.1 Nierenbiopsien und histologischer Befund ................................................................... 19 5.1.2 Auswahl und Rekrutierung der Probanden ................................................................... 19 5.2 Exom-Sequenzierung ............................................................................................................ 20 5.2.1 Definition und Bedeutung ............................................................................................. 20 5.2.2 Durchführung des WES .................................................................................................. 21 5.2.3 Zu untersuchende Gene ................................................................................................ 21 5.3 Filterung und Analyse genetischer Varianten...................................................................... 24 5.3.1 Filterkriterien für Rohdatensätze .................................................................................. 24 5.3.2 Prädiktionstools für genetische Varianten .................................................................... 27 5.3.3 Mutationsdatenbank (HGMD) ....................................................................................... 28 5.3.4 ACMG-Klassifizierungssystem ....................................................................................... 28 6 Ergebnisse ..................................................................................................................................... 29 6.1 WES-Datenqualität ............................................................................................................... 29 6.2 Ergebnisse anhand der ACMG-Klassifizierung ..................................................................... 31 6.2.1 Genetische Varianten der Klasse 4 und 5 (pathogen und wahrscheinlich pathogen) .. 31 6.2.2 Genetische Varianten der Klasse 3 (VUS) ...................................................................... 36 7 Diskussion ..................................................................................................................................... 43 8 Zusammenfassung ........................................................................................................................ 49 9 Literaturverzeichnis ...................................................................................................................... 51 10 Anlagen ......................................................................................................................................... 57 10.1 Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 57 10.2 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... 57 11 Selbstständigkeitserklärung ......................................................................................................... 58 12 Lebenslauf 13 Danksagung

Background: Complications related to peritoneal dialysis (PD) in patients with autosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD), including intraperitoneal rupture of renal cyst, hernia, membrane failure and peritonitis, have been reported. However, long-term clinical outcomes of ADPKD patients on PD remain unclear. We performed this meta-analysis to assess the risks of death, technique failure and peritonitis in ADPKD patients on PD. Methods: A systematic review was conducted using MEDLINE, EMBASE and Cochrane databases from inception to October 2017 to identify studies that evaluated the outcomes of ADPKD patients on PD, including the risks of death, technique failure and peritonitis. Non-ADPKD patients on PD were used as controls. Effect estimates from the individual study were extracted and combined using the random-effect, generic inverse variance method of DerSimonian and Laird. Results: Twelve cohort studies with a total of 14 673 patients on PD (931 ADPKD and 13 742 non-ADPKD patients) were enrolled. Compared with non-ADPKD status, ADPKD was associated with significantly decreased mortality risk with pooled odds ratio (OR) of 0.68 (95% confidence interval (CI), 0.53–0.86; I 2 = 0). There were no associations of ADPKD with the risks of technique failure of PD and peritonitis with pooled OR of 0.93 (95% CI, 0.79–1.10; I 2 = 0) and 0.88 (95% CI, 0.75–1.05; I 2 = 0), respectively. We found no publication bias as assessed by Egger's regression asymmetry test, with P = 0.90, 0.28 and 0.60 for the risks of mortality, technique failure and peritonitis in ADPKD patients on PD, respectively. Conclusion: Compared with non-ADPKD patients on PD, our study demonstrates that ADPKD patients on PD have 0.68-fold decreased mortality risk. There are no associations of ADPKD status with the risks of technique failure or peritonitis.

Background: Autosomal polycystic kidney disease is distinguished into dominant (ADPKD) and recessive (ARPKD) inheritance usually caused by either monoallelic (PKD1/PKD2) or biallelic (PKHD1) germline variation. Clinical presentations are genotype-dependent ranging from fetal demise to mild chronic kidney disease (CKD) in adults. Additionally, exemptions from dominant and recessive inheritance have been reported in both disorders resulting in respective phenocopies. Here, we comparatively report three young adults with microcystic-hyperechogenic kidney morphology based on unexpected genetic alterations beyond typical inheritance. Methods: Next-generation sequencing (NGS)-based gene panel analysis and multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) of PKD-associated genes, familial segregation analysis, and reverse phenotyping. Results: Three unrelated individuals presented in late adolescence for differential diagnosis of incidental microcystic-hyperechogenic kidneys with preserved kidney and liver function. Upon genetic analysis, we identified a homozygous hypomorphic PKHD1 missense variant causing pseudodominant inheritance in a family, a large monoallelic PKDH1-deletion with atypical transmission, and biallelic PKD1 missense hypomorphs with recessive inheritance. Conclusion: By this report, we illustrate clinical presentations associated with atypical PKD-gene alterations beyond traditional modes of inheritance. Large monoallelic PKHD1-alterations as well as biallelic hypomorphs of both PKD1 and PKHD1 may lead to mild CKD in the absence of prominent macrocyst formation and functional liver impairment. The long-term renal prognosis throughout life, however, remains undetermined. Increased detection of atypical inheritance challenges our current thinking of disease ontology not only in PKD but also in Mendelian disorders in general.

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common genetic diseases. ADPKD is manifested by the presence of renal cysts detected most often in the adult stage, and frequently liver cysts, with highly variable progression. ADPKD leads to kidney failure with the only recourse of dialysis and eventual kidney transplantation. Mutations dispersed throughout the PKD1 gene (major player, the polycystin-1 protein, PC1) and the PKD2 gene (polycystin-2 protein, PC2) are responsible for ADPKD. The loss of function (LOF) pathogenetic mechanism, and therefore a cellular recessive effect, has been suggested as causative of ADPKD. LOF is indeed supported by the PKD1/PKD2 gene inactivation mouse models, which develop cysts, although in utero with impressive speed in the kidney but not in the liver. Despite many in vitro studies, the membrane/ciliary role of PC1/PC2 remains rather hypothetical and context-dependent. These studies have associated PC1/PC2 to a variety of signaling pathways and underlined exceptional structural and functional complexity, whose involvement has been tested especially in LOF models. However, pathocellular observations in humans with sustained and even increased expression of PKD1/PC1, and the absence of particular human extrarenal phenotypes questions the exclusivity of the LOF mechanism. It was therefore essential 1) to clarify the pathogenetic mechanism, 2) to generate in vivo tools authentic of ADPKD in terms of initiation and progression of the disease and 3) to better understand the essential functions of PC1/PC2 for an adequate clinical translation. This thesis addresses all of these issues. First, we demonstrated that an increase in endogenous PKD1, just like in humans, is pathogenetic by generating and characterizing in detail a transgenic mouse model of Pkd1 (Pkd1TAG). This model not only reproduces the renal human characteristics associated with defects of the primary cilium, but also the extrarenal, namely, liver cysts. The severity of the phenotype correlates with the expression level of Pkd1, which strongly supports a dosage model. Secondly, we have demonstrated with genetic complementation studies that these two organs rely on a balance of Pc1 GPS cleavage, a typical post-translational modification of aGPCR, whose activity and abundance seem strictly controlled. Furthermore, we have extensively characterized Pc1 biogenesis and its derivatives in vivo generated upon GPS cleavage. We have identified a new form, predominantly on the membrane, the Pc1deN form, in addition to confirming the two N- and C-terminal Pc1 fragments (NTF and CTF, respectively), which associate non-covalently. Importantly, we have demonstrated that traffic of Pc1deN i.e., the NTF form detached from the CTF, is still dependant on the integrity of the CTF fragment. Next, we generated a first model humanizing a PKD1 nonsense truncated mutation at the level of the NTF(E3043X) domain by reproducing it in a transgenic mouse (Pkd1extra). Structurally, this mutation, which mimics Pc1deN, has also been shown to be causative of PKD. The Pkd1extra model allowed the proposition of the existence of a cross-interaction between different forms of Pc1. In addition, our two mouse models are both associated with altered levels of c-Myc and Pc2, which is supportive of their involvement in ADPKD and a functional interaction between the polycystins. Finally, we have shown a significant overlap between ADPKD and acute renal injury (ischemia/AKI) namely increased expression of Pc1 and Pc2 but also stimulation of several cystogenic factors such as tuberin, β-catenin and the oncogene c-Myc. Our studies have therefore given crucial evidence to the contribution of PKD1 gene dosage mechanism in ADPKD. We have developed two mouse models, which can serve as a tool for the analysis of human pathology as well as for preclinical validation of ADPKD. The identification of a new form of Pc1 adds an additional level of complexity in part explaining the regulation capacity of Pc1 on several signaling pathways. Our findings lead us to propose new therapeutic approaches: firstly, targeting the CTF i.e., chaperone style, and also targeting intracellular modulators (c-Myc, Pc2, Hif1α). Together, our work is of paramount importance in an informative point of view and practical perspective for progress towards a therapy for treating ADPKD. The sharing of common pathways between AKI and ADPKD paves the way for parallel therapeutic approaches for assured much faster treatment.