Depuis 25 ans, la production mondiale de saumon d'élevage (à 88% du saumon d'Atlantique) a augmenté de près de 2000% avec pour objectifs, notamment, de réduire la pression sur les stocks marins et de nourrir les populations dans le besoin. Or, après 25 ans de croissance continue, non seulement les objectifs de l'aquaculture salmonicole ne sont pas atteints, mais en outre, les nombreux impacts sur la détérioration de l'environnement, voire sur la baisse de qualité du saumon ainsi produit semblent compromettre davantage encore la viabilité de cette activité. Ce mémoire qui s'inscrit dans le cadre du projet de recherche du CRSH, Pour un dispositif d'évaluation scientifique et sociale des technosciences du vivant, dans le domaine de la transgénèse alimentaire : le cas du saumon transgénique, sous la direction de Louise Vandelac, également directrice de ce mémoire. Tout comme dans ce projet de recherche, nous avons privilégié une analyse globale de l'ensemble des enjeux relatifs au saumon d'élevage, notamment les aspects écologiques, socio-économiques et politiques, afin de bien comprendre dans quel contexte s'inscrirait la production d'un saumon transgénique. Nous avons mené pour ce mémoire une étude de cas dans la Baie de Fundy, au Nouveau-Brunswick (NB), deuxième producteur canadien de saumon d'élevage après la Colombie-Britannique. Cette étude globale et intégrée s'est appuyé sur un travail de revue de littérature suivi de 14 entretiens d'intervenants des entreprises salmonicoles, des gouvernements fédéral et provincial, des groupes environnementaux, d'universitaires et autres experts. Deux constats majeurs ressortent de l'analyse : 1) L'insuffisance notoire de la réglementation et de son application ; 2) L'absence de viabilité économique et écologique à long terme de l'aquaculture salmonicole, du moins au NB. En effet, l'ampleur des impacts environnementaux et les incertitudes relatives à qualité de ce saumon, ainsi que la fragilité économique des industries soumises à une compétition croissante sur le marché états-unien (principal marché du saumon produit au NB et pour le Canada) avec le Chili compromettent l'avenir de cette industrie aquacole. C'est dans ce contexte que nous avons étudié les projets d'introduction d'un saumon transgénique proposé comme solution potentielle à la crise du secteur salmonicole par la firme américaine Aqua Bounty qui a déjà présenté à cet effet une demande de commercialisation à la Food and Drug Administration (FDA). L'analyse de la situation actuelle et de l'ampleur des enjeux environnementaux, sociaux, politiques, économiques et sanitaires, mettent en évidence que l'introduction d'un tel saumon transgénique serait non seulement non viable et non souhaitable mais risquerait fort d'exacerber les problèmes actuels déjà criants de l'aquaculture. Avant d'envisager une telle perspective au Canada, cette analyse met en évidence la nécessité d'une approche globale et intégrée d'une telle question permettant comme le souligne le titre même de la recherche du CRSH qu'une évaluation scientifique et sociale d'une réelle crédibilité démocratique permette une prise de décision éclairée et soucieuse du principe de précaution ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : aquaculture, saumon d'élevage, saumon transgénique, approche globale et intégrée, développement durable, Nouveau-Brunswick, Baie de Fundy

Mes premiers travaux de recherche, me permettant de soutenir une thèse de doctorat en décembre 1999, ont été effectués au sein du laboratoire du professeur Bernard GRANDCHAMP (unité 409 de l'INSERM) sous la direction du docteur Marie-Christine LECOMTE. Mon travail s'est intégré dans l'étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes, principalement le site de tétramérisation et le domaine SH3. Concernant la tétramérisation de la spectrine érythroïde j'ai identifié les régions minimales nécessaires et suffisantes pour former le tétramère puis j'ai mis en évidence une relation entre certaines mutations de la spectrine associées à des anomalies membranaires du globule rouge et la sévérité du défaut de formation du tétramère. J'ai ensuite identifié plusieurs ligands du domaine SH3 de la spectrine non érythroïde. L'un d'entre eux m'a permis de définir une régulation de la protéolyse ciblée de cette spectrine faisant intervenir un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation. Ma formation initiale fut donc celle d'un biochimiste que j'ai étendue peu à peu vers la biologie moléculaire et la biologie cellulaire.<br />Puis, souhaitant acquérir les connaissances nécessaires au développement de modèles murins, j'ai décidé d'effectuer mon stage post-doctoral à l'Institut COCHIN (unité 567 de l'INSERM) dans une équipe co-dirigée par le docteur Sophie VAULONT et le professeur Axel KAHN. Je me suis ainsi familiarisé avec la souris comme « outil » de recherche (gestion d'un élevage, établissement de nouvelles lignées, génotypage, phénotypage). Je travaillais initialement sur le métabolisme du glucose mais j'ai complètement réorienté ma thématique de recherche au bout d'un an pour finalement identifier et caractériser une hormone, l'hepcidine, contrôlant l'homéostasie du fer.<br />J'ai été nommé chargé de recherche de grade 2 dans l'unité 409 de l'INSERM en octobre 2002 pour y développer une souche de souris exprimant une spectrine non érythroïde résistante à des mécanismes de protéolyse ciblée. Il s'agit donc toujours d'appréhender certaines fonctions des spectrines mais dans un contexte in vivo. En janvier 2005 j'ai intégré l'unité 665 de l'INSERM dirigée par Yves COLIN afin de poursuivre ce projet. Aujourd'hui, je suis chargé de recherche de grade 1.<br />Le chapitre scientifique de ce mémoire est divisé en deux parties distinctes : la première traite de mon travail sur la spectrine tandis que la seconde porte sur l'hepcidine. Chaque partie est composée d'une introduction au sujet suivie d'un résumé des travaux que j'ai effectués et/ou dirigés.

Les vaisseaux sanguins sont tapissés d'une monocouche de cellules endothéliales qui est principalement responsable du maintien de la pression artérielle et des fonctions cardiaques via la relâche de médiateurs, en particulier le monoxyde d'azote (NO) et l'endothéline (ET). Le NO est un puissant vasodilatateur des cellules musculaires lisses suite à sa liaison à la guanylate cyclase tandis que l'ET-1, un vasopresseur très puissant, agit via deux récepteurs: ETA et ETB. La littérature traitant de la réactivité croisée entre l'ET-1 et le NO ne cesse d'augmenter. Brièvement, il a été rapporté que l'ET-1, via ses récepteurs ETB entraîne la libération d'une faible quantité de NO et que ce dernier, régule à la baisse la production d'ET-1 des cellules endothéliales. Dans ces conditions, le NO semble être un répresseur du système des endothélines. À l'inverse, plusieurs pathologies vasculaires et cardiaques sont associées avec une augmentation de l'ET-1 par exemple l'infarctus du myocarde et le choc endotoxique. Des études indépendantes rapportent, dans ces mêmes conditions, une production accrue de NO pouvant aller jusqu'à 100 fois. L'aspect contradictoire de ces effets est très intrigant et pourrait être explicable en partie par le fait qu'il existe deux familles d'isoenzymes responsable de la synthèse du NO appelés monoxyde d'azote synthase (NOS). Nous avons formulé l'hypothèse que la iNOS et la eNOS ont des effets opposés sur la régulation du système des endothélines. Les interactions entre l'ET-1 et les différentes NOS sont complexes et encore mal comprises dû au manque d'inhibiteurs vraiment sélectifs. Lors de notre étude nous utilisons des souris ayant une répression homozygote chronique pour le gène codant pour la iNOS ou eNOS en comparaison avec des souris de type sauvage. Ceci nous permet d'étudier l'influence des NOS et/ou de leur NO sur la régulation de la réponse pressive à l'endothéline et de l'expression de ces récepteurs. Les souris iNOS (-/-) ont des paramètres hémodynamiques de base semblables à celle de type sauvage. Cependant, notre étude a révélé que le contenu protéique cardiaque en récepteur ETA est réduit tandis que ETB est inchangé comparé au souris sans modification génique. En ce sens, nous observons une réduction de réponse pressive à l'endothéline-1 chez ces souris anesthésiées sans changement de la réponse pressive à l'IRL-1620, un agoniste sélectif des récepteurs ETB. D'un autre côté, l'inactivation du gène codant pour la eNOS entraîne chez ces souris un état hypertensif. Nos études moléculaires démontrent chez ces animaux, des niveaux de récepteurs ETA augmentés, et ETB réduits dans les tissus cardiaques des souris eNOS (-/-). De plus, leur réponse pressive suite à l'administration intraveineuse d'endothéline-1 ou d'IRL-1620 est augmentée ou réduite, respectivement. Chez les animaux conscients, les deux modèles murins ont répondu avec la même amplitude à l'effet hypotensif d'un traitement à l'antagoniste ETA, l'ABT-627. La pression des souris eNOS (-/-) est toutefois normalisée suite à trois jours de traitement. D'un autre côté, l'administration d'un antagoniste ETB, l'A-192621, augmente la pression artérielle moyenne dans une plus grande mesure chez les eNOS (-/-) comparé aux souris iNOS (-/-) ou de type sauvage. En outre, nous avons notés une augmentation significative de l'endothéline immunoreactive dans les artères mésentériques chez les souris eNOS (-/-) comparés aux souris iNOS (-/-), ces dernières ont des niveaux semblables à leur consoeurs non manipulées génétiquement. Notre étude montre que la répression de la iNOS ou de la eNOS a des impacts distincts sur l'endothéline-1 et ses récepteurs. Nous avons aussi montré que le coeur est le principal organe atteint; subissant ces modulations importantes des récepteurs de l'endothéline dans les conditions d'inactivation de la iNOS ou la répression de la eNOS chez des souris adultes. [Symboles non conformes]

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire. Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique. L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.

Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes . Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites. La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau. Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu estimer la quantité d’ADN complémentaire engagé dans la réaction en se basant directement sur les données de fluorescence d’une seule courbe de PCR en temps réel sans passer par une courbe de calibration utilisant une quantité connue d’ADN complémentaire.

Alors que les biologistes moléculaires poursuivent les travaux de transgénèse animale depuis plusieurs décennies déjà et que des instances réglementaires américaines et canadiennes étudient actuellement la possibilité d'introduire sur le marché des animaux transgéniques destinés à l'alimentation, force est de constater que très peu de travaux en sciences de l'environnement menés dans une perspective globale santé et société permettent d'appréhender la genèse, les enjeux et les impacts de l'introduction éventuelle d'animaux transgéniques de boucherie dans les cheptels et donc dans l'environnement et dans les assiettes. Notre étude porte plus spécifiquement sur l'introduction éventuelle de porcs transgéniques censée remédier aux problèmes de surplus de phosphore résultant de certaines stratégies d'intensification croissante de la production porcine. Bien que ce mémoire ne soit pas centré sur l'analyse politique et économique de la production porcine au Québec, c'est néanmoins dans ce contexte que nous examinerons cette application de la transgénèse animale en agriculture et les stratégies de légitimation dont on tente d'enrober ces développements sociotechniques. Le porc transgénique hypophosphorique en question, nommé Enviropig™ permettrait, selon ses promoteurs, d'atténuer certains impacts environnementaux associés au surplus de phosphore ingéré et rejeté par les bêtes dans leurs excréments, désormais gérés sous forme de lisiers. Techniquement, les glandes salivaires de certains de ces porcs transgéniques peuvent produire une enzyme appelée phytase permettant la digestion puis l'absorption du phosphore alimentaire diminuant alors le contenu en phosphore de certains de ces porcs de 56 à 75% dans les matières fécales. Dans un contexte où la mesure des types et des niveaux de risques que représente la transgénèse pour la santé environnementale, humaine et animale ne fait pas consensus au sein de la communauté scientifique, il nous est apparu essentiel, en l'absence manifeste de contre-expertise indépendante, d'examiner si un tel porc est compatible avec une agriculture durable dont se réclame cet « Enviropig™ ». Ainsi, suite à une vaste revue de littérature, en s'inspirant des approches écosanté et cycle de vie, nous analysons certains risques associés à un tel porc transgénique susceptibles de toucher plus largement d'autres d'animaux de boucherie transgéniques, tout en identifiant les principaux impacts sur la production porcine. Notre analyse porte également sur les zones d'ombre des dispositifs d'évaluations scientifiques et des politiques publiques dans le domaine. En examinant cette question de l'introduction du porc transgénique, dans le contexte global des pratiques d'élevage de ce secteur agro-industriel très concentré et dominé par quelques grands intégrateurs et multinationales de la transformation, nous mettrons également en évidence le caractère peu viable d'une telle stratégie. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Transgénèse, Porc transgénique, Production porcine, Élevage et agriculture durable, Développement durable, Risques, Politiques publiques, Approche écosanté.

L'utilisation de l'amidon comme agent de remplissage, agent liant ou agent désagrégeant est très répandue dans l'industrie pharmaceutique. Des modifications chimiques effectuées sur ce polymère auront une influence sur ses propriétés rhéologiques. La carboxyméthylation de l'amidon génère un excipient dont les propriétés de gastro-protection ainsi que de libération contrôlée pour plusieurs catégories de principes bioactifs ont été démontrées lors de différentes études (Calinescu et al., 2005; 2007; Massicotte et al., 2008). Le concept d'immunisation mucosale lors de la vaccination est basé sur le fait que plusieurs pathogènes ont comme porte d'entrée dans l'organisme les muqueuses (par exemple celles du tractus respiratoire ou gastro-intestinal). Dans cette optique, pour contrer ou prévenir une infection, il faut cibler l'induction de l'immunité mucosale au site d'entrée du pathogène afin d'obtenir une protection optimale. Les protéines végétales incluant des fragments immunogènes spécifiques d'agents infectieux peuvent être utilisées à des fins d'immunisation orale pour une stimulation de l'appareil lymphoïde de la muqueuse intestinale. Une limite à cette approche est la barrière stomacale par rapport au pH gastrique et à l'activité protéolytique pouvant dégrader le matériel immunogène d'intérêt. Il était important de protéger les protéines immunogènes en incorporant les extraits végétaux dans une matrice polymérique utilisée à des fins de transport jusqu'à la muqueuse intestinale. Pour ce faire, les extraits végétaux lyophilisés ont été formulées avec le carboxyméthyl amidon (CMA) offrant une protection gastrique et une libération ciblée de l'actif au niveau intestinal. Lors de la libération des extraits végétaux dans la solution simulant les conditions intestinales (SIF), une destruction des protéines à été observée. L'utilisation d'inhibiteurs de protéases a été testée d'une part dans le milieu de libération et d'autre part dans la formulation elle-même. La libération des agents bioactifs non dégradés a été observée avec l'utilisation du Pefabloc SC à une concentration de 1,6 % (w/w) dans la formulation. A cette concentration, une stabilisation des protéines dans le SIF est observée pendant 6 h. L'utilisation de la lipase comme marqueur enzymatique à permis de donner une information sur la conservation de la structure protéique des éléments bioactifs lors de leur libération. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Vaccination, Plantes transgéniques, Polymères biocompatibles, Amidon, Voie orale, Gastro protection, Libération contrôlée, Inhibiteur de protéases.

Au niveau de la santé publique, l'impact meurtrier des infections au rotavirus humain (RVH) et les limites d'application des vaccins disponibles déterminent l'urgence et la nécessité de développer de nouvelles approches pour immuniser une grande partie de la population mondiale sans effets secondaires néfastes. Pour pallier à l'énorme demande en médicaments et en vaccins, plusieurs groupes de recherche tentent de développer de nouvelles méthodes de production à base de plantes transgéniques. La production de médicaments et vaccins chez les végétaux possèdent des avantages inhérents dont une absence de pathogènes humain, une inoculation facile, de faibles coûts de production à grande échelle et la production d'inocula bruts stockables. Le succès des systèmes d'expression à base de plantes justifie le développement de plants qui produisent beaucoup de biomasse et se transforment génétiquement de façon courante. Le travail présenté ici démontre le potentiel du système d'expression transitoire par agroinfiltration de Nicotiana benthamiana pour produire les antigènes VP7 et VP4∆ du RVH ainsi que l'adjuvant protéinique fljB de Salmonella typhimurium. Le clonage des séquences codantes des antigènes VP7, VP4∆ et fljB a permis de générer de multiples constructions simple, double et triple. Toutes les contructions ont été exprimées dans les feuilles agroinfiltrées à l'exception de VP4∆::VP7 qui n'a pas été détectée par immunobuvardage. Le rendement de protéines d'intérêt dans les extraits végétaux se situe entre 0,85 et 31,97 µg de protéine recombinante par gramme de feuilles fraîches. Plusieurs facteurs dont la toxicité et la stabilité des différentes constructions dans les plantes peuvent expliquer cet écart. Dans nos conditions expérimentales, toutes les constructions contenant le fragment fljB ont permis la production d'anticorps spécifiques à fljB dans les souris immunisées avec les extraits végétaux. Par contre, aucune construction n'as permis la production d'anticorps spécifiques à VP7 ou VP4. Ces résultats montrent que l'expression transitoire dans Nicotiana benthaminana permet de produire rapidement de multiples antigènes et que les protéines fortement immunogéniques dans les extraits végétaux induisent une réponse humorale chez les souris. Plusieurs applications de cette technologie sont envisageables dans la cadre du contrôle endémique du RVH ou de Salmonella typhimurium. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rotavirus humain, VP7, VP4, Salmonella typhimurium, fljB, Expression transitoire, Vaccins à base de plantes, Nicotiana benthaminana.

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