Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes .Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites.<p>La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau. Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu estimer la quantité d’ADN complémentaire engagé dans la réaction en se basant directement sur les données de fluorescence d’une seule courbe de PCR en temps réel sans passer par une courbe de calibration utilisant une quantité connue d’ADN complémentaire. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail porte sur l’étude fonctionnelle de deux gènes préférentiellement exprimés dans deux régions du cerveau touchées par des pathologies neurodégénératives : Capucine, un marqueur du striatum, structure qui dégénère au cours de la maladie de Huntington et Agpat4, un marqueur de l’aire tegmentaire ventrale et de la substance noire compacte, dont les neurones dopaminergiques sont sélectivement atteints lors de la maladie de Parkinson. Des lignées de souris invalidées pour ces gènes ont été générées au laboratoire et au cours de ma thèse j’ai procédé à leur caractérisation. L’expression striatale du gène de la Capucine étant significativement diminuée dans des modèles murins de la maladie de Huntington, nous avons souhaité évaluer son rôle éventuel dans la pathogenèse de cette maladie. Pour ce faire, nous avons examiné, dans le cadre d’une collaboration, l’effet du knock-out et de la surexpression du gène de la Capucine sur la vulnérabilité des neurones striataux à un fragment de la Huntingtine mutée dans un modèle murin de la maladie de Huntington. Les données montrent que la Capucine n’a pas d’effet significatif sur la toxicité du fragment de la Huntingtine mutée dans le modèle étudié.La protéine Agpat4 présente des homologies de séquence avec des acyltransférases impliquées dans le métabolisme des phosphoglycérides. J’ai réalisé des études d’expression par différentes techniques de biologie moléculaire qui montrent que le gène d’Agpat4 est exprimé dans la plupart des tissus catécholaminergiques. Pour déterminer l’activité endogène d’Agpat4 et son rôle physiologique dans les tissus où elle est exprimée, j’ai comparé le métabolome de tissus de souris invalidées pour le gène d’Agpat4 et sauvages par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Mes résultats indiquent que l’invalidation du gène d’Agpat4 perturbe le métabolisme non seulement de différentes classes de lipides, notamment les lysophosphatidyléthanolamines, mais aussi celui des catécholamines. / This work concerns the functional study of two genes preferentially expressed in two brain regions affected by neurodegenerative diseases: Capucine, a marker of the striatum, a structure that degenerates in Huntington's disease and Agpat4, a marker of the ventral tegmental area and the substantia nigra pars compacta, whose dopaminergic neurons are selectively affected in Parkinson's disease. Mouse lines deficient for Capucine and Agpat4 have been generated in the laboratory and during my PhD thesis I carried out their characterization.As the striatal gene expression of Capucine is significantly reduced in mouse models of Huntington's disease, we wished to evaluate its possible role in the pathogenesis of this disease. In a collaborative work, we examined the effect of the knockout and overexpression of the Capucine gene on the vulnerability of striatal neurons to a mutant Huntingtin fragment in a mouse model of Huntington’s disease. The data show that Capucine has no significant effect on the toxicity of the mutant Huntingtin fragment in the considered model.The Agpat4 protein has sequence homologies with acyltransferases involved in the metabolism of phosphoglycerides. I conducted expression studies using different molecular biology techniques, which showed that the Agpat4 gene is expressed in most catecholaminergic tissues. To determine the endogenous activity of Agpat4 and its physiological role in the tissues where it is expressed, I compared the metabolomes of Agpat4-deficient and wild-type mice tissues by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. My results indicate that Agpat4 deficiency alters not only the metabolism of different lipid classes, in particular lysophosphatidylethanolamines, but also the metabolism of catecholamines.

La composition des compartiments lymphocytaires T est soumise à de constantes modifications, sous l'effet conjugué de la production de nouvelles spécificités, de la sélection lors d'une rencontre avec un antigène et de la mort cellulaire. Face à ces flux de cellules entre les différents compartiments centraux et périphériques, les mécanismes de la régulation homéostatique assurent le fait que le système immunitaire se maintienne à l'équilibre. A l'image d'un écosystème, on peut alors observer que les lymphocytes T entrent en compétition les uns avec les autres pour des niches de sélection et des ressources en quantité limitée. Durant ce travail de thèse, réalisé chez la souris, nous avons analysé le comportement des lymphocytes T ab CD8+ face à un bouleversement de leur environnement, et nous avons travaillé sur les molécules de classe I du CMH comme modèle de ressource nécessaire à la survie des cellules T ab CD8+.<br />Dans un premier temps, nous avons étudié la sélection centrale et périphérique de cellules T ab CD8+ exprimant deux transgènes codant respectivement pour le TCR aHY, spécifique de l'antigène mâle H-Y, et le TCR P14, spécifique du peptide gp33-41 issu du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Ce modèle reproduit un phénomène courant dans le système immunitaire, puisqu'on trouve chez l'homme et la souris jusqu'à 30% de cellules exprimant deux TCR différents à leur surface. Nos résultats montrent que l'expression de deux TCR par les cellules T ab CD8+ leur permet d'échapper partiellement à la sélection négative dans le thymus, et de résister à la délétion clonale à la périphérie. Dans un second temps, nous avons étudié l'établissement d'une infection chronique par le LCMV dans des souris n'ayant pour lymphocytes que des cellules T exprimant le TCR P14 (souris MoP14). Nous avons pu observer que cette infection passe par la sélection de variants viraux spécifiquement mutés au niveau de l'épitope gp33-41, mais également par la modification du comportement des cellules T ab CD8+ des animaux. L'ensemble de ces données plaide pour un modèle d'adaptation des lymphocytes T ab CD8+ à leurs conditions environnementales.<br />Enfin, nous avons étendu ce travail à l'étude de l'influence des molécules de classe I du CMH sur la survie et la prolifération homéostatique des lymphocytes T ab CD8+, en utilisant une gamme de souris transgéniques pour le TCR. Nos résultats montrent une variété de comportements en relation avec la réactivité croisée supposée des différents TCR utilisés.

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution. / Although much has been learned about the mechanisms leading to acute respiratory distress syndrome (ARDS), mortality remains high: ~ 40%. This syndrome is associated with lung injury where alveolar edema and excessive inflammatory response can progress to abnormal epithelial repair and fibrosis. The hypothesis of the work presented in this thesis is that attenuation of edema or of the inflammatory response in the initial stage of the acute lung injury would decrease the severity of injury. I evaluated this hypothesis in an ARDS acute phase, modeled by an intratracheal instillation of bleomycin in mice, using two distinct experimental strategies.  The importance of edema clearance was studied in a transgenic (Tg) ENaC mouse, a mouse known to be sensitive to the formation of edema. However, our results show that these Tg mice were not more susceptible to the development of the ARDS acute phase induced by bleomycin. Furthermore, we have been able to show that bleomycin itself did not interfere with the ENaC channel function of alveolar epithelial cells type II (AT II).  The treatment of the inflammatory response associated with ARDS by glucocorticoid therapy is subject to controversy. In our mouse model, glucocorticoids decrease the level of cytokine in the alveolar milieu but did not decrease the severity of lung injury. Using in vitro experiments, we show that this lack of response could be secondary to the impact of the treatment on the epithelial repair capacity of AT II. In summary:  The ENaC channel expression did not have an impact on the development of the exudative phase, suggesting that the regulation of edema is not sufficient to alter the course of ARDS.  The modulation of inflammation by glucocorticoids was ineffective, possibly because of impaired repair of the epithelium. These results suggest that the control of edema or inflammation separately does not modify the evolution of lung injury. The heterogeneity of the ARDS origins and the redundancy of cellular mechanisms involved in lung injury will require therapy aimed at multiple pathophysiological targets to permit the resolution of lung injury.

En Argentine, la biotechnologie agricole, spécialement le soya transgénique, a été adoptée de façon fulgurante et elle a provoqué un fort choc dans l’économie nationale et dans la société. Actuellement, dû à la gravité des conséquences de ce phénomène, les médias, et la presse en particulier, ont fait écho du débat. Le but général de cette étude est d’analyser le débat de société sur ce phénomène dans la presse écrite argentine. Pour ce faire, trois objectifs spécifiques ont été retenus : dresser un portrait général du discours; comprendre le contexte politique et économique qui a permis l’insertion de la biotechnologie agricole en Argentine; et analyser les enjeux socioéthiques subjacents au problème des biotechnologies. Pour répondre à ces objectifs, on a effectué une analyse de contenu du discours social circonscrit à la presse écrite argentine entre les années 1999- 2006. La démarche privilégiée inclut la classification des articles de journaux par l’utilisation de mots-clés et l’assignation à des catégories thématiques avec l’assistance des techniques d’analyse de texte par ordinateur. Les résultats de cette étude signalent pour la période étudiée une importante couverture journalistique des biotechnologies agricoles, couverture qui, en général, a été favorable. La quantité d’articles augmente avec les années et montre un virage important des sujets commerciaux à des questions politiques. Le débat autour des conséquences environnementales et sociales de l’application du nouveau modèle agricole sont pauvrement représentées et montrent une apparition plus tardive dans les journaux argentins. Cependant, cela pourrait s’expliquer par un déplacement dans l’axe de la discussion des biotechnologies vers la sojisation qui devient l’enjeu central du débat autour du phénomène agricole. / In Argentina, agricultural biotechnology – especially transgenic soya – has been widely adopted causing a strong impact on the national economy and society. Today, because of its important impact, the media and the written press in particular have published substantial material on this phenomenon of agricultural biotechnology. The overall objective of this study is to analyze the social debate on this phenomenon in the Argentinean written press. To this end, three specific objectives were retained: to provide an overview of the discourse; to understand the political and economic context that permitted the inclusion of agricultural biotechnology in Argentina; and to analyze the socio-ethical issues underlying the integration of biotechnology into Argentinean agriculture. To meet these objectives, I conducted a content analysis of social discourse in the Argentinean press during the years 1999-2006. I classified articles using keywords and constructed thematic categories using computer-assisted text analysis techniques. The results of this study show a wide coverage of agricultural biotechnology with a generally positive presentation. The number of articles increases over time and shows a major shift from a discussion of economic to political issues. The debate over the environmental, social and ethical consequences of the implementation of this new agricultural model is poorly represented and has a late appearance in the press. However, this could be explained by a change in the focus of discussion from biotechnology to sojisation, which includes many of these issues and which has become the focus of debate about agriculture.

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots. / Decoy receptor 3 (DcR3) is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family, and is widely expressed in human normal tissues and malignant tumors. It is a decoy receptor of three TNF family members, i.e., FasL, LIGHT and TL1A. The interaction of DcR3 and its ligands will not transmit signal into cells via DcR3 because DcR3 is a soluble protein without a transmembrane and intracellular segment. Thereby, DcR3 competitively inhibits signaling through three functional receptors, i.e., Fas, HVEM/LTbetaR and DR3. In previous studies, we found that DcR3 could modulate immune cell function, and protect islet viability. Herein, we generated DcR3 transgenic (Tg) mice driven by the human β-actin promoter to further investigate the function of DcR3. Interestingly, the DcR3 Tg mice developed a lupus-like syndrome at 6 months of age. They presented a variety of autoantibodies including anti-nucleus and anti-dsDNA antibodies. They also manifested renal, dermal, hepatic and hematopoietic lesions. Compared to lpr and gld mouse lupus models, DcR3 Tg mice more closely resembled human SLE in terms of Th2-biased immune response and anti-Sm antibody production. Furthermore, we found that DcR3-producing hematopoietic cell were sufficient to cause these pathological changes. Mechanistically, DcR3 may break T-cell homeostasis to interfere with peripheral tolerance, and then induce autoimmunity. In humans, we detected high DcR3 levels in SLE patient sera. The high DcR3 levels were related to elevated IgE titer in some SLE patients, as was the case in the mouse model. Therefore, DcR3 may represent an important pathogenetic factor of human SLE. Utilizing the DcR3 Tg mouse, we further elucidated the mechanism by which DcR3 protected islets from primary nonfunction (PNF). Blocking of LIGHT and TL1A signaling by DcR3 are involved in such protection. Moreover, by mRNA microarray we identified possible downstream molecules, which may mediate such protection. We confirmed that Adcyap1 and Bank1 played critical roles in mediating DcR3’s effect in islet protection. Our studies resolved a puzzle about the relationship between the Fas/FasL apoptosis signaling pathway and the pathogenesis of human SLE. DcR3 can block Fas/FasL pathway even if there is no genetic mutation in Fas and FasL. DcR3 can simultaneously interfere with LIGHT and TL1A signaling to cause a more complex phenotype than the simple Fas or FasL mutation in patients. DcR3 can also be employed as a potential diagnostic parameter for SLE. The discovery of the mechanism of DcR3 in protecting islets allows us to explore novel therapeutic targets to protect islet graft.

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète. / Drak2 is a member of the death-associated protein family, and is a serine threonine kinase. In Drak2 null mutant mice, T cells have no apparent defect in activation-induced apoptosis after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28, but have a lowered threshold to stimulation, compared with wild type (WT) T cells. In our study, in situ hybridization analysis has revealed that Drak2 expression is ubiquitous at the mid-gestation stage in embryos, followed by more focal expression in various organs in the perinatal period and adulthood, notably in the thymus, spleen, lymph nodes, cerebellum, suprachiasmatic nuclei, pituitary, olfactory lobes, adrenal medulla, stomach, skin and testes. We generated Drak2 transgenic (Tg) mice using the human beta-actin promoter. These Tg mice showed normal T cell versus B cell and CD4 versus CD8 populations in the spleen, but their spleen weight cellularity was lower in comparison with wild type mice. After TCR activation, the proliferation response in Drak2 Tg T cells was normal, although their interleukin (IL)-2 and IL-4 but not interferon-r production was augmented. Activated Drak2 Tg T cells demonstrated significantly enhanced apoptosis in the presence of exogenous IL-2. At the molecular level, Drak2 Tg T cells manifested a lower increase of anti-apoptotic factors during activation; such a change probably rendered the cells vulnerable to subsequent IL-2 insults. The heightened apoptosis in Drak2 Tg T cells was associated with reduced numbers of T cells with the memory cell phenotype (CD62Llo) and repressed secondary T cell responses in delayed type hypersensitivity. These results demonstrate that Drak2expresses in the T cell compartment but is not T cell-specific; and it plays critical roles in T cell apoptosis and memory T cell development. Further, we investigated the role of Drak2 in beta-cell survival and diabetes. Drak2 mRNA and protein were rapidly induced in islet beta-cells after exogenous inflammatory cytokine or free fatty acid stimulation, which is present endogenously in either type 1 or type 2 diabetes. Drak2 upregulation was accompanied by increased beta-cell apoptosis. The beta-cells apoptosis caused by the said stimuli was inhibited by Drak2 knockdown using siRNA. Conversely, transgenic (Tg) Drak2 overexpression led to aggravated beta-cell apoptosis triggered by the stimuli. Drak2 overexpression in islets compromised the increase of anti-apoptotic factors, such as Bcl-2, Bcl-xL and Flip, upon the cytokine and free fatty acid stimulation. Further in vivo experiments demonstrated that Drak2 Tg mice were prone to type 1 diabetes in a multiple-low-dose streptozotocin-induced diabetes model, and they were also prone to type 2 diabetes in a diet-induced obesity model. Our data show that Drak2 is detrimental to beta-cell survival. We also investigated the signalling pathway of Drak2. We found that purified Drak2 could phosphorylate p70S6 kinase in an in vitro kinase assay. Drak2 overexpression in NIT-1 cells led to enhanced p70S6 kinase phosphorylation, while Drak2 knockdown in these cells reduced the phosphorylation. These mechanistic studies proved that p70S6 kinase was a bona fide Drak2 substrate in vitro and in vivo.This study has discovered the important functions of Drak2 in T cell homeostasis and diabetes. We proved that p70S6 kinase was a substrate of Drak2. Our findings have broadened our knowledge of Drak2 in the immune and endocrine system. Some of our findings, such as the roles of Drak2 in memory T cell development and beta cell survival could be explored for clinical application in the areas of transplantation and diabetes.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Ce travail porte sur l'étude fonctionnelle de deux gènes préférentiellement exprimés dans deux régions du cerveau touchées par des pathologies neurodégénératives : Capucine, un marqueur du striatum, structure qui dégénère au cours de la maladie de Huntington et Agpat4, un marqueur de l'aire tegmentaire ventrale et de la substance noire compacte, dont les neurones dopaminergiques sont sélectivement atteints lors de la maladie de Parkinson. Des lignées de souris invalidées pour ces gènes ont été générées au laboratoire et au cours de ma thèse j'ai procédé à leur caractérisation. L'expression striatale du gène de la Capucine étant significativement diminuée dans des modèles murins de la maladie de Huntington, nous avons souhaité évaluer son rôle éventuel dans la pathogenèse de cette maladie. Pour ce faire, nous avons examiné, dans le cadre d'une collaboration, l'effet du knock-out et de la surexpression du gène de la Capucine sur la vulnérabilité des neurones striataux à un fragment de la Huntingtine mutée dans un modèle murin de la maladie de Huntington. Les données montrent que la Capucine n'a pas d'effet significatif sur la toxicité du fragment de la Huntingtine mutée dans le modèle étudié.La protéine Agpat4 présente des homologies de séquence avec des acyltransférases impliquées dans le métabolisme des phosphoglycérides. J'ai réalisé des études d'expression par différentes techniques de biologie moléculaire qui montrent que le gène d'Agpat4 est exprimé dans la plupart des tissus catécholaminergiques. Pour déterminer l'activité endogène d'Agpat4 et son rôle physiologique dans les tissus où elle est exprimée, j'ai comparé le métabolome de tissus de souris invalidées pour le gène d'Agpat4 et sauvages par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Mes résultats indiquent que l'invalidation du gène d'Agpat4 perturbe le métabolisme non seulement de différentes classes de lipides, notamment les lysophosphatidyléthanolamines, mais aussi celui des catécholamines.

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