Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans les recherches précliniques, mais il existe plusieurs limites. Les états physiologiques et immunologiques chez les murins et les primates non humains sont radicalement différents à ceux de l'homme, en particulier la restriction du CMH, qui ne peut éliminer l'influence de la spécificité de l'espèce dans les expériences précliniques. Le but du travail était de générer un niveau plus élevé de souris transgéniques «HLA humanisées» qui pourraient imiter les réponses immunitaires humaines avec plus de précision et de fiabilité; à viser d’appliquer pour l'évaluation préclinique de la transplantation humaine, à l'identification de nouveaux épitopes et à l'évaluation des vaccins et des médicaments candidats. Dans la première partie. Nous rapportons d’une nouvelles souris transgéniques HLA immunodéficientes «HUMAMICE». Des souris HLA-A2+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/- ont été établies, lesquelles exprimaient des molécules HLA humaines au lieu de H-2 murines et ne présentaient pas de lymphocytes murins. Ce statut immunodéficient a été inversé en transférant les cellules hPBMC HLA appariées fonctionnelles pour produisant ensuite des souris ayant un statut immuno-compétent avec un système immunitaire humain fonctionnel. L'immunisation du vaccin HBsAg a permis d'obtenir une production robuste et reproductible d'anticorpsspécifiques. En conclusion, ces résultats indiquent que le modèle hPBMC-HUMAMICE représente un modèle prometteur pour disséquer les réponses immunitaires humaines aux maladies humaines. Dans la seconde partie de cette étude, les souris HLA-A11+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/- ont été établies. Cette nouvelle souche de souris possède une caractéristique restreinte par HLA-A11 et une capacité normale à répondre aux antigènes. L'immunisation de souris avec un vaccin recombinant HBsAg contre le VHB ou une protéine recombinante du VIH-1 a entraîné la génération de lymphocytes T cytotoxiques producteurs d'IFN-y et d'anticorps spécifiques. En outre, nous avons identifié deux épitopes restreints par HLA-A11 de la protéine GP EBOV et quatre de la protéine MERS-CoV S. En fin, ce modèle de souris HLA-A11/DR1 pourra faciliter l'identification des épitopes de lymphocytes cytotoxiques et auxiliaires restreints par le HLA-A11 dominants en Chine. Le modèle constituer un nouvel outil technique prometteur pour comprendre les mécanismes immunologiques et les nouveaux vaccins pour les populations d’Asie de l’Est. Durant cette thèse, nous avons créé deux modèles de souris humanisées novateurs et prometteurs portant une restriction HLA humaine qui pourraient servir de modèles d'infection pathogène et étudier les tumeurs, les mécanismes de transplantation et l'invention et l'évaluation des vaccins et des médicaments. / Animal models play critical roles in pre-clinical researches, while there are still several limitations. The physiological and immunological states in murine and non-human primates are radically district from those of mankind, especially the MHC restriction, which cannot eliminate the influence of species specificity in pre-clinical experiments.The aim of our work was to generate a higher level of “humanized” transgenic mice which could mimic human immune responses with more accuracy and reliability; furthermore, to apply the novel models in the evaluation of human transplantation, the identification of new epitopes, and the evaluation of candidate vaccines and drugs.In the first part of the study, novel immuno-deficient HLA transgenic mice "HUMAMICE" (HLA-A2+/+/DR1+/+/ H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/- mice) were established, which expressed human HLA molecules instead of murine H-2 and present no murine lymphocytes. This immuno-deficient status was reversed by transferring the functional HLA-matched hPBMCs and then producing mice with an immuno-competent status with a functional human immune system, led to high lymphocytes engraftment rates without GvHD. Immunization of HBsAg vaccine resulted in robust and reproducible production of specific antibodies. Inconclusion, these results indicated that the hPBMCs-HUMAMICE model represents a promising model to dissect human immune responses towards human diseases.In the second part of this study, the Chinese/East Asian HLA dominated HLA-A11/DR1(HLA-A11+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-) transgenic mouse strain was established. This novel mouse strain possesses HLA-restricted characteristic and a normal ability to respond to antigens. Immunization of mice with a recombinant HBV vaccine or a recombinant HIV-1 protein resulted in the generation of IFN-γ-producing cytotoxic T lymphocytes and specific antibodies. Furthermore, we identified two HLA-A11 restricted epitopes of EBOV GP protein and four of MERS-CoV S protein. Above all, HLA-A11/DR1 mice could facilitate the identification of Chinese dominant HLA-restricted CTL and Th epitopes and provide a new promising technical tool to understand immunological mechanisms and new vaccines.Taken together, we created two novel and promising humanize mouse models carrying human HLA restriction which could apply as pathogen infection models, and study tumors, transplantation mechanism, and the invention and evaluation of vaccines and drugs.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie génétique rénale qui se manifeste par le développement de kystes au rein. Elle résulte de mutations dans le gène PKD1/polycystine-1 (PC-1), contenant un motif coiled-coil et dans le gène PKD2/PC-2 dont les fonctions restent à élucider. À partir d’un chromosome artificiel bactérien, le gène Pkd1 murin (BAC-Pkd1) a été modifié afin de générer 4 lignées de souris transgéniques délété du motif coiled-coil Pkd1Δcoiled-coil et 3 lignées contrôles Pkd1TAG possédant 1-35 copies du transgène. Ces 2 transgènes ont un profil d’expression identique à l’endogène et le niveau dépend du nombre de copies. Alors que les souris Pkd1TAG développent la PKRAD de sévérité proportionnelle au niveau d’expression, les lignées Pkd1Δcoiled-coil en sont épargnées. Ces résultats démontrent l’importance du motif coiled-coil dans la maladie. Les souris Pkd1Δcoiled-coil croisées par Pkd1-/- (létale à la naissance), Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil survivent après la naissance et permettent d’analyser in vivo les interactions, la signalisation et le rôle physiologique du motif coiled-coil. Ces souris Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil avec une copie du transgène présentent des kystes rénaux et meurent ~2 semaines alors que celles à hautes copies n’ont aucun phénotype comme les Pkd1TAG. Les résultats génétiques et biochimiques démontrent que Pc-1Δcoiled-coil est hypomorphe. Bien que Pc-1Δcoiled-coil subit son clivage autoprotéolytique, l’analyse du transport intracellulaire de Pc1Δcoiled-coil montre un délai de maturation. Alors qu’in vitro le trafic Pc-1/Pc-2 dépend du motif coiled-coil pour leur interaction, in vivo une interaction Pc-1Δcoiled-coil/Pc-2 est détectée, suggérant un site d’interaction distinct. Nos études in vivo démontrent que le motif coiled-coil de Pc-1 joue un rôle clé dans sa maturation et l’existence d’un nouveau partenaire de Pc-1 pour son transport intracellulaire. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most prevalent genetic disorder that is characterize by the formation of bilateral renal cysts and leads to kidney failure. It results from mutations in the PKD1/polycystin-1(PC-1) gene, containing a coiled-coil motif, and in the PKD2/PC-2 gene, the functions of which remain to be elucidated. From a bacterial artificial chromosome, the murine Pkd1 gene (Pkd1-BAC) was modified in order to obtain 4 transgenic mouse lines deleted from it coiled-coil motif (Pkd1Δcoiled-coil) and 3 Pkd1TAG control lines possessing 1-35 copies of the transgene. These two transgenes have an expression profile identical to the endogenous gene and their expression depends on the number of copies. While Pkd1TAG mice develop ADPKD with a severity proportional to the level of expression, the Pkd1Δcoiled-coil lines are spared. These results demonstrate the importance of the coiled-coil motif in the disease. Pkd1Δcoiled-coil mice crossed by Pkd1-/- (lethal by birth), Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil survive after birth and allow the interactions, signaling and physiological role of the coiled-coil motif to be analyzed in vivo. These Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil mice with one copy of the transgene show kidney cysts and die ~ 2-weeks while high-copy ones have no phenotype as opposed to Pkd1-/-; Pkd1TAG who eventually develop cyst after 1 year. The genetic and biochemical results demonstrate that Pc-1Δcoiled-coil is hypomorphic. Although Pc-1Δcoiled-coil undergoes its autoproteolytic cleavage, analysis of the intracellular transport of Pc-1Δcoiled-coil shows a delay in maturation. While Pc-1 and Pc-2 appear to interact in vitro through their coiled-coil motif and co-transport, a Pc-1Δcoiled-coil -Pc-2 interaction is conserved in the kidney, suggesting a distinct mechanism of interactions in vivo. Thus, our results show that the coiled-coil motif of Pc-1 in vivo is involved in the maturation independently of Pc-2, highlighting the existence of a critical partner in intracellular transport.

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes. / Autoimmune diabetes results from the destruction of the insulin-secreting pancreatic beta cells by the T lymphocytes of the immune system. This leads to a hormonal deficiency that can be regulated with daily injections of exogenous insulin. However, to date, there is no cure for autoimmune diabetes. A healthy immune system generally recognizes a multitude of antigens in order to ensure our defence against different pathogens and tumor cells. Yet, depending on genetic and/or environmental factors, individuals may develop T cells that are aberrantly activated following the recognition of self-antigens. This break in tolerance leads to the development of autoimmune pathologies, such as autoimmune diabetes. In order to limit autoimmunity, rigorous selection mechanisms eliminate the vast majority of the T lymphocytes that present a high affinity for self-antigens during their thymic development. However, some of these auto-reactive lymphocytes escape from the elimination processes and migrate to the periphery where they might encounter a self-antigen. It is then essential that peripheral mechanisms maintain the immune tolerance by abrogating the activation and the proliferation of these self-specific T lymphocytes. One of the means to inhibit aberrant immune responses is the generation of regulatory T lymphocytes. These cells, which can be of thymus or peripheral origin, display various phenotypes and can mediate their action through several mechanisms in order to inactivate and/or eliminate the cells that are implicated in the development of autoimmune diseases. The use of transgenic mouse models made it possible to identify a poorly characterized population of T lymphocytes that exhibit a regulatory potential, namely CD4-CD8- (double negative, DN T cells). Indeed, the proportion of DN T cells in lymphoid organs is inversely correlated to autoimmune predisposition. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells, as well as to reveal the genetic factors underlying the regulation of the proportion of DN T cells. iv We observed that through the release of cytolytic granules containing granzyme B and perforin, DN T lymphocytes exert a cytotoxic activity towards B cells in an antigen-specific manner. In addition, we have established that a single injection of those DN T cells is sufficient to inhibit the development of autoimmune diabetes in highly susceptible transgenic mice. The use of CD47 deficient mice also demonstrated that the CD47-Sirp pathway is essential to maintain DN T cell proportion. Also, we identified that the autoimmune diabetes susceptibility locus Idd13, which contains Sirp participates in defining the proportion of DN T cells. Finally, a genetic analysis revealed that other loci are implicated in the control of the DN T cell population. Among those, the role of a locus situated in the proximal region of chromosome 12 has been validated through to the generation of congenic mice. The results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the biology and genetic regulation of DN T lymphocytes. This knowledge constitutes an important step towards the creation of innovative cellular therapies that may prevent and cure a diversity of autoimmune pathologies.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Preeclampsia is among the leading causes of perinatal mortality and morbidity, affecting 2-7% of pregnancies. Its incidence increases to 10-25% in already hypertensive women. To date, no treatment, aside from delivery, is known. Interestingly, several studies have reported that exercise training (ExT) can reduce preeclampsia prevalence although the available studies are considered insufficient. Therefore, the aim of this study is to determine the impact of ExT when practiced before and during gestation on pregnancy outcome in a mouse model of preeclampsia superimposed on chronic hypertension (SPE). To do so, mice overexpressing both human angiotensinogen and renin (R+A+) were used because they are hypertensive at baseline and they develop many hallmark features of SPE. Mice were trained by placing them in a cage with access to a running wheel 4 weeks before and during gestation. ExT in this study prevented the rise in blood pressure at term observed in the sedentary transgenic mothers. This may be realized through an increased activity of the angiotensin-(1-7) axis in the aorta. In addition, ExT prevented the increase in albumin/creatinine ratio. Moreover, placental alterations were prevented with training in transgenic mice, leading to improvements in placental and fetal development. Placental mRNA and circulating levels of sFlt-1 were normalized with training. Additionally, the increase in angiotensin II type I receptor and the decrease in Mas receptor protein were reversed with training. ExT appears to prevent many SPE-like features that develop in this animal model and may be of use in the prevention of preeclampsia in women. / La prééclampsie est l’une des causes primaires de mortalité et morbidité périnatales, touchant 2-7% des grossesses. Sa prévalence augmente à 10-25% chez les femmes hypertendues. Jusqu’à maintenant, aucun traitement, mis à part l’accouchement précoce, n’est connu. Néanmoins, plusieurs études épidémiologiques suggèrent une diminution de l’incidence de la prééclampsie chez les femmes entraînées quoique, ces études sont considérées insuffisantes. Ainsi, le but de cette étude est de déterminer si l’entraînement avant et pendant la grossesse prévient la maladie dans un modèle animal de prééclampsie superposée à de l’hypertension chronique (SPE). Nous avons utilisé des souris double transgéniques, surexpirmant la rénine et l’angiotensinogène humaines (R+A+), puisqu'elles sont hypertensives à la base, et développent plusieurs symptômes de la prééclampsie. Pour l'entraînement, les souris ont été mises dans des cages d’exercice 4 semaines avant leur grossesse et y sont restées jusqu’au sacrifice. L'entraînement physique a prévenu la hausse de pression artérielle en fin de gestation présente chez les souris R+A+ sédentaires, possiblement via l’axe de l’angiotensine-(1-7). Le rapport entre l’albumine: créatinine a également été réduit avec l’entraînement. Les altérations placentaires ont été prévenues chez les souris entraînées, améliorant le développement placentaire et fœtal. Ceci était accompagné d'une normalisation de sFlt-1 circulant et placentaire. De plus, l’augmentation du récepteur à l’angiotensine II de type 1 et la diminution du récepteur Mas dans le placenta étaient renversées. L’entraînement semble prévenir plusieurs symptômes de la SPE dans un modèle animal suggérant qu'il pourrait être d'une grande utilité dans la prévention de la maladie chez la femme.

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs. / Autoimmune diseases are chronic and often invalidating disorders affecting more than 5% of the population in developed countries. Autoimmunity results from a breach in tolerance mechanisms towards autoantigens expressed in tissues and organs leading to the destruction of one or more target-organs by T and/or B lymphocytes. Autoimmune hepatitis and autoimmune diabetes are characterised by selective destruction of hepatocytes or pancreatic beta cells respectively. Accumulating evidences suggest a direct implication for CD8+ T cells in initiation, progression and regulation processes associated with many autoimmune diseases. To study the development of CD8+ T cell clones towards a particular antigen whose expression site was different, we developed two new double transgenic mice models. Each mice model was obtained after breeding of a mouse expressing a TCR specific for the nucleoprotein (NP) from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) with a second mouse expressing this LCMV-NP either 1) exclusively in hepatocytes (autoimmune hepatitis model), or 2) broadly in the pancreas and thymus (autoimmune diabetes model). The functional avidity of the NP-specific CD8+ T cells clones in TCR transgenic mice lines was inversely correlated with their respective TCR expression level. The lymphocyte repertoire was characterized in each line of double transgenic mouse, and functional capacities and phenotype (activation/memory markers) of NP-reactive CD8+ T cells were assessed. Both new models of double transgenic mice showed that NP-reactive CD8+ T cells could break central and peripheral tolerance and provoke a spontaneous autoimmune response. In the autoimmune hepatitis model, where autoantigen was expressed only in the liver, overexpression of the transgenic TCR led to massive thymic deletion of the NP-specific CD8+ T cells and no hepatitis developed, whereas TCR expression matching wild-type level allowed positive selection of autoreactive CD8+ T cells which accumulated in the liver, became activated and led to hepatitis development. In the autoimmune diabetes model, where autoantigen was expressed both in the pancreas and thymus, both double transgenic mouse lines showed a partial thymic deletion of NP-specific CD8+ T cells, regardless of the TCR expression level. Only adult male mice developed spontaneous diabetes, and a population of their autoreactive CD8+ T cells expressed a singular combination of activation/memory markers (CD44, CD122, PD-1) which was not seen in female and healthy male mice. The study of the tolerance of autoreactive CD8 + T cells in our two new double transgenic mouse models led us to identify alternative mechanisms potentially involved in tolerance and activation, and to better understand the role of autoreactive CD8 + T cells in the autoimmune processes leading to autoimmune hepatitis and autoimmune diabetes. These findings will be useful in developing new therapeutic approaches targeting autoreactive CD8+ T cells

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), ou maladie de Steinert, est une maladie qui touche plusieurs tissus, dont le système nerveux central (SNC). L’atteinte neurologique est variable et inclut des troubles de la fonction exécutive, des changements de comportement et une hypersomnolence dans la forme adulte, ainsi qu’une déficience intellectuelle marquée dans la forme congénitale. Dans leur ensemble, les symptômes neurologiques ont un fort impact sur le parcours académique, professionnel et les interactions sociales. Aujourd’hui aucune thérapie n’existe pour cette maladie. La DM1 est due à une expansion anormale d’un triplet CTG non-codant dans le gène DMPK. Les ARN messagers DMPK, porteurs de l’expansion, s’accumulent dans le noyau des cellules (sous forme de foci) et perturbent la localisation et la fonction de protéines de liaison à l’ARN, notamment des familles MBNL et CELF, ce qui entraîne des défauts d’épissage alternatif, d’expression, de polyadenylation et de localisation d’autres ARN cibles. Malgré le progrès récent dans la compréhension des mécanismes de la maladie, les aspects cellulaires et moléculaires de l’atteinte neurologique restent méconnus: nous ne connaissons ni la contribution de chaque type cellulaire du cerveau, ni les voies moléculaires spécifiquement dérégulées dans chaque type cellulaire. L’objectif de ma thèse a été de répondre à ces deux questions importantes en utilisant un modèle de souris transgéniques et des cellules primaires dérivées de celui-ci. Pour mon projet, j’ai utilisé les souris DMSXL générées par mon laboratoire. Ces souris reproduisent des caractéristiques importantes de la DM1, notamment l’accumulation des ARN toxiques et la dérégulation de l’épissage alternatif dans plusieurs tissus. L’impacte fonctionnel des transcrits DMPK toxiques dans le SNC des souris DMSXL se traduit par des problèmes comportementaux et cognitifs et par des défauts de la plasticité synaptique. Afin d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces anomalies, une étude protéomique globale a montré une dérégulation de protéines neuronales et astrocytaires dans le cerveau des souris DMSXL. De plus, l’étude de la distribution des foci d’ARN dans les cerveaux des souris et des patients a montré un contenu plus élevé dans les astrocytes par rapport aux neurones. Ensemble, ces résultats suggèrent une contribution à la fois neuronale et gliale dans la neuropathogenèse de la DM1. L’étude protéomique globale des cerveaux des souris DMSXL, a aussi montré des défauts de protéines synaptiques spécifiques des neurones, que nous avons par la suite validés dans le cerveau des patients. SYN1 est hyperphosphorylée d’une façon CELF-dépendante et RAB3A est surexprimé en réponse à l’inactivation de MBNL1. Les protéines MBNL et CELF régulent l’épissage alternatif d’un groupe de transcrits au cours du développement, et leur dérégulation dans la DM1 entraîne l’expression anormale d’isoformes d’épissage embryonnaires dans le tissu adulte. Dans ce contexte, j’ai étudié si les défauts des protéines RAB3A et SYN1 sont associés à une dérégulation d’épissage, et si les anomalies des protéines synaptiques identifiées dans la DM1 reproduisent des évènements embryonnaires de la régulation de RAB3A et SYN1. Mes résultats indiquent que les défauts de ces protéines dans les cerveaux adultes ne sont pas dus à une altération de l’épissage alternatif des transcrits et ne recréent pas des évènements embryonnaires. La neuropathogenèse de la DM1 va, donc, au delà de la dérégulation de l’épissage et d’autres voies moléculaires restent à explorer dans les cerveaux DM1. Afin d’identifier des sous-populations cellulaires susceptibles à l’accumulation des ARN toxiques, nous avons étudié la distribution des foci dans plusieurs régions cérébrales. (...) / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe disorder that affects many tissues, including the central nervous system (CNS). The degree of brain impairment ranges from executive dysfunction, attention deficits, low processing speed, behavioural changes and hypersomnia in the adult form, to pronounced intellectual disability in the congenital cases. The neurological manifestations have a tremendous impact on the academic, professional, social and emotional aspects of daily life. Today there is no cure for this devastating condition. DM1 is caused by the abnormal expansion of a CTG trinucleotide repeat in the 3’UTR of the DMPK gene. Expanded DMPK transcripts accumulate in RNA aggregates (or foci) in the nucleus of DM1 cells, disrupting the activity of important RNA-binding proteins, like the MBNL and CELF families, and leading to abnormalities in alternative splicing, gene expression, RNA polyadenylation, localisation and translation. In spite of recent progress, fundamental gaps in our understanding of the molecular and cellular mechanisms behind the neurological manifestations still exist: we do not know the contribution of each cell type of the CNS to brain dysfunction, or the molecular pathways specifically deregulated in response to the CTG expansion. The aim of my PhD project has been to gain insight into these two important questions using a relevant transgenic mouse model of DM1 and cell cultures derived thereof. In my studies I used the DMSXL mice, previously generated in my host laboratory. The DMSXL mice express expanded DMPK mRNA with more than 1,000 CTG repeats. They recreate relevant DM1 features, such as RNA foci and missplicing in multiple tissues. The functional impact of expanded DMPK transcripts in the CNS of DMSXL mice translates into behavioural and cognitive abnormalities and defective synaptic plasticity. To identify the molecular mechanisms behind these abnormalities, a global proteomics analysis revealed changes in both neuron-specific and glial-specific proteins in DMSXL brain. We also investigated RNA foci in DMSXL and human DM1 brains and found non-homogenous distribution between cell types, with a higher foci content in astrocytes relative to neurons. Together these results suggest that both neuronal and glial defects contribute to DM1 neuropathogenesis. The global proteomics analysis of DMSXL brains also identified abnormalities in neuronal synaptic proteins that we have validated in human brain samples. SYN1 is hyperphosphorilated in a CELF-dependent manner while RAB3A is upregulated in association with MBNL1 depletion. CELF and MBNL proteins regulate the alternative splicing of a subset of transcripts throughout development, and their deregulation in DM1 leads to abnormal expression of fetal splicing isoforms in adult DM1 brains. In this context, I have studied if RAB3A and SYN1 deregulations observed in adult brains are associated with splicing abnormalities or if they recreated embryonic expression and phosphorylation events. My results indicate that the synaptic proteins abnormalities observed in adult DMSXL brains are not caused by defective alternative splicing and do not recreate embryonic events. Thus, DM1 neuropathogenesis goes beyond missplicing and other molecular pathways must be explored in DM1 brains. To better understand the cellular sub-populations susceptible of accumulating toxic RNA foci we have studied foci distribution in different brain regions. We identified pronounced accumulation of toxic RNAs in Bergman astrocytes of DMSXL mice cerebellum and DM1 patients, associated with neuronal hyperactivity of Purkinje cells. A quantitative proteomics analysis revealed a significant downregulation of GLT1 – a glial glutamate transporter expressed by the Bergmann cell in the cerebellum. I have confirmed the GLT1 downregulation in other brain regions of mouse and human brain. (...)

La maladie d'Alzheimer est la démence neurodégénérative la plus fréquente, en particulier chez les personnes âgées. A l'heure actuelle, aucun traitement ne permet d'arrêter efficacement le développement de la maladie. Le tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmethanamine (ANAVEX2-73) est un composé mixte avec une affinité modérée, de l'ordre du µM pour les récepteurs muscariniques et les récepteurs sigma-1. Des données préliminaires ont montré que la molécule avait des propriétés anti-amnésiantes et neuroprotectrices dans un modèle non transgénique de la maladie d'Alzheimer. L'objectif de cette thèse est de poursuivre le développement préclinique de la molécule. Nous avons montré, d'abord dans un modèle non-transgénique de la maladie d'Alzheimer, le modèle d'injection de peptide AB(25-35) oligomérisé chez la souris, que la molécule prévient l'hyperphosphorylation de la protéine Tau ainsi que la production du peptide AB(1-42), deux éléments clés de la physiopathologie de la maladie. Nous avons utilisé ce même modèle pour montrer que l'ANAVEX2-73 prévient les déficits de la fonction mitochondriale, qui sont présents de manière constante et précoce chez les patients. Enfin, nous avons montré qu'un traitement chronique de deux mois avec le composé, dans un modèle de souris transgéniques de la maladie, permet de restaurer les capacités cognitives chez les souris, de diminuer le stress oxydant et d'augmenter les marqueurs synaptiques. Cependant le traitement n'a pas permis de réduire la charge amyloïde dans le cerveau des souris. L'ensemble de ces résultats est encourageant pour le développement futur de la molécule, puisque cette dernière, en plus d'être neuroprotectrice et anti-amnésiante semble être efficace sur les éléments clés de la physiopathologie de la maladie. / Alzheimer's disease is the most common form of dementia in the elderly. There is however no efficient treatment to stop the disease progression. Tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmetanamine (ANAVEX2-73) is a mixed compound with moderate affinity for muscarinic and sigma-1 receptors. Preliminary data showed ANAVEX2-73 had anti-amnesic and neuroprotective poperties, in a non-transgenic model of Alzheimer's disease. The aim of this thesis is to improve knowledge about preclinical data of this molecule. We first showed that, in the non-transgenic AB(25-35) mouse model, ANAVEX2-73 prevented Tau protein hyperphosphorylation and AB(1-42) peptide seeding, two key parameters involved in Alzheimer's disease physiopathology. We also used this model tho show that ANAVEX2-73 prevented mitochondrial dysfunction, consistently reported as an early event of the disease in patients. The last part of this thesis showed that a two-month chronic treatment with ANAVEX2-73 in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease reversed cognitive dysfunction and prevented loss of synaptic markers and increased of oxidative stress. However, we could not show a decrease of amyloid load in mouse brain after chronic treatment. Altogether, these results suggest that ANAVEX2-73 treatment could be effective to treat Alzheimer's disease. In addition to its neuroprotective and anti-amnesic property, it also prevents key hallmarks involved in the physiopathology of Alzheimer's disease.

Nous avons recherché des protéines toxiques pour les pucerons (Homoptères, insectes piqueurs-suceurs phloémophages) et étudié le mode d'action de certaines d'entre elles. Ce travail constitue une première étape d'un programme de création de plantes résistantes aux pucerons par génie génétique. <br />Les caractéristiques toxicologiques de nombreuses protéines sont évaluées par des tests d'ingestion sur milieux artificiels définis. Des lectines d'origine végétale se liant au mannose présentent des propriétés toxiques intéressantes. Notre étude porte sur la Concanavaline A (lectine de Canavalia ensiformis [L.] DC, ConA) qui est une lectine modèle très étudiée du point de vue biochimique, et la lectine du perce-neige (Galanthus nivalis L., GNA) dont les caractéristiques en font un bon candidat à l'application envisagée. <br />Nous mettons en évidence une variabilité de la toxicité des lectines à mannose chez six espèces de pucerons. La ConA est moins active sur les espèces polyphages. Elle n'est pas phagorépulsive pour notre puceron modèle, Acyrthosiphon pisum (Harris) et agit en quelques heures aux doses moyennes, notamment en inhibant l'ingestion. Une adaptation comportementale à moyen terme (24 h-48 h) est également mise en évidence. Des techniques de marquage révèlent que la cible physiologique primaire de la ConA est la portion antérieure du mésentéron. Elle s'y fixe en très grande quantité. Après liaison aux cellules épithéliales, la lectine induit une hypertrophie de ces cellules et un détachement de leur membrane apicale. Des expériences de compétition lectines/mannosides indiquent que la liaison toxine-épithélium ne semble pas dépendre uniquement d'une interaction sucre-lectine. Nous observons également une forte perturbation du métabolisme des acides aminés des pucerons. Le mode d'action de la ConA et de la GNA diffèrent sensiblement sur ce point. <br />Les premiers tests biologiques effectués sur des pommes de terre transgéniques exprimant de manière constitutive le gène de la GNA sont variables mais prometteurs.