Parmi les insectes phytophages, les pucerons sont particuliers car ils se nourrissent de sève élaborée. Leurs pièces buccales leur permettant d'effectuer des piqûres dans la plante et d'atteindre les faisceaux du phloème, un compartiment dont le ratio protéines/acides aminés est très déséquilibré. C'est pourquoi, dans ce contexte, les pucerons sont réputés comme ne possédant pas l'arsenal enzymatique permettant une bonne utilisation des protéines. Aussi les stratégies utilisant les inhibiteurs de protéases (IP) comme polypeptide entomotoxique ne semblent pas adaptées a priori à ce groupe d'insectes. Or plusieurs IP ont montré des toxicités paradoxales contre les pucerons.<br />Cette étude a pour objectif d'accroître la disponibilité des gènes d'IP originaux et d'en comprendre le mode d'action afin d'en maîtriser l'introduction raisonnée dans les programmes de lutte variétale. <br />Au cours de ce travail de thèse, des informations sur la protéolyse digestive des Homoptères ont été apportées : des protéases à cystéine, les cathepsines (enzymes lysosomiales) sont spécifiquement exprimées dans le tube digestif et dans un organe spécialisé, le bactériocyte. Elles sont la cible potentielle d'inhibiteurs de protéases à cystéine. Lorsque l'Oryzacystatine (inhibiteur de protéase à cystéine, isolé du grain de riz) est exprimé dans le colza, la fécondité du puceron Mysus persicae diminue de 25%. Ce résultat démontre qu'il est donc possible d'exprimer des IP dans le phloème pour lutter contre les pucerons. L'amélioration, par mutagenèse dirigée, d'un inhibiteur de protéases à sérine, isolé du pois, a aussi été effectuée mais son expression hétérologue dans Pichia pastoris ou Arabidospsis thaliana n'a pas permis d'obtenir une forme active. <br />Nous avons cherché à élargir le pool de gènes disponible pour lutter contre les pucerons. L'isolement d'un inhibiteur de protéases à cystéine de l'hémolymphe du puceron a été entrepris au niveau moléculaire et biochimique. Ces résultats démontrent que les IP constituent une nouvelle voie pour lutter contre les pucerons.

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes. / Autoimmune diabetes results from the destruction of the insulin-secreting pancreatic beta cells by the T lymphocytes of the immune system. This leads to a hormonal deficiency that can be regulated with daily injections of exogenous insulin. However, to date, there is no cure for autoimmune diabetes. A healthy immune system generally recognizes a multitude of antigens in order to ensure our defence against different pathogens and tumor cells. Yet, depending on genetic and/or environmental factors, individuals may develop T cells that are aberrantly activated following the recognition of self-antigens. This break in tolerance leads to the development of autoimmune pathologies, such as autoimmune diabetes. In order to limit autoimmunity, rigorous selection mechanisms eliminate the vast majority of the T lymphocytes that present a high affinity for self-antigens during their thymic development. However, some of these auto-reactive lymphocytes escape from the elimination processes and migrate to the periphery where they might encounter a self-antigen. It is then essential that peripheral mechanisms maintain the immune tolerance by abrogating the activation and the proliferation of these self-specific T lymphocytes. One of the means to inhibit aberrant immune responses is the generation of regulatory T lymphocytes. These cells, which can be of thymus or peripheral origin, display various phenotypes and can mediate their action through several mechanisms in order to inactivate and/or eliminate the cells that are implicated in the development of autoimmune diseases. The use of transgenic mouse models made it possible to identify a poorly characterized population of T lymphocytes that exhibit a regulatory potential, namely CD4-CD8- (double negative, DN T cells). Indeed, the proportion of DN T cells in lymphoid organs is inversely correlated to autoimmune predisposition. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells, as well as to reveal the genetic factors underlying the regulation of the proportion of DN T cells. iv We observed that through the release of cytolytic granules containing granzyme B and perforin, DN T lymphocytes exert a cytotoxic activity towards B cells in an antigen-specific manner. In addition, we have established that a single injection of those DN T cells is sufficient to inhibit the development of autoimmune diabetes in highly susceptible transgenic mice. The use of CD47 deficient mice also demonstrated that the CD47-Sirp pathway is essential to maintain DN T cell proportion. Also, we identified that the autoimmune diabetes susceptibility locus Idd13, which contains Sirp participates in defining the proportion of DN T cells. Finally, a genetic analysis revealed that other loci are implicated in the control of the DN T cell population. Among those, the role of a locus situated in the proximal region of chromosome 12 has been validated through to the generation of congenic mice. The results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the biology and genetic regulation of DN T lymphocytes. This knowledge constitutes an important step towards the creation of innovative cellular therapies that may prevent and cure a diversity of autoimmune pathologies.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Preeclampsia is among the leading causes of perinatal mortality and morbidity, affecting 2-7% of pregnancies. Its incidence increases to 10-25% in already hypertensive women. To date, no treatment, aside from delivery, is known. Interestingly, several studies have reported that exercise training (ExT) can reduce preeclampsia prevalence although the available studies are considered insufficient. Therefore, the aim of this study is to determine the impact of ExT when practiced before and during gestation on pregnancy outcome in a mouse model of preeclampsia superimposed on chronic hypertension (SPE). To do so, mice overexpressing both human angiotensinogen and renin (R+A+) were used because they are hypertensive at baseline and they develop many hallmark features of SPE. Mice were trained by placing them in a cage with access to a running wheel 4 weeks before and during gestation. ExT in this study prevented the rise in blood pressure at term observed in the sedentary transgenic mothers. This may be realized through an increased activity of the angiotensin-(1-7) axis in the aorta. In addition, ExT prevented the increase in albumin/creatinine ratio. Moreover, placental alterations were prevented with training in transgenic mice, leading to improvements in placental and fetal development. Placental mRNA and circulating levels of sFlt-1 were normalized with training. Additionally, the increase in angiotensin II type I receptor and the decrease in Mas receptor protein were reversed with training. ExT appears to prevent many SPE-like features that develop in this animal model and may be of use in the prevention of preeclampsia in women. / La prééclampsie est l’une des causes primaires de mortalité et morbidité périnatales, touchant 2-7% des grossesses. Sa prévalence augmente à 10-25% chez les femmes hypertendues. Jusqu’à maintenant, aucun traitement, mis à part l’accouchement précoce, n’est connu. Néanmoins, plusieurs études épidémiologiques suggèrent une diminution de l’incidence de la prééclampsie chez les femmes entraînées quoique, ces études sont considérées insuffisantes. Ainsi, le but de cette étude est de déterminer si l’entraînement avant et pendant la grossesse prévient la maladie dans un modèle animal de prééclampsie superposée à de l’hypertension chronique (SPE). Nous avons utilisé des souris double transgéniques, surexpirmant la rénine et l’angiotensinogène humaines (R+A+), puisqu'elles sont hypertensives à la base, et développent plusieurs symptômes de la prééclampsie. Pour l'entraînement, les souris ont été mises dans des cages d’exercice 4 semaines avant leur grossesse et y sont restées jusqu’au sacrifice. L'entraînement physique a prévenu la hausse de pression artérielle en fin de gestation présente chez les souris R+A+ sédentaires, possiblement via l’axe de l’angiotensine-(1-7). Le rapport entre l’albumine: créatinine a également été réduit avec l’entraînement. Les altérations placentaires ont été prévenues chez les souris entraînées, améliorant le développement placentaire et fœtal. Ceci était accompagné d'une normalisation de sFlt-1 circulant et placentaire. De plus, l’augmentation du récepteur à l’angiotensine II de type 1 et la diminution du récepteur Mas dans le placenta étaient renversées. L’entraînement semble prévenir plusieurs symptômes de la SPE dans un modèle animal suggérant qu'il pourrait être d'une grande utilité dans la prévention de la maladie chez la femme.

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes T CD8 ont un rôle essentiel dans la protection contre les agents pathogènes intracellulaires et la progression tumorale. Ainsi, la compréhension de la diversité des mécanismes de différenciation des lymphocytes T CD8 naïfs en cellules effectrices, ainsi qu’en cellules mémoires compétentes, est fondamentale pour le développement efficace de vaccins à cellules T. Dans ce travail de thèse, nous avons abordé deux questions centrales : (1)Très tôt après l’activation des cellules T CD8, quels sont les mécanismes par lesquels les cellules T effectrices agissent comme effecteurs pro-inflammatoires en recrutant d’autres cellules? Et quel est leur rôle dans la réponse immunitaire? (2) Quel est le rôle du contexte infectieux dans le programme de différenciation des lymphocytes T CD8 ? Est-il responsable de l’hétérogénéité des cellules répondeuses et a-t-il un rôle dans les différents effets protecteurs des cellules mémoires? Afin de répondre à ces questions, nous avons choisit d’utiliser des cellules T CD8 exprimant un récepteur pour l’antigène transgéniques (TCR-Tg) pour suivre la différentiation in vivo des lymphocytes T CD8. De plus, la méthode de RT-PCR sur des séries de cellules uniques, nous a permis d’analyser la co-expression des ARNm dans ces cellules. Comme l’utilisation à haute fréquence de cellules TCR-Tg a été fortement critiquée, nous avons comparé la différenciation de ces cellules avec celle des cellules endogènes (non transgéniques et rares). Dans ce premier manuscrit nous avons observé un comportement similaire, ce qui a renforcé l'avantage d'utiliser des cellules TCR Tg pour étudier les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8. De plus, nous avons conclu que la diversité des réponses immunitaires des lymphocytes T CD8 n’est pas conditionnée par la fréquence de cellules naïves. Dans un deuxième manuscrit, nous avons comparé la réponse des cellules OT1 TCR-Tg (spécifiques de l’antigène OVA) à l'infection bactérienne LM-OVA (Listeria Monocytogènes exprimant OVA) avec la réponse des cellules P14 TCR-Tg (spécifiques de l’épitope GP33) à l’infection par le virus LCMV. Nous avons montré que les cellules OT1, stimulées par l’OVA dans un contexte bactérien (LM-OVA), présentent un profil d’expression génique distinct de celui des cellules P14 stimulées par le GP33 dans un contexte viral (LCMV). Nous avons également co-stimulé les cellules P14 et OT1 dans une même souris suivant le même contexte bactérien avec LM-GP33 et LM-OVA. Dans ce cas, nous n’avons pas observé de différence dans le profil d’expression génique. L’ensemble des résultats démontrent que les stimulations spécifiques des cellules T CD8 par différents agents pathogènes génèrent des cellules T CD8 présentant des caractéristiques différentes qui ne sont pas déterminées par la spécificité du TCR mais plutôt par le contexte infectieux. De plus, nous avons montré que les cellules mémoires endogènes résultant de la stimulation des CD8 en présence de LCMV ont été plus efficaces après une deuxième réponse immunitaire que des cellules mémoires générées après stimulation avec LM-GP33 (bactérie). Nous avons également observé que la protection plus efficace dans le contexte viral est associée à des cellules T CD8 qui présentent un phénotype de cellules T mémoires effectrices (TEM) tandis que les cellules T CD8 générées dans un contexte bactérien ont plutôt un phénotype associé aux cellules T mémoires centrales (TCM). Ces résultats démontrent que différents pathogènes induisent différents profils de différentiation des cellules T CD8 et que malgré l’élimination efficace des différents pathogènes dans une réponse primaire, la qualité des cellules mémoires générées au cours de cette réponse peut être différente. Dans un troisième manuscrit, nous avons étudié les mécanismes de recrutement d’autres cellules par les lymphocytes T CD8 activés à un temps précoce de la réponse immunitaire. (...) / CD8 T cells are essential for the elimination of intracellular pathogens and tumor cells. Understanding how naïve CD8 T cells differentiate into effector cells capable of eliminating pathogens and to generate adequate memory cells during immune responses is fundamental for optimal T cell vaccine design. In this PhD thesis work we addressed two central questions: 1) What are the mechanisms by which early effector T cells could act as pro-inflammatory effectors? And what is their role in the immune response? 2) How heterogeneous are CD8 responses? Could different pathogens modulate CD8 T cell differentiation programs and be responsible for CD8 cell-to-cell heterogeneity? Could they also generate memory cells with different protection capacities? To address these questions related to the diversity of CD8 T cell differentiation during immune responses, we used the single cell RT-PCR technique to detect ex vivo expression of mRNA in each individual cell, and Brefeldin A injected mice to detect ex vivo intracellular proteins. As experimental system to evaluate in vivo cell activation we used T cell receptor transgenic (TCR-Tg) CD8 T cells. Since the use of TCR-Tg cells to study immune responses has been subjected to criticism (due to high frequency of naïve-precursor transfers), in a first Ms. we compared the behavior of TCR-Tg and endogenous (non-transgenic and present at low frequency) cells in the same mouse. We found fully overlapping behavior between these two cell populations, which reinforced the advantage of using TCR-Tg cells to study CD8 immune responses. In addition, we concluded that the frequency of naïve-precursors do not induce diversity on CD8 T cell differentiation patterns. In a second Ms. we evaluated the impact of different pathogens in the diversity of CD8 T cell properties during two different immune responses: OT1 TCR-Tg cells (specific for OVA antigen) in the response to LM-OVA (Listeria Monocytogenes expressing OVA) infection; and P14 TCR-Tg cells (specific for GP33 epitope) in the response to Lymphocytic choriomeningitis vírus (LCMV) infection. We found that OT1 and P14 cells had different properties. As this difference could also be attributed to the different TCR avidity between OT1 and P14 cells, we then compared the behavior of P14 and OT-1 cells in the same mouse, co-injected with LM-OVA and LM-GP33. Since no differences were then detected, these results demonstrated that priming with different pathogens generates CD8 T cells with different characteristics that are not determined by TCR usage, but rather by the infection context. In addition, when looking for the protection capacity of endogenous CD8 memory cells generated in bacterial or viral context, we found that memory cells generated after LCMV priming were more efficient in responding to a second challenge, than memory cells generated after LM-GP33 priming. We also found that this better protection is associated with a T cell effector memory (TEM) phenotype associated with the LCMV infection, in contrast with a T cell central memory (TCM) phenotype generated after LM-OVA infection. These results demonstrate that different pathogens are responsible for diversity of CD8 T cell differentiation patterns and that even when distinct pathogens are efficiently eliminated during the primary immune response the quality of the memory generated may differ. In a third Ms. we studied the mechanisms by which effector CD8 T cells attracted other cell types in the early days of an immune response. We used two experimental systems: the response of OT1 TCR-Tg cells to LM-OVA infection; and the response of anti-HY TCR-Tg cells to male cells (“sterile”-non infectious context). In both cases we found that immediately after activation, CD8 T cells expressed high levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines (such as TNFα, XCL1, CCL3 and CCL4). (...)

Superviseur : Dr. Piet Van Vliet Collaborateurs: Dr. Alexandre Dubrac, Dr. Martin Smith / Résumé INTRODUCTION : Les maladies valvulaires du cœur surviennent dans 2% de la population, impliquant souvent un reflux sanguin dû au rétrécissement de la valve. Nous avons récemment identifié deux familles non apparentées étant atteintes par une sténose aortique. Le séquençage exomique des familles a révélé une mutation entrainant une perte de fonction homozygote pour le gène ADAMTS19. La relation entre la perturbation du gène ADAMTS19 et la sténose a été reproduite et donc confirmée grâce à une souris ADAMTS19-LACZ KO/KO. Cette souris montre également que ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les cellules valvulaires interstitielles (VICs) dans les valves. Le rôle d’ADAMTS19 durant le développement des valves reste inconnu. Pour analyser le patron d’expression d’ADAMTS19 pendant le développement du cœur, nous avons obtenu un modèle de souris transgénique contenant une CRE-tamoxifen inductible (Cre-ERT2) qui est exprimé sous l’influence du promoteur humain ADAMTS19. HYPOTHESE/OBJECTIF : Nous émettons l’hypothèse que le promoteur humain d’ADAMTS19 inséré dans la souris ADAMTS19-Cre-ERT2 contient toutes les séquences régulatrices permettant d’exprimer le gène ADAMTS19 et que ADAMTS19 est principalement exprimé au niveau des cellules valvulaires interstitielles dans les valves. L’objectif est de caractériser le patron d’expression d’ADAMTS19 en analysant sa distribution durant le développement grâce à une souris reportrice tdTomato. Comme ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les VICs, cet outil transgénique permettrait d’étudier ces cellules durant le développement. METHODE/RESULTAT : Suite à une étude in silico le promoteur ADAMTS19 est apparu comme extrêmement conservé. Par conséquent, pour analyser l’expression d’ADAMTS19 nous avons obtenu une souris BAC ADAMTS19-Cre-ERT2 contenant la séquence conservée que nous avons croisé avec une souris reportrice tdTomato. Le Tamoxifen est administré aux femelles gestantes par gavage aux jours embryonnaires E9,5, E11,5 ainsi que E13,5, et les cœurs sont extrait a E16,5. Des coupes de cœurs embryonnaires vont permettre d’identifier la localisation et la morphologie des cellules marquées. L’expression d’ADMATS19 dans les cellules valvulaires interstitielles est consistant avec le fait qu’ADAMTS19 est connu pour affecter les valves durant le développent et dans le cas de maladie valvulaire. Cependant, le patron des valves n’est pas reproductible au travers des générations. De plus, nous observons qu’ADAMTS19 est marqué dans des cellules des oreillettes et ventricule dans une lignée et dans une sous population de cellules de l’artère pulmonaire dans une autre. CONCLUSION : L’analyse des séquences de chaque lignée par séquençage permettre d’investiguer la raison de ses différents patrons et de mettre en évidence des régulateurs spécifiques. / BACKGROUND: Valvular heart disease (VHD) occurs in ~2% of the general population, often resulting in reduced or disturbed blood flow. We recently identified two unrelated families with recessive inheritance patterns of progressive polyvalvular heart disease in absence of any clear syndromic phenotype. Exome sequencing revealed homozygous, rare, loss of function (LOF) alleles in both families for the gene ADAMTS19. The relation between ADAMTS19 mutation and aortic stenosis were confirm via an ADAMTS19-LacZ KO/KO mouse model. This model also shows that ADAMTS19 is specific of VICs during valve development. The ADAMTS protein family includes 19 proteases that are involved in matrix remodeling, and tissue homeostasis in development and disease. However, the role of ADAMTS19 specifically during valve development remains unknown. We aim to characterize ADAMTS19 expression using a BAC transgenic ADMTS19-CRERT2 mouse. HYPOTHESE/OBJECTIVE We hypothesize that the BAC used to make the ADMTS19-CRERT2 mouse contains all the regulatory elements to express it and also that its expression will be specific to the VICs. The objective is to establish the ADAMTS19- CREERT2 and therefore to create a new tool to study VICs in vivo. METHODS/RESULTS: In silico analysis of the human and mouse ADAMTS19 genomic regions showed a high level of conservation. Thus, to analyze ADAMTS19 expression patterns during mouse development, we obtained a BAC transgenic mouse model containing a tamoxifen inducible Cre (CreERT2) that is expressed under the influence of the human ADAMTS19 promoter and surrounding genomic region. We crossed males from several lines created in parallel with Rosa-tdTomato reporter females to generate offspring in which expression of the fluorescent tdTomato reporter is activated in ADAMTS19-expressing cells upon tamoxifen administration. Surprisingly, whole mount imaging of embryos induced at E13.5 and isolated at E16.5 revealed strong, but distinct labelling patterns in offspring from different ADAMTS19CreERT2 sublines. Whereas one line exclusively labelled VICs, consistent with ADAMTS19 in situ RNA expression data from the Eurexpress database, another line specifically labelled cells in atrial and ventricular, but not VICs. A third line seems to label only a subset of cells in the pulmonary artery. Labeling of ADAMTS19-positive VICs is consistent with ADAMTS19 affecting valve development and VHD. In addition, we observed exclusive ADAMTS19-dependent labelling in atrial and ventricular cells or in a subset of pulmonary artery cells in two different sublines. CONCLUSION: The distinct expression patterns in offspring from different ADAMTS19-Cre-ERT2 lines indicates that although regulation of ADAMTS19 is conserved between human and mouse, expression in VICs versus other cells may be dependent on mutually exclusive regulatory mechanisms.

Le cancer de la vessie (BCa), est une tumeur maligne de l’urothélium, fréquente dans le monde entier, dont le traitement particulièrement coûteux ne permet cependant pas d’éviter les récidives et les progressions. FGFR3 est l'un des gènes les plus fréquemment mutés dans le BCa et les cellules tumorales sont dépendantes de son expression pour leur prolifération. La mutation FGFR3 S249C est fortement surreprésentée (62% des mutations récurrentes de FGFR3). Dans la première partie de ma thèse, en réalisant une étude de la signature de mutation, nous avons montré que cette surreprésentation de la mutation FGFR3 était liée à une pression sélective induite par la mutagenèse APOBEC et non due à un gain de fonction plus important induit par cette mutation. En plus de FGFR3 S249C, 44 mutations fréquentes (représentant près de la moitié des mutations fréquentes du BCa) ont été identifiées comme étant associées à la signature mutationnelle APOBEC et la plupart d'entre elles étaient surreprésentées par rapport à d'autres mutations au sein du même gène. Il est intéressant de noter que ces mutations associées à APOBEC incluaient à la fois de nouveaux ‘conducteurs’ et des ‘passagers’ fréquents potentiels et qu’elles pouvaient potentiellement prédire la réponse à l’immunothérapie et à un traitement anti-ATR (pas anti-ATM). Dans la deuxième partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux effets fonctionnels du gène FGFR3 dans le BCa. En utilisant un modèle de souris transgénique, nous avons apporté la première preuve in vivo selon laquelle cette mutation FGFR3 S249C conférait un pouvoir de transformation maligne. Ce processus était associé à une instabilité accrue du génome, activation de MYC et à une angiogenèse accrue, probablement induites par le facteur induisant l'hypoxie (HIF1A). En outre, nous avons caractérisé le réseau de régulation contrôlé par FGFR3 en analysant des données protéomiques obtenues par spectrométrie de masse à partir d'une lignée de cellules cancéreuses du cancer de la vessie portant la mutation FGFR3 S249C - UMUC14. Plusieurs voies de signalisation bien connues comme étant régulées par FGFR3 ont été identifiées. Nous avons également mis en évidence de nouvelles cascades de signalisation suite à l'activation de FGFR3 pouvant être jouer un rôle dans la progression tumorale, notamment un axe FGFR3 / HIF1A / angiogenèse qui a été validé dans certains modèles de BCa in vitro et in vivo. / Bladder cancer (BCa) is a worldwide frequent and costly urothelial malignancy. FGFR3 is one of the most frequently mutated genes in BCa and a driver of an oncogenic dependency. Here, we systematically catalogued the FGFR3 point mutation spectrum in BCa and identified 14 recurrent residues (frequency ≥ 2). One hotspot mutation - FGFR3 S249C - was strongly over-represented compared to other recurrent FGFR3 mutations (62% of all recurrent mutations). Based on in-depth investigation of mutational signature, we revealed that this over-representation of FGFR3 S249C mutation was merely favoured by APOBEC mutagenesis rather than a stronger functional selection compared to other oncodriver mutations on FGFR3. Similarly, together with FGFR3 S249C, 44 frequent mutations (accounts for nearly half of all frequent mutations in BCa) were pinpointed to be associated with APOBEC mutational signature and most of them were over-represented compared to other mutations within the same gene. Interestingly, these APOBEC-associated mutations included both novel potential ‘drivers’ as well as ‘frequent passengers’, and had a potential to predict responders for immunotherapy and anti-ATR but not anti-ATM treatment. On the other hand, we were interested in functional effects of FGFR3 activation in BCa. We provided the first in vivo evidence that FGFR3 S249C mutation conferred potency to BCa transformation using a transgenic mice model. This process was associated with increased genome instability, MYC activation and enhanced angiogenesis probably mediated by hypoxia-inducing factor (HIF1A). Further, we tried to characterize FGFR3-driven regulatory network through mass spectrometry based proteomic data generated in a BCa cell line bearing FGFR3 S249C mutation – UMUC14. As expected, several well-known FGFR3 regulated signaling pathways could be identified. Of note, we also highlighted some novel signaling cascades that may be relevant to FGFR3 activation, including a FGFR3/HIF1A/angiogenesis signaling axis that we validated in several in vitro and in vivo BCa models.

Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010) / Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. L’hypertrophie cardiaque est un processus de remodelage provoqué par une surcharge de travail du muscle cardiaque afin de mieux répondre à la demande de l’organisme. Bien que bénéfique à court terme, une hypertrophie trop accentuée conduira à long terme, à une insuffisance cardiaque. L’hypertrophie est associée à un remodelage électrique qui conduit généralement à un allongement du potentiel d’action, une des causes des arythmies ventriculaires et de la mort subite. Généralement, le mécanisme causal est la fibrillation ventriculaire, un trouble du rythme irréversible dont les mécanismes sont complexes et méconnus. Si les conséquences fonctionnelles in vitro des mutations génétiques ou du remodelage ionique sont relativement simples à étudier ou à prévoir, leur rôle dans les mécanismes des troubles du rythme in vivo sont plus difficiles à appréhender. Parmi les nombreux modèles animaux développés pour la recherche sur les troubles du rythme, la souris est de plus en plus utilisée en raison de notre capacité à muter, invalider ou sur-exprimer les gènes d'intérêt chez ces animaux. L'objectif de mon travail de thèse était de mieux comprendre le rôle des canaux ioniques en physiopathologie cardiaque, en particulier dans la survenue des troubles du rythme in vivo. Ces travaux ont permis d'améliorer notre connaissance du rôle des anomalies génétiques impliquant des canaux ioniques et du remodelage ionique dans la physiopathologie des troubles du rythme et pourrait ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement anti-remodelage cardiaque et la prévention de la mort subite. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world each year. If no action is taken to improve cardiovascular health and current trends continue, WHO estimates that 25% more healthy life years will be lost to cardiovascular disease globally by 2020. Cardiac hypertrophy is the consequence of an excessive workload of the heart muscle leading to cardiac remodeling process. As the workload increases, the ventricular walls grow thicker, lose elasticity and eventually may fail to pump with as much force as a healthy heart. Furthermore, hypertrophied myocardium is not physiologically normal and may confer a predisposition to potentially fatal arrhythmias. Generally, the causal mechanism is ventricular fibrillation, a cardiac rhythm disorder which is irreversible but the pathophysiological mechanisms are complex and poorly understood. The functional consequences of mutations or ionic remodeling are relatively simple to study in vitro, but their role in the pathophysiology of arrhythmias in vivo is more difficult to grasp. Among the different animal models developed in cardiac arrhythmias research, the mouse is increasingly used because of our ability to mutate, knock-out or over-express genes of interest. The objective of my thesis was to study the role of ion channels in physiology as well as cardiac pathophysiology, particularly in the involvement of the occurrence of cardiac arrhythmias in vivo. This thesis will improve our understanding of the role of genetic abnormalities involving ionic remodeling in the pathogenesis of the heart and may also open new therapeutic perspectives in the treatment of cardiac remodeling as well as sudden cardiac death.