Plasmodium falciparum est un parasite appartenant au phylum Apicomplexa et est à l’origine de la forme la plus sévère de la malaria. Dans les zones endémiques d'Afrique subsaharienne, la plupart des victimes sont des enfants de moins de cinq ans. L’entrée de P. falciparum dans sa cellule cible, le globule rouge, repose sur la sécrétion de protéines par des organites spécialisés : les micronèmes, les rhoptries et les granules denses. Les mécanismes de biogenèse de ces organites et la coordination de la libération de leur contenu lors de l'invasion sont cependant pour la plupart inconnus. Il a été toutefois été démontré que les protéines destinées à ces organites apicaux se concentrent dans des microdomaines de l’appareil de Golgi, dont la composition en lipides et en protéines détermine leur destination finale. À ce jour, les mécanismes de sélection et de transport des protéines apicales vers les organites d'invasion ainsi que leurs mécanismes de sécrétion durant l’invasion sont pour la plupart inconnus. Nous avons donc posé l’hypothèse que les phosphoinositides (PI) et leurs protéines effectrices sont impliqués dans ces processus chez P. falciparum. Les PI sont sept lipides phosphorylés retrouvés de façon minoritaire dans les différentes membranes cellulaires. Chaque membrane subcellulaire contient une espèce caractéristique de PI qui peut être reconnue et liée spécifiquement par des protéines effectrices. Une large gamme de processus biologiques sont régulés par les PI, tels le trafic vésiculaire, les canaux ioniques, les pompes d’efflux et les transporteurs, ainsi que certains processus endocytiques et exocytaires. Des études antérieures ont été en mesure de détecter seulement cinq des sept espèces de PI chez P. falciparum. Dans le cadre d’un premier projet, nous avons étudié la distribution de six PI, à savoir PI3P, PI4P, PI5P, PI (4,5)P2, PI(3,4)P2 et PI(3,4,5)P3, chez P. falciparum. Pour ce faire, nous avons exprimé chez le parasite des rapporteurs spécifiques correspondant à des domaines humains de liaison aux PI, fusionnés à une protéine fluorescente. Cette méthode nous a permis de confirmer des rapports antérieurs sur la localisation du PI3P dans la membrane de la vacuole alimentaire, dans de petites vésicules près ou sur la membrane plasmique du parasite ainsi qu’à l’apicoplaste. De plus, nous avons révélé pour la première fois la présence de PI5P chez P. falciparum et montré qu’il se localisait à la membrane plasmique, au noyau et potentiellement dans le réticulum endoplasmique de transition. Nous avons aussi montré que le PI4P est localisé dans la membrane plasmique ainsi que dans l’appareil de Golgi et que le PI(4,5)P2 est présent dans la membrane plasmique tout au long du cycle érythrocytaire. Cette carte de la distribution subcellulaire des PI constitue un excellent outil pour mieux déchiffrer les rôles de ces lipides chez le parasite P. falciparum. Dans le cadre d’un second projet, nous avons caractérisé une protéine possédant un domaine conservé chez les Apicomplexa, le domain d’homologie de la Pleckstrine, la protéine PfPH2. En utilisant la stratégie de Knock-sideways pour inactiver conditionnellement la protéine d’intérêt, nous avons montré que PfPH2 est impliquée dans l’attachement initial du mérozoite à la surface du globule rouge. Cet effet est directement lié à un défaut de sécrétion d'une population spécifique de micronèmes en l’absence de la protéine PfPH2. Enfin, nous avons mis en évidence que le domaine PH de PfPH2, lorsque exprimé sous forme de protéine recombinante, se lie aux PI avec une grande spécificité. Pris ensemble, nos résultats démontrent le rôle essentiel des PI dans le processus d’invasion et proposent un modèle mécanistique pour l'exocytose des micronèmes. / Plasmodium falciparum belongs to the phylum of Apicomplexa and causes the most severe form of malaria. In endemic areas of sub-Saharan Africa, most of the victims are among children under the age of five. P. falciparum relies on proteins released from sophisticated invasion organelles called micronemes, rhoptries and dense granules to enter human erythrocytes. The mechanism of biogenesis of invasion organelles and the coordinated release of their contents during invasion are mostly unknown. It has been shown that proteins targeted to the apical organelles accumulate in microdomains of the Golgi apparatus with specific lipid and protein composition that determine the final destination of their cargo. To date, the mechanisms of transport of the cargo molecules to the invasion organelles and their release mechanism are mostly unknown. We proposed that phosphoinositides (PIPs) and their effector proteins could be involved in these processes in P. falciparum. PIPs are seven minor phosphorylated lipids in cellular membranes. Each subcellular membrane contains a characteristic species of PIPs that are specifically bound by PIPinteracting proteins. A wide range of biological processes regulated by PIPs such as vesicular trafficking, ion channels, pumps, and transporters and control both endocytic and exocytic processes. Based on previous reports five out of seven PIP species have been detected in P. falciparum. In my first project, we have studied the distribution of six PIPs namely PI3P, PI4P, PI5P, PI(4,5)P2, PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3 using expression of specific reporters made up of human PIP-binding domains fused to a fluorescent protein. Here, we have confirmed previous reports on PI3P localization to the food vacuole membrane, small vesicles close/on the parasite plasma membrane and the apicoplast. Also, we have reported for the first time the presence of PI5P in P. falciparum and showed that it localizes to the PM, nucleus and potentially transitional ER. PI4P shows localization to the PM and Golgi and PI(4,5)P2 localizes to the PM all over the erythrocytic cycle. The resulting map of the subcellular distribution of PIPs will now be a great tool to further decipher the roles of these lipids in P. falciparum, In the second project, we have characterized a Pleckstrin Homology domain-containing protein (PfPH2) conserved in all apicomplexan parasites. Using the knock sideways strategy to conditionally inactivate the protein, we show that PfPH2 is involved in an early step of the invasion process, when the merozoites initially attach to red blood cells. We further demonstrate that this is due to the abrogated secretion of a specific population of micronemes. Finally, we reveal that recombinantly expressed PfPH2 binds PIPs with a broad specificity. Taken together, our results present evidence for the role of PI in invasion and propose a mechanistic model for the exocytosis of micronemes.

La malaria, endémique dans 91 pays tropicaux et sub-tropicaux, est l’une des maladies infectieuses les plus mortelles chez l’humain. Le fardeau de cette maladie porte principalement sur l’Afrique, qui compte plus de 90% des cas d’infections ainsi que des morts enregistrés, la majorité étant des enfants en bas âge. Des cinq espèces de parasites du genre Plasmodium qui peuvent causer la maladie chez l’humain, Plasmodium falciparum est de loin la plus mortelle et la plus étudiée. La résistance aux médicaments actuels et l’absence d’un vaccin préventif procurant une immunité de longue durée démontrent l’urgent besoin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Chez les cellules eucaryotes, l’identité des organites cellulaires est définie par les phosphoinositides, des composants mineurs des membranes cellulaires, et maintenue grâce aux kinases et aux phosphatases impliquées dans leur métabolisme. Les rôles de certaines phospholipides-kinases dans plusieurs étapes critiques du cycle de vie de Plasmodium ont récemment été découverts, toutefois, rien n’est connu quant aux fonctions des phosphoinositides phosphatases de cet organisme. Les travaux décrits ci-dessous présentent une première caractérisation d’une protéine homologue à la famille des phosphoinositides phosphatases SAC1. Les résultats montrent que cette protéine est exprimée durant tout le cycle érythrocytaire asexué et qu’elle se localise au réticulum endoplasmique ainsi que potentiellement à l’appareil de Golgi. L’étude de lignées conditionnelles et knockout suggèrent qu’un niveau minimal de la protéine est nécessaire pour la survie du parasite durant le cycle érythrocytaire. En somme, la combinaison des résultats obtenus laisse penser que cette protéine pourrait avoir une fonction dans le système de sécrétion du parasite P. falciparum et qu’elle pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante pour le développement de nouveaux antimalariaux. / Malaria is endemic in 91 tropical and sub-tropical countries and is one of the deadliest infectious human diseases. Africa has the highest burden with more than 90% of cases and malaria deaths registered yearly, mostly in children under 5 years-old. Despite the fact that infection in human can be caused by five Plamsodium species, infection by Plasmodium falciparum is the most severe and therefore the most studied. Resistance to antimalarials and the absence of a preventive vaccine show the urgent need of new therapeutic targets. In eukaryotic cells, organelles identity is defined by phosphoinositides, minor membranes components, and maintained by the kinases and phosphatases involved in their metabolism. The fact that certain kinases have roles in critical steps of Plasmodium life cycle has recently been acknowledged. However, the roles of the phosphatases are still unknown. My work presents a first characterization of a putative phosphoinositide phosphatase of the SAC1 family. Results provided show that the protein is expressed throughout the asexual blood stages and that it localizes to endoplasmic reticulum and potentially to the Golgi apparatus. Studies on knockdown and knockout strains suggest that a minimal amount of the protein is required during the asexual blood stages. In summary, the combination of the results presented suggests that the protein has an important function in the parasite P. falciparum secretion system and therefore, may represent an interesting potential target for drug development.

La malaria est un des fléaux les plus dévastateurs dans les pays en voie de développement. L’absence d’un vaccin et la résistance aux agents antimalariaux disponibles démontrent le besoin urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les phosphoinositides (PIP) sont des composants essentiels des membranes cellulaires chez les eucaryotes jouant un rôle important dans la signalisation intracellulaire, la synthèse d’ADN et le trafic protéique, par exemple. Malgré leur importance chez les eucaryotes, on en connaît peu sur leurs fonctions chez le parasite de la malaria Plasmodium falciparum. Dans notre laboratoire, nous avons réalisé un criblage par inactivation génique de 36 effecteurs potentiels de la voie métabolique PIP pour identifier les gènes qui sont essentiels à la prolifération chez P. falciparum. Notre étude a montré que 72% des gènes potentiellement impliqués dans la voie métabolique des PIP ne pouvaient être inactivés et sont donc potentiellement essentiels pour la survie du parasite. L’analyse d’une souche knock-out pour la protéine PfPX, ayant un domaine de liaison aux PIP de type Phox, a démontré un ralentissement sévère de la croissance du parasite. La caractérisation de la protéine PfPX a révélé qu’elle se localisait à la membrane de la vacuole digestive, le site où le parasite digère l'hémoglobine (Hb) de l'hôte afin de subvenir à ses besoins en acides aminés. Nous avons montré que les parasites dépourvus de la protéine Phox accumulaient plus d'Hb et que celle-ci était piégée dans des vésicules à proximité de la vacuole digestive, suggérant un rôle pour cette protéine dans la fusion des vésicules d’Hb avec la membrane de la vacuole digestive. Globalement, nos résultats ont révélé que les PIP ont un rôle important dans le transport de l'Hb chez P. falciparum / Malaria is one of the most devastating curses in developing countries. The absence of a vaccine and resistance to available antimalarial agents demonstrate the urgent need to identify new therapeutic targets. Phosphoinositides (PIPs) are essential components of cell membranes in eukaryotes, playing an important role in intracellular signaling, DNA synthesis and protein trafficking, for example. Despite their importance in eukaryotes, little is known about their functions in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In our laboratory, we screened 36 putative effectors of the PIP pathway by gene inactivation to identify the genes that are essential for proliferation in P. falciparum. Our studies showed that 72% of genes possibly involved in the PIP pathway could not be inactivated and are therefore potentially essential for parasite survival. Analysis of a knockout strain for PfPX protein, having a Phox-like PIP binding domain, demonstrated a severe slowdown in parasite growth. Characterization of the PfPX protein revealed that it was localized to the food vacuole membrane, the site where the parasite digests the hemoglobin (Hb) of the host in order to meet his needs in amino acids, and in vesicular type structures. We have shown that parasites lacking the Phox protein accumulate more Hb and that it is trapped in vesicles near the digestive vacuole, suggesting a role for this protein in the fusion of Hb vesicles with the membrane of the digestive vacuole. Overall, our results revealed that PIPs play an important role in the transport of P. falciparum Hb

La malaria est une maladie infectieuse causant plus de 500 000 morts chaque année. La maladie est causée par un protozoaire de la famille Plasmodium. L’apparition de souches résistantes aux traitements actuels et l’absence de vaccin efficace rendent la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques urgente. Le parasite possède un complexe apical, un groupement de vacuoles sécrétoires spécialisées contenant les protéines responsables de l’invasion du globule rouge. Nous nous intéressons aux mécanismes gouvernant le transport intracellulaire de ces protéines et à la biogenèse du complexe apical lors de la formation des nouveaux parasites. Plus particulièrement, nous nous intéressons au rôle des phosphoinositides dans le recrutement des protéines à la membrane de l’appareil de Golgi. Par analyse bio-informatique du génome de P. falciparum, nous avons identifié plusieurs protéines effectrices liant potentiellement les phosphoinositides. Les travaux présentés dans ce mémoire concernent Mal13P1.188, une protéine possédant un domaine Pleckstrin homology. Nous proposons que Mal13P1.188 ait un rôle dans la génération du complexe apical en recrutant les protéines le constituant à la membrane du Golgi par la liaison avec les phosphoinositides. Afin de vérifier nos hypothèses, nous avons généré une lignée de parasite dont le gène de Mal13P1.188 est fusionné avec une GFP et une hémagglutinine. À l’aide de cette lignée de parasite, nous avons pu identifier Mal13P1.188 à proximité de l’appareil de Golgi lorsque les parasites étaient sous la forme schizont du cycle érythrocytaire. D’autres expériences ont permis de confirmer que le domaine Pleckstrin homology de Mal13P1.188 était capable de reconnaître les différentes formes de phosphoinositides. Finalement, d’autres travaux devront être faits sur Mal13P1.188 afin de déterminer si elle est essentielle à la survie du parasite. / Malaria is a deadly infectious disease taking more than 500,000 lives each year. The disease is caused by a protozoan of the Plasmodium family. Resistant strains beginning to spread and the inexistence of an efficient vaccine make the discovery of new targets urgent. The parasite secretes proteins to invade the red blood cell. Those proteins are regrouped in the apical complex, a group of organelles used for the invasion. Our research team focus on the transport mechanisms that drive the formation of the apical complex during the cellular division of new parasite. In other terms, we are interested on the role of phosphoinositide in the recruitment of protein inside the Golgi apparatus. After a bioinformatics analyse the P. falciparum genome, we identified many effectors protein that can bind phosphoinositides. Among them, we focused our work on Mal13P1.188, a protein with a Pleckstrin homology domain. We propose that Mal13P1.188 has a role in the recruitment of the apical proteins to the Golgi membrane using phosphoinositide as a marker on the membrane. To verify that hypothesis, we generated a strain of parasite with endogenous Mal13P1.188 tagged to a GFP and a hemagglutinin. With those parasites, we identified Mal13P1.188 near the Golgi apparatus during the Schizont stage of the blood cycle. Other experiment confirmed that the Pleckstrin homology domain of Mal13P1.188 is able to bind different form of phosphoinositides. Finally, more work has to be done to confirm if Mal13P1.188 is essential to the parasite survival.

RAS est une petite protéine Rho-GTPase à la tête d'un réseau de signalisation prolifératif important. Les sentiers activés par RAS incluent les Mitogen-Activated proteins Kinases (MAPK) et la voie Phosphoinositide-3-kinase (PI3K) /Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Bien que de nombreuses évidences soutiennent une forte implication de RAS dans la carcinogenèse, les mécanismes moléculaires précis liant RAS et prolifération cellulaire ne sont pas tous élucidés. En utilisant des données publiques de phosphoprotéomique, notre équipe a identifié Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) comme une nouvelle cible de RAS essentielle à la croissance et à la prolifération. ZNF768 est un facteur de transcription qui est déstabilisé au niveau post-traductionnel par les voies MAPK et mTOR/AKT. La déplétion aigue de ZNF768 induit prématurément une entrée en sénescence, un état caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, et souvent mis en place en réponse au stress. Nos études montrent que ZNF768 est dégradée durant ce phénomène ainsi que durant la sénescence réplicative. De plus, la surexpression de ZNF768 réduit l'entrée en sénescence, via un mécanisme majoritairement dépendant du facteur de transcription p53, qui joue un rôle important dans la sénescence. ZNF768 affecte négativement la phosphorylation de certains résidus clés pour l'activation de p53 et inhibe son activité transcriptionnelle. Nous avons par ailleurs démontré une interaction physique entre ces deux protéines. L'ensemble de ces résultats suggère que les voies MAPK et mTOR, toutes deux activées par RAS, déstabilisent ZNF768 afin de renforcer la sénescence prématurée. De manière intéressante, les niveaux de ZNF768 sont élevés dans certaines tumeurs humaines. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel ZNF768 puisse favoriser la carcinogenèse en réduisant la sénescence et en favorisant la prolifération. / RAS is a small Rho-GTPase protein that integrates growth factors signaling and activates several proliferating pathways including Mitogen-Activated Proteins Kinases (MAPK) and Phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR). Although many evidence indicate that RAS is involve in carcinogenesis, the molecular mechanisms that link RAS to cellular proliferation are not well understood. By using phosphoproteomics data, our team identified Zinc Finger Protein 768 (ZNF768) as a new target of RAS signaling essential to growth and proliferation. ZNF768 is a transcription factor destabilized at the post-translational level by MAPK and mTOR/AKT. The acute depletion of ZNF768 induces senescence, a stable arrest of the cell cycle triggered by cellular stress. Our results show that ZNF768 is depleted during replicative and premature senescence. In addition, overexpression of ZNF768 bypasses senescence by a mechanism that is mainly dependent on the activity of p53, a transcription factor involved in senescence. Interestingly, ZNF768 interacts with p53 and inhibits its transcriptional activity by modulating its phosphorylation. Thus, MAPK and mTOR/AKT pathways destabilise ZNF768 to reinforce senescence. Moreover, ZNF768 levels are high in various human tumors. Altogether, these results suggest that ZNF768 promotes carcinogenesis by blocking senescence and by stimulating proliferation.

La liaison de l’insuline à son récepteur permet le recrutement de protéines adaptatrices, ce qui conduit notamment à l’activation de la voie mitogénique des MAPK et des voies impliquées dans le métabolisme du glucose. Deux voies complémentaires contribuent au recrutement du transporteur de glucose, GLUT4, à la membrane ;la voie de la PI3-kinase qui implique la formation du messager secondaire PtdIns(3,4,5)P3 conduisant à l’activation de la PKB et la voie de la petite protéine G, TC10, qui implique les protéines APS, CAP et c-Cbl. <p><p>La phosphatidylinositol 5-phosphatase 2 (SHIP2) contrôle négativement la voie des MAPK par interaction avec des acteurs de la cascade et la voie de la PI3-kinase en hydrolysant le PtIns(3,4,5)P3 en PtIns(3,4)P2. De plus, il a été montré dans notre laboratoire que SHIP2 peut interagir directement avec la protéine CAP ainsi que co-immunoprécipiter avec le récepteur de l’insuline et c-Cbl, participant ainsi à un complexe multiprotéique formé des protéines CAP et c-Cbl et du récepteur. Au cours de ce travail, nous avons tenté de mieux comprendre l’implication moléculaire de SHIP2 dans la cascade TC10. Comme APS est la première protéine de la cascade à être recrutée au récepteur suite à une stimulation par l’insuline et qu’elle peut interagir directement avec le récepteur et les protéines CAP et c-Cbl, nous avons étudié dans un premier temps le lien potentiel entre APS et SHIP2.<p><p>Nous avons montré que SHIP2 interagit de manière directe avec la protéine adaptatrice APS tant dans un système de sur-expression (CHO-IR) que dans un système endogène (3T3-L1). Bien qu’une stimulation par l’insuline ne semble pas modifier cette interaction, elle induit néanmoins le recrutement d’une fraction des protéines APS et SHIP2 du cytoplasme vers la membrane plasmique. L’étude des domaines d’interaction a montré que la région centrale de SHIP2 qui comprend le domaine catalytique est nécessaire pour cette association. <p><p>Nous avons ensuite montré que cette association entre APS et SHIP2 peut moduler certaines de leurs propriétés biochimiques. D’une part, bien que la sur-expression de SHIP2 n’influence pas le recrutement d’APS au récepteur, SHIP2 diminue, indépendamment de son activité enzymatique, la phosphorylation sur tyrosine d’APS induite par l’insuline et l’interaction entre APS et c-Cbl, qui sont deux étapes cruciales dans la cascade TC10. Ainsi, SHIP2 pourrait non seulement influencer la cascade de l’insuline par son activité enzymatique, mais également par interaction avec des acteurs de la cascade. D’autre part, APS augmente l’activité 5-phosphatase de SHIP2 dans un test in vitro. Elle pourrait ainsi, outre son rôle positif dans la cascade, participer au rétrocontrôle négatif de la voie de signalisation à l’insuline. Finalement, nous avons déterminé comment ces deux protéines influencent les cascades de l’insuline. Alors qu’APS n’influence pas l’activation de la PKB, ni le taux de PtdIns(3,4,5)P3, la sur-expression d’APS et de SHIP2 induit une inhibition plus forte de l’activation de la PKB comparée à celle provoquée par SHIP2 seul. De plus, une sur-expression de SHIP2 abolit l’augmentation induite par APS de la phosphorylation des MAPK. Cette activation des MAPK par APS semble dépendre de sa liaison au récepteur car les domaines PH et essentiellement SH2 sont indispensables pour cet effet positif.<p><p>En conclusion, nous avons mis en évidence l’existence d’une association entre APS et SHIP2. Cette interaction modifie certaines de leurs propriétés biochimiques et fournit un nouveau mécanisme d’action pour ces protéines dans le contrôle négatif de la voie de signalisation à l’insuline. <p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les phosphoinositides sont des phospholipides constituant des membranes cellulaires eucaryotes qui participent entre autres à la transmission de certains signaux extracellulaires dans le milieu intracellulaire. Désormais, un contrôle rigoureux et constant de leur métablisme par des enzymes est primordial pour assurer le bon fonctionnement de l'activité cellulaire. La 5-phosphatase SHIP2 est une enzyme capable d'hydrolyser certains de ces phosphoinositides dont le PtdIns(3,4,5)P3. Ce dernier, produit majoritaire d'une famille d'enzymes dénommées les PI(3)K, gouverne un large éventail de fonctions cellulaires dont la prolifération et le métabolisme énergétique. Deux souris knock-out pour SHIP2 ont été rapportées. La première présente une invalidation conjointe, accidentelle, des gènes INPPL1 et PHOX2A ;à l'état homozygote elle conduit à une létalité précoce. L'hétérozygote est viable et hypersensible à l'insuline. La seconde, caractérisée par l'invalidation unique d'INPPL1, est viable à l'état homozygote. D'un point vue phénotypique, cette souris ne montre pas d'altération majeure du métabolisme du glucose sous un régime conventionnel, mais un retard de croissance et une anomalie de la face. Elle est aussi protégée de l'obésité et de l'insulinorésistance induite par un régime riche en graisse.<p>Pour lever la controverse quant au rôle de SHIP2 in vivo chez la souris, le laboratoire hôte a généré un nouveau modèle, la souris SHIP2Δ/Δ, génétiquement modifiée pour exprimer une protéine SHIP2 tronquée dépourvue d'activité catalytique. L'analyse phénotypique de cette souris SHIP2Δ/Δ a permis de confirmer le retard de croissance et l'anomalie craniofaciale observés précédemment. Elle a aussi mis en évidence une réduction de la masse musculaire, de la masse adipeuse et une atrophie du tractus génital femelle. Le métabolisme du glucose et la sensibilité à l'insuline de la souris SHIP2Δ/Δ ne sont que peu affectés. Nous avons ensuite évalué la capacité du mutant SHIP2Δ à corriger l'insulinorésistance consécutive à une réduction de moitié de l'activité PI(3)K de classe IA in vivo chez la souris. L'expression du mutant SHIP2Δ sur ce fond génétique permet de rétablir un métabolisme glucidique normal mais cette récupération ne semble cependant pas s'opérer par la restauration de la phosphorylation de la PKB/Akt. D'autre part, les anomalies du développement de la souris SHIP2Δ/Δ sont maintenues sur ce fond génétique et accompagnées d'une hypertrophie cardiaque. Désormais, les effets de l'inactivation de SHIP2 in vivo chez la souris ne semblent pas être la seule conséquence d'une hyperactivation de la voie PI(3)K de classe IA suite à la perte d'une voie de dégradation du PtdIns(3,4,5)P3. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le métabolisme des phosphoinositides est constitué d’un réseau complexe d’enzymes et de seconds messagers phospholipidiques et solubles cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), second messager très important dans la cellule est contrôlé par plusieurs phosphatases. La phosphatase PTEN, fréquemment mutée dans de nombreux cancers humains (glioblastome, cancer de la prostate, cancer du sein, …), le déphosphoryle en position 3 pour donner du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Les cellules de mammifères possèdent également une activité « inositol 5-phosphatase » pour de nombreux dérivés du myo-inositol. C’est la protéine SHIP2 (SH2-containing Inositol 5-phosphatase 2), une lipide phosphatase membre de la famille des phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatases qui est, entre autres, responsable de cette activité. <p>Le but de ce travail de thèse a été de mettre en évidence un rôle potentiel de SHIP2 et/ou PTEN dans un modèle murin de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ;ce modèle exprime une forme constitutivement active du récepteur tyrosine kinase Kit muté sur l’acide aminé 641. Les souris qui ont été générées par le groupe du Dr Brian Rubin (Lerner Research Institute and Taussig Cancer Center, Cleveland) sont dénommées, les souris KitK641E.<p>La caractérisation des souris KitK641E nous a permis de montrer que SHIP2 et PTEN étaient exprimés dans les cellules Kit positives, les cellules de Cajal et qu’ils semblaient régulés de façons différentes.<p>En effet, nous avons pu mettre en évidence une augmentation de l’expression de PTEN dans l’antre gastrique des souris KitK641E homozygotes. Cette augmentation d’expression a également été observée dans l’antre gastrique de souris double transgéniques KitK641E x PTEN+/- alors que l’expression de PTEN dans le foie, un tissu n’exprimant pas de cellules Kit positives, était bien diminuée. Des expériences de PCR quantitative ont également permis de montrer que cette augmentation d’expression de PTEN ne provenait pas d’une augmentation du taux d’ARNm mais qu’elle se situait plutôt au niveau post-traductionnel. Ces données nous permettent de conclure que l’augmentation d’expression de PTEN dans les cellules Kit positives des souris KitK641E homozygotes est influencée par l’activation constitutive du récepteur Kit. <p>A l’inverse, l’expression de SHIP2 dans les cellules Kit positives n’a pu être mise en évidence qu’après activation constitutive du récepteur Kit. En parallèle, l’étude des voies de signalisation dépendantes du récepteur Kit nous ont permis de montrer que la phosphorylation de PKB ne semblait pas être affectée et que ce serait plutôt la voie des MAPK kinases qui interviendrait dans ce modèle. <p>Nous avons également observé la localisation subcellulaire de SHIP2 et de PTEN en utilisant un modèle cellulaire de cellules GIST882 (cellules dérivées d’un GIST humain portant la mutation correspondante à notre modèle murin). Dans ce modèle, PTEN est principalement localisé dans le noyau alors que SHIP2 est localisé à la fois au sein du noyau et du cytoplasme. Ce modèle nous a également permis de montrer que la forme phosphorylée sur tyrosine de SHIP2 (Y1135) était localisée dans le noyau et qu’elle était modulée en fonction du cycle cellulaire.<p>En conclusion, ces travaux ont permis de montrer que dans le modèle de souris KitK641E, SHIP2 et PTEN étaient localisés au sein des cellules Kit positives et qu’ils étaient modulés par des mécanismes différents. L’augmentation d’expression de PTEN observée dans les souris KitK641E homozygotes pourrait constituer un mécanisme de rétrocontrôle négatif afin de modifier l’impact de voies de signalisation en aval du récepteur Kit dans ce modèle oncogénique.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases, SHIP2, has been established as a regulator of the insulin cascade, of cell adhesion and spreading, actin structures, remodelling and cytoskeletal organization. However, the molecular mechanisms underlying these processes still needed additional investigations. Among different regulatory mechanisms, protein-protein interaction play an essential role. To better understand the molecular mechanism of SHIP2 in signalling pathway as well as to reveal novel roles of SHIP2, a two-hybrid was performed to search for SHIP2 protein interactors. JNK-interacting protein 1 (JIP1) and intersectin 1 (ITSN1) were two of the newly identified protein partners of SHIP2. In this thesis, we characterized the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 in different aspects as identifying the interacting domain involved, biochemical function regulations and cellular biological roles.<p><p>The JIP scaffold family of proteins associate with MAPK, MAPKK and MAPKKK creating functional signaling modules to control the specificity of signal transduction. JIP1 is characterized as a scaffold protein assembling JNK, MAPK kinase 7 (MKK7), mixed lineage kinase (MLK), dual leucine zipper-bearing kinase (DLK). It thus enhances the selectivity and effectiveness of kinase activation during JNK signaling. In this thesis, the SHIP2-JIP1 interaction has been confirmed both in overexpression system in COS-7 and CHO-IR cells, and in native cells of COS-7. Both the proline-rich (PR) domain (residues 359-487) and PTB domain of JIP1 participated in this interaction. Overexpression of SHIP2 in COS-7 cells up-regulated JIP1-mediated JNK activation and the tyrosine phosphorylations of both JIP1 and MLK3. These effects were independent of SHIP2 catalytic activity. By the use of kinase inhibitors, we showed that Abl and Src family tyrosine kinases might be implicated in the regulation of JIP1 tyrosine phosphorylation. The residue Y270 of JIP1, a potential target of Abl tyrosine kinase, was shown to be involved in SHIP2-increased JIP1 tyrosine phosphorylation. In an in vitro assay, JIP1 negatively regulated the catalytic activity of SHIP2. In addition, upon the stimulation of okadaic acid, the overexpression of SHIP2 caused less viability of COS-7 cells. These data provide a new molecular link between SHIP2 and JIP1-mediated JNK pathway, and may help explain the biochemical mechanisms of SHIP2 in cellular apoptosis, as well as in insulin pathway.<p> <p>Another protein partner, ITSN1, is a multi-domain protein which plays a role in endocytosis, MAPK signalling and actin cytoskeleton. The interaction between SHIP2 and ITSN1 was confirmed in overexpression systems in COS-7 cells, as well as at the physiological concentration with the endogenously expressed proteins in C2C12 and COS-7 cells. EGF stimulation did not modulate the association of SHIP2 and ITSN1. ITSN1-SH3D, A, C and E domains interacted with the C-terminal part of SHIP2 with the binding affinity as SH3D>SH3A>SH3C>SH3E. Upon the stimulation of EGF, the expression of SHIP2 may recruit ITSN1 short form (ITSN1-S) to cell membrane. The ITSN-mediated ERK1/2 and JNK activations in response to EGF were not modulated when SHIP2 or catalytic mutant of SHIP2 or TSHIP2 was overexpressed. The link between SHIP2 and ITSN may provide one of the molecular mechanisms used by SHIP2 to participate in receptor endocytosis regulation.<p><p>In conclusion, our data of the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 provide evidence for potential novel biochemical mechanisms of SHIP2 to be implicated in JNK pathway as well as EGF receptor endocytosis. JIP1 and ITSN1, which are both implicated in the JNK pathway, may also have a link through the common protein partner SHIP2, giving rise to potential interesting study goal. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’Ins(1,3,4,5)P4 produit par l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase de type B (Itpkb) est nécessaire au développement des thymocytes et lymphocytes T murins. Trois hypothèses sont admises quant à la fonction physiologique et au mécanisme d’action de cet inositol phosphorylé :la première postule que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la réponse calcique intracellulaire ;la seconde, que cet inositolphosphate est un intermédiaire métabolique dans la synthèse d’inositols plus hautement phosphorylés ;la dernière, que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la localisation subcellulaire et la fonction de protéines capables de la reconnaître par des domaines spécifiques de liaison. Afin d’investiguer cette dernière hypothèse, nous avons analysé la physiologie des lymphocytes B invalidés pour Itpkb et avons généré et analysé des souris transgéniques d’addition pour Rasa3, récepteur potentiel à l’Ins(1,3,4,5)P4.<p>Les lymphocytes B déficients en Itpkb présentent un défaut de survie car ils ne peuvent activer correctement les protéines kinases Erk1/2 suite à la stimulation du BCR de surface. Cela conduit à la surexpression anormale de la protéine pro-apoptotique Bim. La diminution de l’expression de Bim est suffisante dans ce modèle pour restaurer une fonction normale des lymphocytes B. In vitro, Nous avons montré que l’Ins(1,3,4,5)P4 est nécessaire à la translocation de Rasa3, protéine favorisant l’inactivation de la voie de Ras, de la membrane vers le cytoplasme. L’étude de lymphocytes invalidés pour Itpkb dans un modèle de BCR transgénique semble montrer que des anomalies de réponse calcique ne participent pas au phénotype.<p>En conclusion, nos résultats indiquent qu’une des voies de signalisation préférentielle de l’Ins(1,3,4,5)P4 passe par la modulation de la localisation subcellulaire de protéines possédant un domaine d’affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 telle que Rasa3.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished