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Assessing anaerobic activity in perennial subzero hypersaline spring of the high Arctic: focus on methanogenesis, anaerobic oxidation of methane and sulphur reductionLamarche-Gagnon, Guillaume January 2014 (has links)
The Lost Hammer (LH) spring in the Canadian high Arctic perennially discharges subzero (-5°C) hypersaline (24% salt) brines through thick layers of permafrost (> 500 m), and so far accounts for the only described terrestrial methane seep in frozen settings on Earth. The present thesis aimed to ascertain that actively metabolising, indigenous, microbial communities do populate the sediments of the LH spring outlet despite the extreme conditions in situ. Incubation experiments with LH sediments could not confirm that microbial consortia undergo anaerobic methane metabolism but revealed that the reduction of sulphur compounds (SR) with hydrogen, most likely hydrogenotrophic sulphate reduction, was potentially carried out by some cryophilic populations under combined hypersaline and subzero (down to -20°C) conditions. Unusual H2S releases from LH sediments were also detected at high temperatures (80°C); the biogenicity of these releases could however not be confirmed and could alternatively reflect abiotic processes. Pyrosequencing analyses of both 16S rRNA (i.e. cDNA) and 16S rRNA genes (i.e. DNA) on 30 cm layers of LH sediments retrieved in April 2012 and July 2012 indicated fairly stable bacterial and archaeal communities at the phylum level, but a greater bacterial diversity at the species level (> 97% sequence similarities). The composition of the LH communities however differed significantly from previous surveys of the site, either reflecting site's heterogeneity and/or differences in sequencing coverage. Potentially active bacterial and archaeal communities were respectively dominated by clades related to the T78 Chloroflexi group and Halobacteria species, as indicated by 16S rRNA results; no sequence related to ANME-1 archaea were detected unlike in previous investigations of the site. The present study indicated that SR, hydrogenotrophy (possibly coupled to autotrophy), and hydrocarbon degradation (other than methane), most likely account for important metabolic processes carried out by LH microbial communities. Overall, the obtained findings provided additional evidence that the LH system host active communities of anaerobic, halophilic, and cryophilic microorganisms despite the extreme conditions in situ. / La source d'eau Lost Hammer (LH), située dans l'extrême arctique canadien, déverse des eaux hypersalines (salinité de 24 %) et froides, ayant une température constante avoisinant les 5°C, à travers d'épaisses couches de pergélisol (> 500 m). LH est considérée comme le seul suintement terrestre de méthane documenté à ce jour se situant en milieu continuellement gelé sur Terre. Cette thèse visait à déterminer si les communautés microbiennes indigènes aux sédiments de la source LH sont métaboliquement actives in situ, malgré les conditions extrêmes de la source. Des expériences d'incubations de sédiments de LH n'ont pu confirmer que les consortia microbiens métabolisent du méthane de façon anaérobique, mais ont révélé que des populations cryophiles sont probablement capables de réduire des composés de soufre, probablement la réduction de sulfate, sous des conditions hypersalines et jusqu'à 20°C. Des échappements de H2S des sédiments ont aussi été détectés à haute température (80°C); l'authenticité biologique de ces échappements nécessite d'être confirmée et pourrait alternativement refléter des processus chimiques abiotiques. Des analyses de pyroséquençage du 16S ARNr (ADNc) et du gène du 16S ARNr (ADN) sur des couches de 30 cm de sédiments collectés en avril 2012 et juillet 2012 ont indiqué que les communautés d'archées et de bactéries de LH sont assez stables au niveau du phylum, mais que la diversité entre les communautés de bactéries est plus variable au niveau de l'espèce (similarité des séquences > 97 %). La composition des communautés de LH différait par contre significativement de celle décrite lors d'études antérieures du site, reflétant possiblement une hétérogénéité du site, ou des différences de couverture de séquençage. Les résultats de pyroséquençage du 16S ARNr ont indiqué que les communautés de LH de bactéries et d'archées potentiellement actives étaient dominées respectivement par des clades reliés au groupe T78 des Chloroflexi et à des espèces de Halobacteria; aucune séquence reliée aux archées ANME-1 ne fut détectée contrairement à ce qui fut observé lors d'investigations précédentes du site. La présente recherche a indiqué que la réduction de composés de soufre, l'hydrogénotrophie (possiblement couplée à l'autotrophie), et la dégradation d'hydrocarbures (autres que le méthane) sont probablement d'importants processus métaboliques chez les communautés microbiennes de LH. Dans l'ensemble, les résultats obtenus ont fourni des évidences additionnelles que la source LH abrite des microorganismes anaérobiques, halophiles, et cryophiles actifs, malgré les conditions in situ extrêmes.
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Angiopoietin-1 signaling in endothelial cells: role of microRNAs (miRNAs)Golyardi, Flora January 2014 (has links)
MiRNAs are relatively small (21-23 nucleotide), single-stranded, evolutionarily conserved, non coding RNA molecules that usually inhibit mRNA expression or protein translation and thereby regulate gene expression. Angiopoientin-1 (Ang-1), along with its receptors Tie-1 and Tie-2, play a major role in Angiogenesis, the sprouting of new blood vessels. We first exposed endothelial cells (ECs) to Ang-1 for 12, 24, and 48h and assessed the expression of human miRNAs using Affymatrix arrays. Our results revealed that Ang-1 exposure elicits significant changes in miRNA expression with numerous miRNA being downregulated and only few miRNAs which were upregulated. One miRNA (miR-146b-5p) was significantly upregulated in ECs exposed to 12, 24, and 48h of Ang-1. This miRNA is a well-known regulator of innate immune responses and has been described to significantly inhibit the expression of IRAK1 and TRAF6 proteins which are involved in Toll-like 4 receptor signaling. Ang-1 exposure for 12hr triggered significant rise in the expression of 9 miRNAs while exposure to Ang-1 for 24 and 48h elicited a significant increased in the expression of 8 and 15 miRNAs, respectively. Exposure to Ang-1 also triggered significant inhibition of the expression of 14, 6, and 7 miRNAs after 12, 24 and 48h of exposure, respectively. The majority of these miRNAs have not been well characterized in terms of specific molecular targets or biological responses. In our subsequent experiments, we focused our attention on the biological roles of 8 miRNAs whose expression is downregulated by Ang-1. Our hypothesis was that these miRNAs exert a strong inhibitory influence on angiogenic processes and that their downregulation is essential for the pro-angiogenic effect of Ang-1 to be expressed. We used cell counting, caspase 3/7 activity assays, scratch healing assays, Matrigel® in vitro tube formation assays and cell cycle measurements to characterize the influence of several miRNAs on cell survival, apoptosis, migration, differentiation, and cell cycle regulation. Our results revealed that miR-1468, miR-1287, and miR-1233 significantly inhibit the pro-survival influence of Ang-1 on ECs, whereas miR-103, miR-330-5p, miR-557, miR-575 and miR-668 had no significant effects. In addition, these three miRNAs significantly attenuate EC migration, EC differentiation and impaired cell cycle progression. We conclude that several anti-angiogenic miRNAs are strongly downregulated in ECs exposed to Ang-1 and that this response is designed to promote the pro-angiogenic effects of Ang-1. / Les microARN (ou miARN) sont de courtes (21 à 23 nucléotides) molécules d'acide ribonucléique (ARN) à simple-brin, non codantes et évolutionairement conservées. Ces molécules servent à réguler l'expression génétique en inhibant l'expression d'ARN messagers ou la traduction de protéines. Nous avons d'abord exposé des cellules endothéliales (CE) à Angiopoeitin-1 (Ang-1) pendant 12, 24 et 48 heures pour ensuite évaluer l'expression des miARN humains avec des essais Affymatrix. Nos résultats révèlent que l'exposition à Ang-1 élicite des changements d'expression significatifs, puisque plusieurs miARN ont été diminués tandis que seulement quelques-uns ont été augmentés. L'expression de la molécule miR-146b-5p a été significativement accrue dans les CE exposées à Ang-1 pour 12, 24 et 48 heures. Ce miARN est un régulateur bien connu du système immunitaire et a été établi d'entraver l'expression des protéines IRAK1 et TRAF6 qui participent dans la signalisation du récepteur Toll-like 4 (TLR4). Le traitement avec Ang-1 de 12 heures a provoqué une augmentation signification de l'expression de 9 miARN, tandis que les traitements de 24 et 48 heures ont entrainé une hausse de l'expression de 8 et 15 miARN, respectivement. L'exposition à Ang-1 a aussi réduit l'expression de 14, 6 et 7 miARN suivant des traitements de 12, 24 et 48 heures, respectivement. La majorité de ces miARN n'ont pas encore été bien caractérisés en termes de cible moléculaires spécifiques ou de processus biologiques. Dans nos manipulations subséquentes, nous avons tourné notre attention vers les rôles biologiques de 8 espèces de miARN qui ont vu leur expression diminuée par Ang-1. Notre hypothèse était que ces miARN exercent une puissante influence inhibitoire sur les processus angiogéniques et que leur répression serait essentielle pour les effets pro-angiogéniques d'Ang-1. Nous avons compté les cellules, utilisé des essais d'activité Caspase 3/7, des tests de cicatrisation de plaie et de différenciation Matrigel, ainsi qu'effectué des mesures du cycle cellulaire pour déterminer l'influence de plusieurs miARN sur la survie des cellules, l'apoptose, la migration, la différenciation et la régulation du cycle cellulaire. Nos résultats démontrent que miR-1468 miR-1287 et miR-1233 inhibent significativement l'effet d'Ang-1 de promouvoir la survie des CE. De plus, ces 3 miARN ont significativement atténué la migration, la différenciation et la progression du cycle cellulaire des CE. Nous concluons que plusieurs miARN anti-angiogéniques sont réduits dans les CE exposés à Ang-1 et que cette réponse est conçue pour promouvoir les effets pro-angiogéniques de Ang-1.
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Structural and functional characterization of polysaccharide co-polymerasesKalynych, Sergei January 2014 (has links)
Polysaccharide Co-Polymerases (PCPs) comprise a large superfamily of proteins and are found in both Gram-negative and Gram-positive species. Members of this protein superfamily are involved in the export of a diverse set of glycans found on the bacterial surfaces and can be recognized by a characteristic topology where a large periplasm-exposed domain is anchored to the inner membrane by two transmembrane helices. Many PCP family members modulate the complex glycan biogenesis by imposing a given number of the repeat units on the growing polysaсcharide chain and as such are often referred to as the chain-length regulator proteins. The molecular mechanism of how the chain-length regulation is accomplished by the PCP proteins has been intensely studied but still remains elusive. All PCP proteins studied to date are known to assemble into the homo-oligomeric complexes; however, the exact subunit composition of the chain-length regulator PCPs has been a subject of controversy. PCP proteins do not possess a well-defined catalytic active center nor do they contain a clear carbohydrate-binding pocket. I used a previously determined crystal structure of one of the family members to design a number of chimeric and mutant proteins and assessed their behaviour in vivo. This allowed me to map out functionally important regions, most of which were found on the surface of the oligomeric assemblies formed by these proteins. I crystallized several periplasmic domains of the mutant and chimeric proteins produced above as well as the wild-type periplasmic domain from another bacterium. This work further expanded the repertoire of high-resolution crystal structures available for this particular bacterial protein family. I also established that both chimeric and mutant proteins from various organisms exhibit a remarkably similar main chain conformation. I also showed that large periplasmic domains have the capacity to assemble in the oligomers of varying composition ranging from trimers to nonamers.To establish the native oligomerization state of select polysaсcharide-co-polymerases, I optimized the expression and purification conditions to obtain milligram quantities of the full-length membrane proteins suitable for structural studies. I analyzed one family member (wzzB) by electron microscopy using the single-particle analysis of the negatively-stained samples. I found the conditions, which lead to diffracting crystals for another full-length family member (wzzE), optimized them, and was able to solve the crystal-structure using the periplasmic domain as a search model to 6.0 Å resolution. Both family members were found to form octamers in the detergent solubilized form. / Polysaccharide Co- polymérases (PCP) constituent une grande superfamille de protéines et se retrouvent dans les deux espèces à Gram positif et Gram négatif. Les membres de cette superfamille de protéines sont impliquées dans l'exportation d'un ensemble diversifié de glycanes trouvés sur les surfaces bactériennes et peuvent être reconnus par une topologie caractéristique où un grand domaine périplasme - exposée est ancrée à la membrane interne par les deux hélices transmembranaires. Beaucoup de membres de la famille de PCP moduler la biogenèse des glycanes complexes en imposant un nombre donné d' unités de répétition de la chaîne de polysaсcharide croissante et en tant que tel sont souvent désignés comme les protéines régulatrices de longueur de chaîne. Le mécanisme moléculaire de la façon dont la réglementation longueur de chaîne est réalisée par des protéines PCP a été intensément étudiée, mais jusqu'à ce jour reste insaisissable. Toutes les protéines PCP étudiés à ce jour sont connus pour monter dans les complexes homo- oligomères, mais la composition subunit exacte des médecins généralistes du régulateur de longueur de chaîne a été douteuse .Protéines PCP ne possèdent pas un centre actif catalytique bien défini ne contiennent jamais d'une poche de liaison de glucide clair. J'ai utilisé une structure cristalline déterminée auparavant de l'un des membres de la famille de concevoir un certain nombre de protéines chimériques et mutantes et évalué leur comportement in vivo. Cela m'a permis a identifier les régions fonctionnellement importantes, dont la plupart ont été trouvées sur la surface des ensembles oligomères formés par ces protéines.Je cristallisé plusieurs domaines périplasmiques des protéines mutantes et chimérique produits ci-dessus ainsi que le domaine périplasmique de type sauvage d'une autre bactérie. Ce travail a élargi le répertoire de structures cristallines haute résolution disponibles pour cette famille de protéines bactériennes particulier. J'ai aussi établi que les deux chimérique et les protéines mutantes de divers organismes présentent une conformation de la chaîne principale remarquablement similaires. J'ai aussi montré que les grands domaines périplasmiques ont la capacité de se rassembler dans les oligomères de composition allant de trimères à nonamères variable.Dans l'ordre, pour établir le véritable état d'oligomérisation de polysaсcharide -CO- polymérases certains, j'ai optimisé l'expression et les conditions de purification produisant milligrammes de protéines membranaires pleine longueur appropriées pour des études structurales . J'ai analysé un membre de la famille ( wzzB ) par microscopie électronique en utilisant l'analyse des échantillons négativement tachés à une particule . J'ai trouvé les conditions qui produisent les cristaux pour un autre membre de la famille sur toute la longueur (WzzE ), les a optimisés , et a été en mesure de résoudre la structure cristalline en utilisant le domaine périplasmique comme un modèle de recherche à la résolution 6.0A . Les deux membres de la famille ont été trouvés pour former octamères sous forme solubilisée de détergent
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TRBP as a target for HIV-1 mediated suppression of RNA interferenceDaniels, Sylvanne January 2014 (has links)
Trans-Activation Response (TAR)-Binding Protein (TRBP) is a multifunctional protein, with roles in cell processes ranging from stress response and antiviral defence to oncogenesis and RNA interference (RNAi). The post-transcriptional regulation of gene expression through RNAi dictates most cellular functions. In non-mammalian cells, RNAi is recognized as a crucial antiviral defence mechanism. In mammalian cells, where sophisticated innate and adaptive immune systems cope well with incoming viruses, the role of RNAi in mammalian antiviral defence has been debated. In the context of Human Immunodeficiency Virus (HIV), the viral elements Tat and TAR have been suggested to act as RNA Silencing Suppressors (RSSs), but there is conflicting data and RNAi-based anti-HIV therapies have proven successful in multiple studies.This work explores the role of TRBP in the context of RNAi and HIV-1 replication. We characterized the binding between TRBP and Dicer, another key protein of the RNA Induced Silencing Complex, and showed that TRBP is required for RNAi activity. We also examined the ability of the HIV RNA elements, TAR and Rev-Response Element (RRE) to act as RSSs. We showed that TAR and RRE suppress RNAi and that they compete with siRNAs for binding to TRBP. We also showed that a lentiviral vector, but not an intact HIV molecular clone, exhibits RSS activity in transfection assays, leading us to conclude that suppression of RNAi in the viral context may occur during low-level viral replication or involves other players. In our assays, RRE is able to trans-complement virus-associated (VA) RNA deficient adenoviruses (Ad∆VA). Because adenoviruses are known to suppress RNAi through their VA RNAs, the finding that RRE restores Ad∆VA replication levels indicates that it is functional in the context of viral replication. We have shown that TRBP is a crucial component of RNAi, making it an ideal target for viruses to disrupt cellular pathways. HIV-encoded RNA elements bind to TRBP and displace siRNAs from this protein, which suggests a regulatory role for RRE and TAR during viral replication. Further work may demonstrate that at discrete points during the viral replication cycle, RRE and TAR are able to change the activity of TRBP in the cell. / La protéine liant l'élément de réponse à la trans-activation (TAR), TRBP, est multifonctionnelle, ayant un rôle dans plusieurs voies cellulaires, de la réponse au stress à la défense antivirale, en passant par l'oncogenèse et l'interférence ARN (iARN). La régulation de l'expression génique au niveau post-transcriptionnel régit la plupart des fonctions cellulaires. Dans les cellules non-mammifères, l'iARN est reconnue comme étant une composante essentielle de la défense antivirale. Chez les mammifères, il existe déjà des systèmes immunitaires innés et acquis, qui répondent très bien aux virus entrants. Le rôle de l'iARN dans ce contexte est donc controversé. Dans le cas du virus de l'immunodéficience humain (VIH), plusieurs publications ont proposé les éléments viraux Tat et TAR comme suppresseurs de la mise en silence de l'ARN (RSS), mais ce rôle est contesté car il existe aussi des données divergentes et de nombreuses études ont démontré que des approches anti-VIH basées sur l'iARN sont efficaces. Ce travail évalue le rôle de TRBP dans le contexte de l'iARN et de la réplication du VIH-1. Nous avons caractérisé la liaison entre TRBP et Dicer, une autre protéine clé du complexe de mise en silence induit par l'ARN, et avons démontré que TRBP est essentiel pour l'activité d'iARN. De plus, nous avons étudié la capacité de certains éléments ARN du VIH, TAR et l'élément de réponse à Rev (RRE), d'agir comme RSS. Nous avons montré que TAR et RRE inhibent l'iARN et entrent en compétition avec les siARN pour se lier à TRBP. Nous avons aussi montré qu'un vecteur lentiviral, mais pas un clone moléculaire du VIH intact, présente une activité RSS dans des essais de transfection. Ceci nous a mené à la conclusion que l'inhibition de l'iARN dans le contexte viral se déroule peut-être lorsque le niveau de réplication viral est très faible, ou requiert l'intervention d'autres acteurs. Dans nos essais, RRE complémente aussi un adénovirus déficient en VA (Ad∆VA). Comme les adénovirus inhibent eux-mêmes l'iARN à travers leurs ARN VA, la découverte que RRE rétablit le niveau de réplication du Ad∆VA indique que cette molécule est fonctionnelle dans le cadre de la réplication virale.Nous avons démontré que TRBP est une composante essentielle de l'iARN, ce qui en fait une cible idéale pour la dérégulation virale des processus cellulaires. Des ARN codés par le VIH lient TRBP et déplacent les siARNs de cette protéine, ce qui suggère un rôle régulateur pour RRE et TAR pendant la réplication virale. D'autres travaux à l'avenir démontreront peut-être qu'à des moments précis de la réplication virale, RRE et TAR changent l'activité de TRBP dans la cellule.
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The biochemical and genetic characterization of the TCA cycle in «Sinorhizobium meliloti»Meek, David John January 2014 (has links)
In the symbiotic association between S. meliloti and its plant host, the nutrient exchange from plant to bacteroid is in the form of C4-dicarboxylic acids such as malate. These compounds directly enter the TCA cycle and the derived energy is used for the nitrogen-fixation process. Malate dehydrogenase (mdh), the two subunits of succinyl-CoA synthetase (sucCD), and two of the three subunits of 2-oxoglutarate dehydrogenase (sucAB) are encoded as an operon with the order mdh-sucCDAB. The expression of this operon is controlled by a single promoter found directly upstream of mdh. The transcrptional start site was mapped (a guanine residue at postion -63) and RT-PCR demonstrated that expression is as one polycistronic message in cells grown in LBmc. Transcriptional lacZ-gene fusions to mdh, sucD and sucA demonstrated that the mdh promoter is under catabolite control as evidenced by the change in ß-galactosidase expression depending on the carbon-source. Expression was highest with acetate followed closely by arabinose and glutamate but lowest with pyruvate as sole carbon-source. MDH was purified, N-terminal sequenced and kinetic assays were performed to determine Km, Vmax. A pH 10 was found to be the optimal for MDH. 2-oxoglutarate exhibited competitive inhibition on MDH. The annotated genome of S. meliloti contains two alleles (sucB), one chromosomal and one on megaplasmid pSymB, which putatively encode the E2 subunit of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Only the chromosomally-borne allele was found to be a functional sucB. Lastly, results of a study of the E3 subunits of pyruvate dehydrogenase, 2-oxoglutarate dehydrogenase and branched-chained keto-acid dehydrogenase were presented. / Dans la relation symbiotique entre S. meliloti et la plante M. sativa, l'apport en nutriments de la plante vers les bacteroids se fait sous la forme d'acides C4-dicarboxiliques tel que le malate. Ces composés entrent directement dans le cycle de Krebs et l'énergie produite est utilisée pour la fixation d'azote. Malate déhydrogénase (mdh), les deux composantes de succinyl-CoA synthèse (sucCD), et deux des trois composantes de 2-oxoglutarate déhydrogénase (sucAB), sont inscrites en un opéron dans l'ordre qui suit ; mdh-sucCDAB. L'expression de cet opéron est contrôlée par un seul promoteur situé directement en amont de mdh. Le site de début de transcription a été identifié et RT-PCR a démontré la nature polycistronique de l'expression dans les cellules provenant de bactéries cultivées avec LBmc. Fusions transcriptionelles aux gene-lacZ de mdh, sucD et sucA ont été utilisées pour déterminer les niveaux relatifs d'expression dans des cultures provenant de médiums minimaux contenant des sources de carbone spécifiques. MDH a été purifié, le N-terminal séquencé, et des dosages cinétiques ont été performés pour déterminer Km, Vmax, le pH optimal, et l'effet des inhibiteurs allostériques. Le génome annoté de S. meliloti contient deux allèles qui encodent supposément les composantes E2 (sucB) de 2-oxoglutarate déhydrogénase. Un seul des allèles a démontré être une version fonctionnelle de sucB. Finalement, les résultats d'une étude sur les composantes E3 de pyruvate déhydrogénase, sur 2-oxoglutarate déhydrogénase et sur déhydrogénase de kéto-acide de chaines ramifiées seront présentés.
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Microencapsulated ferulic acid esterase active «Lactobacillus fermentum» for the reduction of inflammation and cholesterol in metabolic syndromeTomaro-Duchesneau, Catherine January 2014 (has links)
Metabolic syndrome (MetS) is an important public health concern of industrialized countries. MetS is a cluster of metabolic disturbances, including abdominal obesity, atherogenic dyslipidemia, elevated blood pressure, insulin resistance and the presence of a proinflammatory and prothrombotic state. Currently, there is no successful therapeutic intervention for the prevention and treatment of this disorder. Chronic systemic inflammation and hypercholesterolemia are two important therapeutic targets of MetS. The goal of this work is to develop a novel microencapsulated ferulic acid-producing probiotic Lactobacillus formulation as a MetS biotherapeutic. Specifically, a number of selected probiotic strains were screened for their ferulic acid esterase activity to select the best probiotic producer of ferulic acid from ethyl ferulate, a natural substrate. Ferulic acid is a molecule with important therapeutic properties relevant to the development of a MetS biotherapeutic. Due to the harsh conditions of the gastrointestinal tract, we propose microencapsulation as a carrier capable of protecting the viability and activity of the probiotic cells. Hence, the best ferulic acid-producing L. fermentum was microencapsulated using alginate-polylysine-alginate microcapsules. The probiotic viability and activity in the microcapsules was significantly higher than that of non-microencapsulated probiotic cells following exposure to gastrointestinal conditions in an in vitro model, demonstrating its suitability for oral delivery. The probiotic L. fermentum formulation was shown to possess anti-inflammatory properties, in vitro. Specifically, the probiotic reduced the secretion of macrophage pro-inflammatory cytokines and provided protection of the intestinal epithelial integrity in a co-culture model of the epithelium. As well, the probiotic formulation demonstrated important cholesterol-lowering activity, by assimilating cholesterol and via inhibition of colon epithelium cholesterol uptake, determined in vitro. Results also demonstrate that L. fermentum, administered in animal models of MetS, significantly reduced a number of MetS-associated risk factors, including cholesterol, adiposity, insulin resistance and hyperglycemia. This novel work indicates the potential of a ferulic acid-producing microencapsulated probiotic formulation as a biotherapeutic for MetS treatment and prevention. Further studies, including clinical investigations, are required to demonstrate the full potential of this probiotic biotherapeutic for the management of MetS. / Le syndrome métabolique (SMet) est une préoccupation importante des pays industrialisés au niveau de la santé publique. SMet est un groupe de troubles métaboliques, qui comprend l'obésité abdominale, la dyslipidémie athérogènique, l'hypertension artérielle, la résistance à l'insuline et la présence d'un état pro-inflammatoire et pro-thrombotique. Actuellement, il n'existe aucune intervention thérapeutique efficace pour la prévention et le traitement de ce syndrome. L'inflammation systémique chronique et l'hypercholestérolémie sont deux cibles thérapeutiques importantes du SMet. Le but de cette recherche est de développer une nouvelle formulation biothérapeutique de microcapsules probiotiques produisant de l'acide férulique pour combattre le SMet. En particulier, des souches probiotiques ont été évaluées pour leur activité d'estérase d'acide férulique pour choisir le probiotique produisant le plus d'acide férulique. L'acide férulique est une molécule possédant des propriétés thérapeutiques importantes relatives au développement d'une biothérapeutique SMet. La souche de L. fermentum sélectionnée a été microencapsulée à l'intérieur de microcapsules d'alginate-polylysine-alginate. La viabilité des cellules probiotiques et leur activité dans les microcapsules était significativement supérieure à celle des cellules probiotiques non-microencapsulées une fois soumises à des conditions gastro-intestinales dans un modèle in vitro, ce qui démontre leur aptitude à l'administration orale. La formulation probiotique L. fermentum a démontré des propriétés anti-inflammatoires, in vitro. En particulier, le probiotique L. fermentum réduit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les macrophages et assure la protection de l'intégrité épithéliale intestinale dans un modèle in vitro de l'épithélium. La formulation probiotique a aussi démontré une activité anti-cholestérol importante en assimilant le cholestérol et par l'inhibition de l'absorption du cholestérol par l'épithélium du côlon, déterminée in vitro. Les résultats démontrent également que L. fermentum, administré dans des modèles animaux de SMet, réduit de manière significative plusieurs facteurs associés au SMet, y compris le cholestérol, l'adiposité, l'insulinorésistance et l'hyperglycémie. Cette nouvelle recherche démontre le potentiel d'une formulation probiotique microencapsulée, produisant de l'acide férulique, comme un biothérapeutique pour le traitement et la prévention du SMet. D'autres études, y compris des études cliniques, sont nécessaires pour démontrer la pertinence de ce produit.
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Microbial diversity, activity, and ecology of a hypersaline high Arctic spring systemLay, Chih-Ying January 2014 (has links)
The Lost Hammer (LH) spring, located on Axel Heiberg Island in the Canadian High Arctic, is the coldest and saltiest terrestrial spring discovered to date. It is characterized by perennial discharges of subzero temperatures (-5°C), hypersalinity (24% salinity), along with reducing (≈-165 mV), microoxic, and oligotrophic conditions. It is rich in sulfates (10.0% w/w), dissolved H2S/sulfides (up to 25 ppm), ammonia (≈381 μM), and methane (11.1 g d-1). The LH spring system contains the outlet and the outflow channel. In the initial study of the LH channel sediment, the results determined the microbial abundance by using fluorescent microscopy in the channel sediment; also, the study characterized the cultured representatives and confirmed that most of these isolates are halotolerant and psychrotolerant microorganisms. The mineralization assays on the LH channel sediment revealed that the heterotrophic microorganisms remained activity down to -20°C. To determine the total microbial communities inhabiting the LH spring system, the study demonstrated the microbial 16S rRNA genes and the active 16S rDNA profiles for different sampling locations, including the outlet, channel and the adjacent tundra. We identified that the Bacteria from the five phyla (Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Cyanobacteria) were the dominant bacterial groups at the LH spring system. In the archaeal communities, microorganisms affiliated with three phyla (Euryarchaeota, Crenarchaeota, and Thaumarchaeota) were identified. To determine its total functional and genetic potential, we performed metagenomic analysis of the LH spring outlet microbial community. Reconstruction of the enzyme pathways responsible for bacterial nitrification/denitrification/ammonification and sulfate reduction appeared nearly complete in the metagenomic dataset. Stress-response genes for adapting to cold, osmotic stress, and oxidative stress were also abundant in the metagenome. Comparing functional community composition of the LH spring to metagenomes from other saline/subzero environments revealed a close association between LH and another Canadian High Arctic permafrost environment, particularly in genes related to sulfur metabolism and dormancy. To identify the abundance and the presence of the featured genes (amoA and hcd) of Thaumarchaea at the LH spring system, we performed qPCR to assess their abundance. A phylogenetic analysis was performed using the putative amino acid sequences of these genes to identify their phylogenetic affiliation. The copy numbers of Thaumarchaeal amoA and hcd genes in LH channel sediment and the adjacent tundra were roughly 10 to a hundred-folds less than those reported in other environments. The phylogenetic tree of amoA showed similar patterns of grouping as the analysis done by 16S rRNA. This thesis demonstrates the microbial ecology, diversity and activity at the LH spring system and provides knowledge for the microbiology studies on cryo- and hypersaline environments. / La source de Lost Hammer (LH), située sur l'ile d'Axel Heiberg dans le Grand Nord Canadien, est la source la plus froide et la plus salée découverte à ce jour sur terre. Elle est caractérisée par des décharges pérennes de températures sous zéro (-5°C), par ses conditions hyper salines (salinité de 24%), réductrices (≈-165 mV), microoxiques, et oligotrophiques. Elle est aussi riche en sulfates (10.0% w/w), en H2S/sulfites dissouts, en ammoniac (≈381 μM), et en methane (11.1 g d-1). Le système de la Source de LH contient la sortie et le canal de sortie. L'étude originale des sédiments du canal détermina l'abondance de microbes avec des techniques de microscopie fluorescente. L'étude caractérisa aussi les cultures représentatives et confirma que la majorité des isolats sont des microorganismes halotolérants et psychrotolérants. Les tests de minéralisation des sédiments du canal de LH ont révélés que les microorganismes hétérotrophes restent actifs jusqu'à -20°C. Pour determiner la communauté totale vivant dans le système de la source de LH, l'étude investigua les profils de l'ARNr 16S ainsi que l'ARNr 16S actif microbien pour différents endroits d'échantillonnage, incluant la sortie, le canal, et la toundra adjacente. Nous avons identifié que les bactéries de cinq phylums (Bacteroidetes, protéobactéries, Actinobactéries, Firmicutes et Cyanobactéries) étaient les groupes de bactéries dominantes dans ce système. Dans les communautés archées, des microorganismes affiliés avec trois phylums (Euryarchaeota, Crenarchaeota et Thaumarchaeota) ont été identifiés. Pour déterminer son potentiel fonctionel et génétique total, nous avons performé l'analyse métagénomique de la communauté microbienne de la sortie de la source de LH. La reconstruction des voies enzymatiques responsables pour la nitrification/dénitrification/ammonification bactériennes et pour la réduction du sulfate apparut presque complète dans la banque de donnés métagnénomique. Les gènes de réponse au stress pour l'adaptation au froid, pour les chocs osmotiques et pour le stress oxydatif étaient aussi abondants dans le métagénome. En comparant la composition des communautés fonctionnelles du métagénome de la Source de LH, avec d'autres environnements salins et sous zéro, a révélé une association entre LH et un autre environnement du permafrost du Grand Nord Canadien, particulièrement dans les gènes reliés au métabolisme de sulfure et de dormance. Pour identifier l'abondance et la présence de gènes d'intérêt (amoA et hcd) de Thaumarchaea dans le système, nous avons performé les expériences qPCR. Une analyse phylogénique a aussi été faite pour identifier leur affiliation phylogénique en utilisant les séquences probables d'acides aminés de ces gènes. Le nombre de copies des gènes amoA et hcd de Thaumarchaea dans les sédiments du canal et dans la toundra adjacente étaient environ dix à cent fois moins que ceux rapportés dans d'autres environnements. L'arbre phylogénique de amoA a démontré des motifs similaires de regroupement à ceux de l'analyse faite avec r16S rADN. Cette thèse démontre l'écologie microbienne, la diversité et l'activité du système de la Source de LH, et apporte un savoir pour les études de microbiologie sur des environnements froids et hypersalins.
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Antimicrobial peptide resistance mechanisms used by Enteropathogenic and Enterohemorrhagic «Escherichia coli»Thomassin, Jenny-Lee January 2014 (has links)
Enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli (EPEC and EHEC) are Gram-negative pathogens that cause diarrheal disease in the developed and developing world. To cause infection, these pathogens must overcome innate host defenses, such as secreted cationic antimicrobial peptides (AMPs). There are two groups of human AMPs: cathelicidins (LL-37) and defensins (α-defensin 5). AMPs are expressed in specific locations of the human body. In the small intestine, the infectious niche for EPEC, human α-defensins 5 and 6 (HD-5 and HD-6) are abundant and there are low levels of LL-37. Conversely in the colon, the infectious niche for EHEC, HD-5 and HD-6 are not expressed and LL-37 is abundant. Pathogens can overcome AMP-killing using several mechanisms, including proteolytic inactivation, producing shielding structures and modifying their lipopolysaccharide (LPS). We hypothesized that EPEC and EHEC use AMP-resistance mechanisms to resist killing by secreted AMPs during infection. Previously, CroP the omptin protease in Citrobacter rodentium, a murine pathogen used to model EPEC and EHEC infections, was shown to degrade murine cathelicidin. Both EPEC and EHEC have a CroP-homologue: OmpT. The contribution of OmpT to LL-37 resistance was analyzed in both pathogens. Peptide cleavage assays showed that EHEC OmpT cleaves and inactivates LL-37 more rapidly than EPEC OmpT. Higher ompT-expression and protein levels in EHEC than EPEC are responsible for the differences observed in LL-37 inactivation rates. Additional studies showed that OmpT was unable to cleave folded α-defensins. These data suggest that EPEC uses other mechanisms to resist killing by the AMPs in its infectious niche. To assess this possibility, surface structures that may shield the bacterial membrane from AMPs were identified. High transcript levels of gfcA, a gene required for group 4 capsule (G4C) secretion, were observed in EPEC but not EHEC. The unencapsulated EPEC ΔgfcA and EHEC wild-type strains were more susceptible to HD-5 killing than EPEC wild-type. Since the G4C is composed of the same sugar repeats as the LPS O-antigen, an O-antigen ligase (waaL) deletion mutant was generated to assess the role of the O-antigen in HD-5 resistance. The EPEC ΔwaaL strain was more susceptible to HD-5 than both the wild-type and ΔgfcA strains. Addition of exogenous polysaccharide increased survival of the ΔgfcAΔwaaL strain in the presence of HD-5, suggesting that HD-5 binds the polysaccharides present on the surface of EPEC. These data show that EPEC relies on both the G4C and O-antigen to resist the bactericidal activity of HD-5. Altogether, these data indicate that EHEC and EPEC differentially regulate AMP-specific resistance mechanisms as an adaptation to their specific infectious niches. / Les Escherichia coli entéropathogènes et entérohémorrhagiques (EPEC et EHEC) sont des bactéries à coloration Gram-négative qui causent des diarrhées dans les pays développés et en développement. Pour causer une infection, ces pathogènes doivent surmonter les défenses de l'immunité innée de l'hôte, tel que les peptides antimicrobiens sécrétés (PAMs). Chez l'humain, les PAMs sont divisés en deux groupes, les cathélicidines (ex. LL-37) et les défensines (ex. α-défensine humaine 5). L'expression des PAMs varie selon les tissus. Dans l'intestin grêle, la niche infectieuse des EPEC, les α-défensines humaines 5 et 6 (HD-5 et HD-6) sont abondantes et le niveau de LL-37 est bas. Inversement, HD-5 et HD-6 ne sont pas exprimées dans le côlon, la niche infectieuse des EHEC, et LL-37 est très abondant. Les pathogènes peuvent résister aux PAMs en utilisant différent mécanismes comme l'inactivation protéolytique, la production de structures recouvrant la cellule bactérienne et la modification du lipopolysaccharide (LPS). Notre hypothèse est que les EPEC et EHEC utilisent des mécanismes de résistance aux PAMs pour établir une infection. Précédemment, il a été démontré que la protéase de type omptin, CroP, de Citrobacter rodentium, un pathogène murin utilisé comme modèle pour les infections des EPEC et EHEC, dégrade la cathélicidine murine. Les EPEC et EHEC possèdent un homologue de CroP, OmpT. La contribution de OmpT à la résistance au LL-37 a été examinée chez ces deux pathogènes. Nos tests de clivage de peptide ont démontré que EHEC OmpT clive et inactive LL-37 plus rapidement que EPEC OmpT. La différence observée a été associée à une plus forte expression et production de OmpT chez les EHEC que chez les EPEC. Des tests supplémentaires ont démontré que OmpT ne peut pas cliver les α-défensines repliées. Ces données suggèrent qu'EPEC utilise d'autres mécanismes de résistance pour surmonter l'activité des PAMs présents dans sa niche infectieuse. Pour tester cette possibilité, les structures recouvrant la cellule ont été identifiées. Un haut niveau de transcription de gfcA, un gène requit pour la sécrétion de la capsule du groupe 4 (G4C), a été observé chez EPEC mais pas chez EHEC. Le mutant EPEC non-encapsulé ΔgfcA et la souche sauvage EHEC sont plus susceptible à l'effet du HD-5 que la souche sauvage EPEC. Étant donné que la G4C est composée des mêmes sucres que l'antigène O, la ligase de l'antigène O, waaL, a été délétée pour déterminer le rôle de l'antigène O dans la résistance au HD-5. La souche EPEC ΔwaaL est plus susceptible au HD-5 que la souche sauvage EPEC et le mutant EPEC ΔgfcA. L'addition de polysaccharide exogène augmente la survie du mutant ΔwaaLΔgfcA en présence de HD-5. Ceci indique que HD-5 se lie aux polysaccharides présents à la surface des EPEC. Ces données démontrent que la résistance à HD-5 chez EPEC repose sur la présence de la G4C et de l'antigène O. Toutes ces données indiquent que EHEC et EPEC utilisent des mécanismes de résistance différents aux PAMs, ce qui démontre une adaptation à leurs niches infectieuses respectives.
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Investigations of Irgm1 during experimental infections with «Mycobacterium avium paratuberculosis»Kreitmann, Louis January 2014 (has links)
Introduction: Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) is the causative agent of a chronic granulomatous enteritis of ruminants called Johne's disease (JD). Crohn's disease (CD) is an inflammatory bowel disease of unknown etiology affecting humans. Due to histological similarities between the two conditions, it has been suggested that MAP could be responsible for a subset of cases of CD. Irgm1 (murine ortholog of IRGM, a CD susceptibility gene) has been linked to host defence against mycobacteria. Methods: In the first part of this work, we have attempted to study the immune response of the Irgm1-/- mouse to systemic infection with MAP. In the second part, we have attempted to use the Irgm1-/- mouse as a host susceptible to lead to significant pathology after intra-intestinal infection with MAP (a murine model of JD) and documented its response to therapeutics used in the care of patients with CD. Results: First, we have shown that mice deleted for Irgm1 have a major susceptibility to systemic MAP infection, with accelerated rate of death and uncontrolled bacterial replication. To explain this, we have identified a defect of Irgm1-/- macrophages in controlling the intracellular growth of MAP. We have also identified severe haematological abnormalities leading to their death. Second, we have devised a protocol for the surgical inoculation of ~ 109 MAP colony forming units (CFUs) in the jejunum of Irgm1-/- mice. After 1 and 2 months of infection, we have observed significant intestinal histopathological lesions resembling those seen in Johne's disease, including focal and transmural lympho-histiocytic infiltrates and mesenteric lymphadenopathy. Mice infected according to this protocol were submitted to: 1) a systemic treatment with methylprednisolone, which did not lead to increased mortality; and 2) a treatment with an anti-tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) antibody, which did not lead to uncontrolled MAP replication in the host.Conclusion: Irgm1-/- mice are markedly susceptible to systemic MAP infection. When inoculated with ~ 109 MAP CFUs in the lumen of the jejunum, they develop stable histological lesions resembling those of JD. Interestingly, treatments used in the cure of patients with CD did not have a deleterious effect. / Titre du mémoire : Etude du rôle d'Irgm1 au cours d'infections expérimentales par Mycobacterium avium paratuberculosis Introduction : Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) est responsable d'une entérite chronique granulomateuse chez les ruminants, la maladie de Johne (ou paratuberculose). La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif d'étiologie indéterminée qui affecte les humains. Du fait de similarités histologiques entre les deux conditions, il a été suggéré que MAP pouvait être responsable de certains cas de maladie de Crohn. Irgm1 (orthologue murin de IRGM, un gène de susceptibilité à la maladie de Crohn), a été impliqué dans la réponse immunitaire contre les mycobactéries. Méthodes : Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié la réponse immunitaire de la souris Irgm1-/- au cours d'une infection systémique par MAP. Dans la second partie, nous avons cherché à utiliser la souris Irgm1-/- pour induire des lésions histologiques après infection intra-intestinale par MAP (réalisant un modèle murin de maladie de Johne), et avons documenté la réponse de ce modèle à des traitements utilisés chez les patients atteints de maladie de Crohn. Résultats : Nous avons montré que la souris Irgm1-/- présente une susceptibilité majeure à une infection systémique par MAP, avec mortalité accélérée et réplication bactérienne incontrôlée. Nous avons identifié un défaut des macrophages Irgm1-/- à contrôler la croissance intra-cellulaire de MAP. Nous avons aussi identifié des anomalies hématologiques expliquant leur mortalité accélérée. Dans un second temps, nous avons conçu un protocole consistant en l'injection par voie chirurgicale de ~ 109 unités formant colonies (UFC) de MAP au sein de la lumière du jéjunum de souris Irgm1-/-. Nous avons observé qu'à 1 et 2 mois post-infection, nous avions induit des lésions histologiques ressemblant à celles rencontrées dans la maladie de Johne, notamment des infiltrats lympho-histiocytiques focaux et transmuraux et une lymphadénopathie mésenterique. Des souries infectées selon ce protocole ont été soumises à: 1) un traitement systémique par methylprednilosone, qui n'a pas entrainé une augmentation de la mortalité; et 2) un traitement par anticorps anti-tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), qui n'a pas provoqué une réplication bactérienne incontrôlée. Conclusion : Les souris Irgm1-/- sont susceptibles à une infection systémique par MAP. Après inoculation par voie chirurgicale de ~ 109 UFC de MAP, elles développent des lésions histologiques stables analogues à celles de la maladie de Johne. Des traitements utilisés pour traiter la maladie de Crohn n'ont pas entrainé d'effet délétère. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour évaluer l'utilité de ce modèle dans les recherches sur la maladie de Johne et sur la maladie de Crohn.
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Novel protein-protein interactions involved in siderophore uptake in «Escherichia coli»Deme, Justin January 2009 (has links)
The level of bioavailable ferric iron (10-24 M Fe3+) in human serum is limited by its low solubility at physiological pH and by iron-binding host proteins. This situation poses a dilemma for bacteria; for survival, they must maintain an intracellular free iron concentration of 10-6 M. Gram-negative bacteria overcome iron limitation by producing siderophores that chelate iron with high affinity. Escherichia coli imports the siderophore ferrichrome via the TonB-dependent ferric hydroxamate uptake (Fhu) system. Extracellular ferrichrome is transported across the outer membrane (OM) through FhuA, a β-barrel receptor. The TonB–ExbD–ExbB complex provides energy for transport by harnessing the proton motive force across the cytoplasmic membrane (CM) and delivering it to the OM receptor. After passing through FhuA, ferrichrome is captured by the periplasmic binding protein FhuD and shuttled to the CM-embedded ABC transporter complex FhuB–FhuC. We previously demonstrated a novel interaction between FhuD and the energy transducer TonB. By phage display, we identified three well-defined regions of interaction on TonB to which FhuD was predicted to bind. To extend these studies, we utilized PSIPRED and SERp bioinformatics servers to identify areas on TonB that were unstructured and flexible. Redundant residues within the proline-rich region of TonB (residues 66-100) fit these criteria and were also not predicted to be necessary for complex formation with FhuD. A TonB construct lacking its proline-rich region, yet retaining its three predicted binding regions for FhuD, was engineered and purified to homogeneity. By ELISA, TonBΔ66-100 bound FhuD in a concentration-dependent manner, comparable to binding by full-length TonB. Surface plasmon resonance measured a binding affinity between FhuD and TonBΔ66-100 of 9 nM, consistent with data obtained for FhuD binding full-length TonB. Furthermore, presence of bound / La disponibilité du fer dans le sérum humain est limitée à 10-24 M de Fe3+. Ceci pose un dilemme pour les bactéries, car elles doivent en maintenir une concentration intracellulaire de 10-6 M pour survivre. Les bactéries Gram-négatives peuvent éviter cette limitation en produisant des sidérophores, capables de chélater le Fe3+ avec une grande affinité. Le ferrichrome, un sidérophore, est importé dans Escherichia coli par le système 'ferric hydroxamate uptake' (Fhu), qui dépend de la protéine TonB. Le ferrichrome extracellulaire est transporté à travers la membrane externe par FhuA, un tonneau β. Le complexe TonB–ExbD–ExbB fournit l'énergie nécessaire au transport via la force protomotrice. Le ferrichrome est capturé dans le périplasme par FhuD, pour être ensuite transloqué au complexe FhuB–FhuC, un transporteur de type ABC localisé dans la membrane interne. Notre groupe était la première à découvrir une interaction entre FhuD et TonB. Par la technique génétique moléculaire phage display, on a identifié trois régions sur TonB donc FhuD est prédit d'interagir. Nous avons généré un plasmide contenant TonB avec une délétion interne (résidus 66-100), qui est identifiée comme non structurée et très entropique par les programmes bioinformatiques PSIPRED et SERp. Une forme de TonB sans cette région (TonBΔ66-100) a été purifiée à l'homogenéité par chromatographie d'affinité. Nous avons observé que TonBΔ66-100 se lie à FhuD, comme sa contrepartie complète, par ELISA et par résonance plasmonique de surface (SPR), avec une affinité de liaison de 9 nM. Aussi, cette liaison n'était pas dépendente sur la présence de sidérophore. Cependant, la liaison entre FhuD et TonB n'est pas affectée par l'élimination de la région flexible riche en prolines de cette dernière. Ces résultats approfondissent la description de cette interaction critique de prot
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