Outer membrane proteins (OMPs) of the omptin family are present in some Gram-negative bacteria. Omptins protect cells by cleaving antimicrobial peptides (AMPs). For example, the Escherichia coli OmpT and OmpP impart resistance by cleaving the AMP protamine, and PgtE of Salmonella enterica was also reported to cleave AMPs. Despite identification of many in vitro substrates, few physiological substrates have been tested. Our laboratory recently identified the omptin CroP of Citrobacter rodentium, which cleaves the murine α-helical AMP mCRAMP and the similarly α-helical synthetic AMP C18G. We examined AMPs as substrates of several omptins. OmpT, OmpP, and CroP cleave the AMP C18G more effectively than PgtE, leading to higher minimal inhibitory concentrations (MICs). This suggests that AMP cleavage is an important function of OmpT, OmpP, and CroP during infection. Based on initial results, we attempted to compare and contrast specificity and catalytic activity of C18G cleavage by purified CroP and PgtE. / Les protéines de la membrane externe de la famille omptin se trouvent dans quelques bactéries à Gram négatif. En coupant les peptides antimicrobiens (PAMs), les omptins protègent les bactéries. Par exemple, les omptins OmpT et OmpP d'Escherichia coli, et l'omptin PgtE de Salmonella enterica, coupent les PAMs. Malgré l'indentification de plusieurs substrats in vitro, peu de substrats physiologiques ont été découverts. Dans notre laboratoire, on a identifié l'omptin CroP de Citrobacter rodentium, qui coupe le PAM murin mCRAMP. On décrit ici l'activité de plusieurs omptins contre les PAMs. OmpT, OmpP et CroP coupent le PAM C18G plus efficacement que PgtE, ce qui mène à des concentrations minimale inhibitrices (CMIs) plus haute. Ces résultats suggèrent que l'activité catalytique d'OmpT, OmpP, et CroP est importante lors de l'infection. À la suite des résultats préliminaires, on a tenté de comparer la spécificité et l'activité catalytique contre C18G des protéases purifiées CroP et PgtE.

Mycobaterium bovis Bacille Calmete-Guerin (BCG) strains are live attenuated vaccines given to prevent tuberculosis. The nature of their attenuation has long been obscure. Recent studies suggest that BCG vaccines are metabolic mutants and antigen mutants, proposed to result in bacteria with decreased persistence and immunogenicity in the host. One specific metabolic defect is that BCG strains are unable to use certain amino acids as nitrogen sources, and paradoxically, that adding L-serine to the culture medium inhibits growth. To explore this further, we studied the growth of BCG strains in different concentrations of serine (both in vivo and in vitro ), screened several candidate genes for mutations and studied the transcription of sdaA and glnA1 genes (encoding for serine deaminase and glutamine synthetase respectively) in the presence or absence of serine. We found that growth inhibition caused by serine could be reversed by over-expressing sdaA or glnA1 via plasmid complementation and by supplementing growth media with glutamine or alpha-ketoglutarate. However, we were unable to detect any genetic mutations that might explain these findings. Consequently, we postulated that BCG strains fail to adequately induce transcription of otherwise genetically-intact sdaA and glnA1 genes in response to serine-induced blockade of glutamine synthetase. To explore the cause of this deficient response, we turned to Rv3676, predicted to encode the cyclic AMP receptor protein, for which a number of mutations have been described in BCG strains. We noted that M. tuberculosis can utilize glucose, unlike BCG strains, but that BCG strains complemented with wild-type Rv3676 are able to consume glucose in vitro. Additionally, plasmid complementation of BCG strains with Rv3676 reversed the growth inhibition caused by serine. Together, these results suggest that mutations in the Rv3676 global regulator gene in BCG strains have resulted in impaired glucose utilization by BCG strains, indirectly impairing sensing of nitrogen status, as measured by serine-associated growth inhibition. The potential implications of this series of metabolic defects for virulence and persistence of the organism in the vaccinated host are discussed. Concretely, we hypothesized that BCG's growth defect in high serine is related to flaws in nitrogen metabolism, or its regulation.

Cranberry-derived compounds, including a fraction known as proanthocyanidins (PACs) exhibit anti-microbial, anti-infective, and anti-adhesive properties against a number of disease-causing organisms. This thesis illustrates the effect of cranberry proanthocyanidins (CPACs) on the infection of epithelial cells by two enteric bacterial pathogens, enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Salmonella Typhimurium. Immunofluorescence data showed that actin pedestal formation, required for infection by enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), was disrupted in the presence of CPACs. In addition, invasion of HeLa cells by Salmonella Typhimurium was significantly reduced. CPACs had no effect on bacterial growth, on the production of bacterial virulence proteins or the viability of host cells. Interestingly, we found that CPACs had a potent and dose-dependent effect on the host cell cytoskeleton that was evident even in uninfected cells. CPACs inhibited the phagocytosis of inert particles by a macrophage cell line, providing further evidence that actin-mediated host cell functions are disrupted in the presence of cranberry CPACs. Thus, although CPAC treatment inhibited Salmonella invasion and EPEC pedestal formation, our results suggest that this is likely primarily because of the perturbation of the host cell cytoskeleton by CPACs rather than an effect on bacterial virulence itself. Additional work suggests that while CPACs disrupt epithelial tight junctions in vitro, they are well tolerated in vivo. The use of CPACs for the treatment or prevention of enteric infection in vivo by Citrobacter rodentium was also evaluated, though no conclusions, positive or negative can be drawn thus far. These findings underline the difficulties of translating experimental results to living systems but have significant implications for the interpretation of experiments on the effects of CPACs on bacteria-host cell interactions. / Le fruit de la canneberge est depuis longtemps utilisé par la médecine traditionnelle dans le cadre d'infection urinaire, mais son mécanisme d'action reste mal connu. Récemment plusieurs études ont montré l'implication d'un composé majeur du fruit, le proanthocyanidine (CPAC), dans les propriétés antibactériennes et anti-infectieuses de la canneberge. Le travail présenté ici vise à évaluer l'effet du PAC sur les cellules épithéliales au cours de l'infection par deux bactéries intestinales : Salmonella Typhimurium et la souche d'Escherichia coli entéropathogène (ECEP). Nous avons montré par des techniques d'imagerie que le remodelage du cytosquelette d'actine des cellules hôtes, étape nécessaire à l'infection par les ECEP, était abolit en présence de CPAC, de même, une inhibition significative de l'infection de cellules HeLa par Salmonella Typhimurium est observée en présence du composé. L'absence d'effet du CPAC sur la prolifération bactérienne et sur la sécrétion de facteurs de virulence dans les deux systèmes expérimentaux suggère un impact du composé sur la permissivité des cellules hôtes. De façon concordante, nous avons montré un rôle critique du CPAC dans la polymérisation des filaments d'actine des cellules non-infectées. La phagocytose de particules inertes par une lignée macrophagique qui dépend d'un remodelage actif du cytosquelette est également inhibée par le CPAC, confirmant l'impact majeur du composé sur le fonctionnement cellulaire. Des expériences in vivo d'infection par Citrobater Rodentium (un modèle murin d'ECEP) n'ont pas permis de mettre en évidence d'effet significatif du CPAC sur l'incidence et la sévérité de la maladie malgré l'effet majeur observé in vitro sur les cellules épithéliales. L'ensemble de ces travaux apporte un nouvel éclairage sur l'effet du CPAC dans les interactions entre les pathogènes et les cellules hôtes, il souligne également les différences entre des systèmes expérimentaux in vitro et les mécanismes prenant place dans des organismes complexes in vivo. Des expériences supplémentaires prenant en compte différents paramètres comme le PH intestinal semblent nécessaires pour évaluer définitivement l'impact du CPAC sur les infections entériques.

Transport of scarce nutrients such as iron and vitamin B12 across the outer membrane of Gram-negative bacteria depends on an integral cytoplasmic membrane protein complex: TonB-ExbB-ExbD. The proton motive force across the cytoplasmic membrane is transduced by this complex to TonB-dependent outer membrane receptors. High resolution structures of the C-terminal periplasmic domains of TonB and ExbD have been solved; structural information is lacking for the membrane-spanning regions of these two proteins and for ExbB. The stoichiometry of the complex, the native organization of TonB-ExbB-ExbD and the molecular mechanism of proton translocation remain undetermined. To investigate properties of ExbB-ExbD from Escherichia coli, we cloned exbB and exbD into different vectors and optimized expression of the recombinant proteins. By immobilized metal affinity chromatography in dodecyl maltoside, ExbB co-purified with His6-tagged ExbD, thereby demonstrating their interactions in vitro. Size-exclusion chromatography identified a protein-detergent complex with a molecular weight of approximately 350 kDa. The molecular weight of His6-tagged ExbB, also purified in dodecyl maltoside, was approximately 270 kDa. Negative-staining electron microscopy (EM) revealed uniform particles approximately 10 nm in diameter for the ExbB-ExbD complex. By low-dose single-particle analysis from high-resolution EM images, 2D averages and 3D reconstructions were generated for the ExbB-ExbD complex and for ExbB alone. A total of 45,321 particles for the ExbB-ExbD complex and 72,327 particles for ExbB alone were collected by a computational single-particle selection system (SIGNATURE). Computational single particle analysis for resolution extension (SPARX) refined the 3D reconstructions. His6-tagged ExbB showed particles approximately 9 nm in diameter and matched pentameric organization for the ExbB-ExbD complex. Preliminary analysis of the ExbB-ExbD complex by cryo-EM confirmed findings by negative-staining EM. Knowing the structural organization of the ExbB-ExbD complex will provide insights into the mechanism of energy-dependent nutrient import in bacteria. / Le transport d'éléments nutritifs tels que le fer et la vitamine B12 au travers de la membrane externe (ME) des bactéries Gram-négatives tel Escherichia coli, dépend d'un complexe protéique intégral de la membrane cytoplasmique (MC): TonB-ExbB-ExbD. La force proton motrice qui traverse la MC est transmise par ce complexe aux récepteurs de la ME qui dépendent de TonB pour leur interaction. Les structures des domaines C-terminal périplasmique de TonB et ExbD ont été déterminées à haute résolution; mais, de l'information structurelle manque toujours sur les régions de ces deux protéines recouvertes par la MC et sur ExdB. La stœchiométrie du complexe, l'organisation indigène de TonB-ExbB-ExbD et le mécanisme moléculaire de la translocation des protons demeurent indéterminés. Pour étudier les propriétés du complexe d'ExbB-ExbD d'E. coli, nous avons cloné exbB et exbD dans différents vecteurs et optimisé leur expression. Par la chromatographie d'affinité de métal immobilisé, la co-purification de ExbB avec ExbD démontrait des interactions in vitro. La chromatographie d'exclusion stérique a identifié un complexe protéine-détergent d'une masse moléculaire approximative de 350 kDa pour ExbB-ExbD et de 270 kDa pour ExbB seul. L'utilisation d'un microscope électronique (MÉ) en coloration négative révèle des particules de taille uniformes d'approximativement 10 nm de diamètre pour le complexe d'ExbB-ExbD. Des reconstructions en 2D et 3D ont été générées pour le complexe d'ExbB-ExbD et d'ExbB seul. Ces reconstructions sont basées sur un total de 45,321 particules pour le complexe d'ExbB-ExbD et de 72,327 pour ExbB assemblées par un système informatique pour la sélection de particules individuelles (SIGNATURE). ExbB démontrait des particules d'approximativement 9 nm de diamètre et, tout comme le complexe d'ExbB-ExbD, semble suggérer un arrangement pentamérique. L'analyse préliminaire du complexe d'ExbB-ExbD par cryo-MÉ confirme les observations par MÉ en coloration négative. En obtenant la structure du complexe d'ExbB-ExbD, nous pouvons amélioré notre compréhension des mécanismes moléculaires du transport des nutriments rares parmi les bactéries Gram-négatives.

p53 is a tumor suppressor protein that is mutated in over 50% of human cancers. Although tightly regulated under normal conditions, this protein is quickly activated in response to a multitude of cellular stresses, inducing several downstream pathways such as cell cycle arrest, apoptosis, and senescence. p47 is an N-terminal truncated isoform made by alternative splicing of the p53 gene or from an alternative initiation site for translation, likely through cap-independent translation via an IRES. The objective of this study is to better understand the functions of p47 and to determine its structure and whether it can inhibit p53. p53 is part of a larger homologous family of proteins, including p63 and p73 – both of which contain their own N-terminally truncated isoforms. Having a complete understanding of all these proteins' roles is essential to better understand how cancer originates, progresses, and which pathways are affected. Whether p47 is a negative regulator of p53 or not is currently being disputed due to conflicting results. Evidence in this study suggests that, although p47 shares a structural conformation similar to mutant p53R175H, overall it does not negatively regulate p53. p47 is able to induce growth suppression of cancer cells and does not impair p53's suppression of growth or p53's induction of p21, nor does p47 alter the nuclear localization of p53. These results argue that p47 is not a negative regulator of p53. / La protéine p53 est un gène suppresseur de tumeurs qui est muté dans plus de 50% des cancers humains. Quoique cette protéine soit étroitement contrôlée, elle peut être rapidement activée en réponse à une variété de stress cellulaires et mène à l'activation de plusieurs voies métaboliques telles que l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose et la sénescence. p47 est un isoforme de p53 tronqué à l'extrémité N-terminale. La protéine p47 est générée soit par épissage alternatif de p53, soit par initiation de la traduction à un site alternatif, probablement par un mécanisme indépendant de la coiffe en 5' via un site d'entrée interne ribosomal (séquence IRES).Le but de ce projet est de mieux comprendre les fonctions de p47, notamment en déterminant sa structure et si p47 peut inhiber p53. p53 appartient à une grande famille de protéines homologues qui inclut p63 et p73, deux protéines qui ont leurs propres isoformes tronqués à l'extrémité N-terminale. Connaître le rôle de ces protéines est essentiel pour mieux comprendre comment le cancer apparaît, progresse, et les voies métaboliques qui y sont affectées. A cause de résultats contradictoires dans la littérature scientifique, il n'est pas clair si p47 peut inhiber p53. Les résultats présentés dans cette étude suggèrent que, bien que p47 a une structure semblable au mutant p53R175H de p53, p47 ne contrôle pas p53. p47 peut bloquer la croissance de cellules cancéreuses et n'affecte pas le blocage de croissance causé par p53, l'induction de p21 par p53, ni la localisation nucléaire de p53. Ces résultats indiquent que p47 n'est pas un régulateur négatif de p53.

Group II (GII) introns are large ribozymes that can autocatalytically excise themselves from pre-mRNA transcripts. They are found in bacteria, archaea, and the organelles of lower eukaryotes and land plants. GII introns contain all the necessary components for splicing, but protein splicing factors are essential to induce proper tridimensional folding of these intron RNAs in vivo. GII introns in bacteria and archaea usually encode their own splicing factor, termed the intron-encoded protein (IEP). In contrast, most GII introns in land plants do not encode an IEP. Instead, such GII introns depend on a diverse set of RNA-binding proteins to act as splicing factors. We aim to explore the potential diversity of group II intron splicing factors in bacteria.We study the model group II intron Ll.LtrB, from the Gram-positive bacterium Lactococcus lactis. Ll.LtrB encodes the IEP LtrA, which is essential for efficient and accurate splicing. Ll.LtrB interrupts the gene coding for the relaxase enzyme (LtrB), necessary to initiate the transfer of conjugative elements in L. lactis. Since ligation of ltrB exons is necessary for conjugation, splicing efficiency of Ll.LtrB from the ltrB pre-mRNA controls the transfer efficiency of conjugative elements. We took advantage of this relationship to develop a sensitive conjugation assay to study a splicing-deficient mutant of Ll.LtrB, which lacks LtrA (Ll.LtrBΔLtrA). Previously, a genomic expression library of L. lactis was generated in a conjugative plasmid. A conjugation assay was performed and led to the selection of three plasmids containing genomic fragments (Lib7,9,11) that can rescue conjugation efficiency in the absence of LtrA (Ll.LtrBΔLtrA).Lib11 encodes five putative open reading frames (ORFs) and two partial ORFs. We used two different strategies to determine which ORFs may be responsible for the observed increase in conjugation efficiency, and hence splicing rescue. First, we expressed individual ORFs from a conjugative plasmid. Second, we knocked out expression of individual ORFs within the original Lib11 construct. From these strategies, ORF1 was determined to increase conjugation efficiency, but the effect was variable. Similarly, further studies revealed that Lib11-containing strains also displayed variable levels of conjugation. We thus performed a series of control conjugations and identified conditions in which the variability in conjugation efficiency is reduced. We can now identify which of the ORFs is responsible for the increase in conjugation efficiency. / Les introns de groupe II sont de grands ribozymes qui s'épissent des transcrits pré-ARNm par eux mêmes de façon autocatalytique. Ils sont présents chez les bactéries, les archaebactéries et dans les organelles des eucaryotes inférieures et des plantes terrestres. Les introns de groupe II contiennent toutes les composantes nécessaires pour leur épissage, par contre, des facteurs d'épissage protéique sont essentiels in vivo pour induire le repliement tridimesionnel approprié de ces ARNs intronique. Les introns de groupe II chez les procaryotes encodent leurs propres facteurs d'épissage appelé protéine encodé dans l'intron (IEP). En revanche, la majorité des introns de groupe II dans les plantes à fleurs n'encodent pas une IEP. Au lieu, ces introns de groupe II dépendent d'un groupe divers de protéines liant l'ARN pour jouer le rôle de facteurs d'épissage. Notre but est d'explorer la diversité potentielle des facteurs d'épissage d'intron de groupe II chez les bactéries. Nous étudions l'intron de groupe II modèle Ll.LtrB de la bactérie à Gram positif Lactococcus lactis. Ll.LtrB encode la PEI LtrA qui est essentielle pour son épissage efficace et précis. Ll.LtrB interrompt le gène codant pour l'enzyme relaxase (LtrB) requise pour initier le transfert d'éléments conjugatifs chez L. lactis. Étant donné que la ligature des exons du gène ltrB est requise pour la conjugaison, l'efficacité d'épissage de Ll.LtrB du pré-ARNm de ltrB contrôle l'efficacité de transfert des éléments conjugatifs. Nous avons pris avantage de ce lien pour développer un essai de conjugaison sensible pour étudier un mutant de Ll.LtrB qui manque LtrA (Ll.LtrBΔLtrA) et qui ne peut s'épisser. Une banque d'expression génomique a précédemment été générée dans un plasmide conjugatif. Un essai de conjugaison a été effectué et a mené à la sélection de trois plasmides contenant des fragments génomiques (Lib7,9,11) qui peuvent secourir l'efficacité de conjugaison en l'absence de LtrA.Lib11 encode cinq cadres de lecture ouverts potentiels (ORFs) et deux ORFs partiels. Nous avons utilisés deux stratégies différentes pour déterminer quels ORFs peuvent être responsables de l'augmentation de l'efficacité de conjugaison observé et donc de secourir l'épissage. Premièrement, nous avons aboli l'expression des ORFs individuellement à partir d'un plasmide conjugatif. Deuxièmement, nous avons aboli l'expression des ORFs individuellement dans la construction originale, Lib11. De ces deux stratégies nous avons déterminé qu'ORF1 augmente l'efficacité de conjugaison mais que l'effet est variable. De façon similaire, d'autres études ont révélé que les souches qui contiennent Lib11 démontrent aussi un niveau de conjugaison variable. Nous avons donc réalisé une série de conjugaisons contrôles et identifié des conditions ou la variabilité de l'efficacité de conjugaison est réduite. Nous pouvons maintenant identifier quels ORFs sont responsables pour l'augmentation de l'efficacité de conjugaison.

ABSTRACTSymbiotic alders are potential candidates for use in the remediation and revegetation of oil sands reclamation sites, and greenhouse inoculation has been shown to help ensure successful out-planting in the field. For successful nodule formation and growth, the time of inoculation (plant age) and N input are factors to be considered. In the present study, symbiosis was induced between Alnus crispa and Frankia strain AvcI1. Seedlings were grown, inoculated and exposed to different growing conditions that consisted of combining the presence or absence of Frankia, three different plant ages and five N treatments, to determine the best method for enhancing plant nodulation and growth. Results indicated that inoculation of 9-week-old seedlings with Frankia improved seedling growth, promoted nodule formation and ensured efficient N2 fixation. Fertilization with 100ppm of N was counterproductive for plant health, while the lower concentration of N, 10ppm, did not fulfill the N requirements of seedlings, suggesting the need to apply higher concentrations of N that do not surpass 100ppm. Greenhouse inoculated alders were subsequently used in a large-scale field trial to evaluate their ability to improve soil quality and metabolic activity of the indigenous microbial community in an oil sands reclamation site. In addition, the inoculated Frankia was monitored to determine if it remained present as part of the endophytic community in alder nodules. Results showed that inoculated alders were capable of very active growth, out performing non-inoculated plants, producing up to five-fold more biomass within the 3 growing season monitoring period. Alders also promoted the proliferation of heterotrophic and hydrocarbon degrading bacteria in the rhizosphere. Indigenous Frankia strains, that shared molecular similarities with the symbiont used in this study, were found in the nodules of non-inoculated alders, as well as in some of the soil samples indicating that a molecular detection approach requires further validation. / RÉSUMÉLes aulnes symbiotiques ont un excellent potentiel pour la restauration et la re-végétalisation des anciens sites d'exploitation des sables bitumineux, et la pré-inoculation en serre a été démontrée comme aidant à assurer le succès de la plantation sur le terrain. Pour une croissance et une formation optimale des nodules, plusieurs facteurs sont à considérer : le moment de l'inoculation (âge de la plante) et les sourcesd'N. Dans la présente étude, Alnus crispa a été inoculé avec la souche Frankia AvcI1. Les semis ont été exposés à différentes conditions incluant la présence ou l'absence de Frankia, trois moment d'inoculation et cinq traitements d'N, afin de déterminer la meilleure méthode pour induire la nodulation des plantes et optimiser la croissance. Les résultats ont indiqué que l'inoculation avec Frankia à 9 semaines d'âge a amélioréla croissance des semis, la formation de nodules et la fixation de N2. La fertilisation avec 100 ppm d'N a été nocive pour la santé des plantes, tandis que la fertilisation avec 10 ppm d'N n'a pas remplis les besoins en azote des semis, ce qui suggère la nécessité d'appliquer des concentrations plus élevées d'N ne dépassant toutefois pas 100 ppm.Les semis d'aulnes inoculés en serre ont ensuite été utilisés dans un essai à grande échelle sur le terrain afin d'évaluer leur capacité à améliorer la qualité des sols et l'activité métabolique de la communauté microbienne indigène sur un ancien site d'exploitation des sables bitumineux. En outre, la souche de Frankia inoculée a été surveillée pour déterminer si elle est restée présente parmis la communauté endophyte des nodules d'aulne. Les résultats ont démontrés que les aulnes inoculés étaient capable d'une croissance beaucoup plus active que lesplantes non inoculées, produisant jusqu'à cinq fois plus de biomasse au cours des trois saisons de croissance de l'essai sur le terrain. Les aulnes ont aussi favorisé la prolifération des bactéries hétérotrophes et des bactéries dégradant les hydrocarbures leur rhizosphère. Dessouches de Frankia indigènes qui partageaient des similitudes moléculaires avec le symbiote utilisée dans cette étude, ont été retrouvées dans les nodules des aulnes non inoculés, ainsi que dans certains des échantillons de sol indiquant qu'une approche de détection moléculaire nécessite une validation plus poussée.

The RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of viruses belonging to the Flaviviridae family, including the hepatitis C virus (HCV) and bovine viral diarrhea virus (BVDV) is critical for viral replication. The major goal of this PhD study was to biochemically characterize the role of the polymerase during initiation and elongation of RNA synthesis, utilizing the BVDV RdRp as a model system. We showed that the BVDV polymerase efficiently incorporates chain-terminating nucleoside analogues, which ultimately arrest RNA synthesis. The incorporated chain-terminators, however, can be removed from the primer terminus in the presence of pyrophosphate (PPi). These results suggest that the phosphorolytic excision of incorporated chain-terminators is a possible mechanism that can diminish the efficiency of this class of compounds against viral RdRps. The chain-terminators then served as valuable tools in subsequent experiments to analyze the functional role(s) of the RdRp-associated GTP-specific binding site (G-site) and the consequences of GTP binding during the initiation of RNA synthesis. The results provide biochemical evidence for the existence of a G-site in the BVDV enzyme, and suggest that GTP binding controls template positioning during de novo initiation. Finally, through the development of a novel ribonuclease-based footprinting assay, it was determined that catalytically active complexes contact the newly synthesized RNA during elongation of RNA synthesis with approximately 6-7 base pairs. The polymerase moves along the template according to the position where RNA synthesis is arrested. Taken together, this study provides novel insight into mechanisms involved during initiation and elongation of RNA replication of viruses belonging to the Flaviviridae family. The ability of RdRps to excise incorporated chain-terminators points to possible shortcomings of nucleoside analogue inhibitors that are under development as antiviral agents for the treatment of infection with HCV.

The growth of fungi on sugar rich wastes can be an economical way of producing citric acid. Nevertheless, conditions for the optimum production of citric acid still need to be established. Using Aspergillus niger, the objective of the present study was to measure the effect on citric acid accumulation and fungal biomass, of sugar and nitrogen supplementation namely as glucose and ammonium, respectively. An inert solid substrate (Hydroton® or HSS) made of expanded clay and wetted with a nutrient solution was used to grow A. niger ATCC12846 and measure its fungal biomass with fermentation time. Citric acid accumulation and fungal biomass were measured during 168 h of fermentation with glucose concentrations ranging 0 to 475 g (kg HSS)-1 and ammonium ranging from 2 to 16 g (kg HSS)-1. Fungal biomass growth was monitored by measuring the change of total volatile solids (TVS) less residual glucose and citric acid, and; organic nitrogen accumulation. Glucose and ammonium had a significant effect (P < 0.10) on both fungal biomass and citric acid accumulation. For citric acid, the highest concentration of 52 g and yield of 14% were obtained with 475 and 250 g glucose (kg HSS)-1 and 8 g of N (kg HSS)-1. Nevertheless, only the glucose concentration of 475 g (kg HSS)-1 resulted in citric acid accumulation continuing after reaching a peak in fungal biomass. This high glucose concentration could have yielded more citric acid by using a pH of 5.5 during spore germination and of 2.0 during fungal biomass growth. Because the C:N ratio of the fungal biomass was observed to vary with nitrogen supplementation, it is not recommended to use organic N to quantify fungal biomass. / La fermentation de champignons sur des résidus riches en sucre pourrait être une façon économique de produire de l'acide citrique, à condition de bien maîtriser les paramètres de fermentation. La présente étude avait comme objectif d'évaluer l'effet de la charge de sucre, soit en glucose, et d'azote, soit en ammonium, sur la biomasse du champignon Aspergillus niger ATCC12846 et sur sa production d'acide citrique. De l'argile expansée (Hydrotron® ou HSS) fut utilisée comme substrat solide pour le champignon A. niger ATCC 12846. Le substrat fut humecté d'une solution offrant différents taux de glucose, de 0 à 475 g (kg HSS)-1 et d'azote sous forme d'ammonium, de 2 à 16 g (kg HSS)-1. La biomasse fongique fut obtenue en mesurant la masse volatile totale moins la masse résiduelle de glucose et la masse d'acide citrique, et; l'augmentation de la masse d'azote organique. Le taux de glucose et d'ammonium a eu un effet significatif sur la biomasse fongique et la production d'acide citrique pendant les 168 h de fermentation. Une concentration en glucose de 475 et 250 g (kg HSS)-1 maximisaient la concentration de 52 g (kg HSS)-1 et le rendement de 14% en acide citrique, respectivement, avec 8g d'azote (kg HSS)-1. Par contre, seulement la concentration en glucose de 475 g (kg HSS)-1 permettait d'accumuler de l'acide citrique après avoir atteint le plus de biomasse. Un rendement supérieur exigerait un meilleur contrôle du pH à 5.5 pendant le développement des spores et à 2.0 pendant la fermentation. Puisque le ratio C:N de la biomasse fluctuait avec la concentration d'azote dans la solution, il n'est pas recommandé d'utiliser l'azote organique pour suivre l'évolution de la biomasse.

Inhibition of HIV-1 replication by insulin, albeit at supraphysiological concentrations (10$ sp{-7}$ M) has previously been shown. The fact that this effect could only be seen at such high concentrations indicated that insulin might be acting via the IGF-1 receptor, which it may bind at highly elevated concentrations, but with much less affinity. We now show that IGF-1 can effectively inhibit HIV-1 replication in chronically infected U937 cells at concentrations similar to normal physiological concentrations. We have demonstrated that this inhibitory effect may be abrogated by the presence of anti-alpha-IR3 and anti-IGF-1 antibodies, directed towards the IGF-1 receptor and the IGF-1 protein, respectively. With the use of HIV-LTR-CAT and pSV-tat plasmids in a COS-7 system, we demonstrate that the inhibitory effect of IGF-1 occurs at the level of transcription. Finally we also show in a human U38 target cell line stably transfected with HIV-LTR-CAT, that IGF-1 maintains its inhibitory effect, although to a lesser degree than that in the COS-7 system. Lastly, it is shown that TNF-$ alpha$ acts to augment transcription of the HIV-LTR and is able to over-shadow the inhibitory effects of IGF-1 on transcription. (Abstract shortened by UMI.)