Glioblastoma multiforme is the most lethal primary brain tumor with a mean patient survival of 12 - 15 months. Efforts to treat glioblastoma with chemotherapeutics or radiation therapy have been largely ineffective, which is why the current treatment paradigm is predominantly based on surgery. Herein, it has been shown that the extent of surgical resection is correlated with patient outcome, i.e. less residual cancer cells result in a prolonged time to recurrence. In glioblastoma patients, magnetic resonance imaging (MRI) is used in diagnosis, MRI-guided surgery, and monitoring of disease progression. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONPs) are currently receiving increased attention as MRI contrast agents for brain imaging. Their reported proton relaxation properties, biocompatibility, and retention times are superior to the commonly employed gadolinium-based contrast agents. In addition, their larger surface area allows for the conjugation of targeting moieties and/or labels used for multi-modal imaging (e.g. fluorophores, radioisotopes). One of the most frequent genetic alterations in primary glioblastoma involves the epidermal growth factor receptor (EGFR). EGFR over-expression due to gene amplification is observed in 50 - 71% of the patients and among these the simultaneous expression of EGFR mutants is frequently seen. The most common mutation is the deletion of exon 2 – 7 of the extracellular domain, which results in ligand-independent, constitutive activation of the intracellular kinase domain. This mutant is named EGFRvIII and has been intensely investigated as potential therapeutic target, since it is considered a tumor-specific antigen, The objective of this project is to develop EGFR-targeted IONPs to improve the delineation of tumor outlines through targeted delivery of this MRI contrast agent to tumor cells. In addition, dual-labeling of the nanoplatform with near infrared fluorescent probes is expected to permit intra-operative optical imaging of infiltrative tumor cells, thereby decreasing the number of residual cancer cells left after surgical resection. To date antibodies have been the most successful targeting ligands and several immunoconjugates are already approved for molecular imaging in humans. However, small overall size (<100 nm) of the nanoparticle is crucial for achieving extended blood circulation times and high tumor penetration. Therefore, the use of smaller antibody fragments instead of the entire immunoglobulin molecule is preferred. In this study, I characterized novel anti-EGFR single domain antibodies (sdAbs) for their application as targeting moieties for nanoparticulate contrast agents. I determined the specificity and binding kinetics of these sdAbs for their targets EGFR and EGFRvIII using surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis and cell-based assays. I then conjugated the sdAbs to the surface of commercial IONPs and, after thorough investigation of the physical properties, I tested the tumor-targeting ability of these immuno-IONPs in a glioblastoma xenograft model. My findings are in agreement with published observations on the in vivo distribution of targeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Modern SPR biosensors also allow the assessment of not only the binding affinity and kinetics, but also the thermodynamic parameters of protein-protein interactions. I therefore extended the use of this technology to study the interaction of a selected anti-EGFR sdAb with the extracellular domain of EGFR (EGFR-ECD), and compared this to binding of its natural ligand, the epidermal growth factor (EGF). I demonstrate that distinct thermodynamic driving forces govern sdAb and ligand binding to EGFR-ECD. My findings complement the available structural information and provide new insight into potential mechanisms of EGF-mediated receptor activation. / Le glioblastome multiforme est la tumeur primaire du cerveau la plus mortelle avec un taux de survie moyen des patients de 12 – 15 mois. Les efforts pour traiter le glioblastome avec de la radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques ont été largement inefficaces, ce qui explique pourquoi le paradigme de traitement actuel est avant tout basé sur la chirurgie. Ici, il a été démontré que l'étendue de la résection chirurgicale est corrélée avec le pronostic des patients. Chez les patients de glioblastome, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée dans le diagnostic, durant la chirurgie guidée par IRM, et pour le suivi de la progression de la maladie. Les nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (IONPs) reçoivent actuellement une attention accrue comme agents de contraste en IRM pour l'imagerie cérébrale. Leurs propriétés de relaxation des protons, leur biocompatibilité et leur temps de rétention sont supérieurs aux agents de contraste à base de gadolinium couramment employée. En outre, leur surface plus grande permet la conjugaison des agents de ciblage et/ou étiquettes utilisées pour l'imagerie multimodale. Une des altérations génétiques les plus fréquentes dans le glioblastome primaire implique le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), sa surexpression est observée dans 50 – 71% des patients et parmi ceux-ci l'expression simultanée de mutants EGFR est fréquemment observé. La mutation la plus fréquente est la délétion de l'exon 2 – 7 de domaine extracellulaire, ce qui rend le EGFR insensible au ligand, et mène à l'activation constitutive de la kinase intracellulaire. Ce mutant est connu sous le nom EGFRvIII. L'objectif de ce projet est de développer des IONPs spécifiques pour l'EGFR afin d'améliorer la délimitation des contours de la tumeur grâce à l'administration d'agents de contraste IRM ciblée vers les cellules tumorales. En outre, le double-étiquetage de cette nanoplateforme avec des sondes fluorescentes proche infrarouge permettra l'imagerie optique intraopératoire des cellules tumorales infiltrantes aidant à une résection chirurgicale plus précise et ainsi diminuant le nombre de cellules cancéreuses résiduelles après l'opération. La petite taille globale (<100 nm) de la nanoparticule permet d'atteindre une circulation sanguine prolongée et une pénétration tumorale élevée. Dans cette étude, j'ai caractérisé des fragments d'anticorps contre l'EGFR pour leur application comme unité de ciblage et pouvant potentiellement servir comme agents de contraste nanoparticulaire. J'ai déterminé par résonance plasmonique de surface (SPR) et dans des tests cellulaires la spécificité et la cinétique de liaison de ces anticorps à domaine unique pour leurs cibles EGFR ainsi que pour le mutant EGFRvIII. J'ai ensuite conjugué ces anticorps à domaine unique sur la surface de IONPs commerciales et, après analyse approfondie de leurs propriétés physiques, j'ai testé la capacité de ciblage tumoral de ces immuno-IONPs dans un modèle de xénogreffe de glioblastome. Mes conclusions sont en accord avec les observations publiées sur la distribution in vivo des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer ciblés. Les biocapteurs SPR modernes permettent également la détermination des paramètres thermodynamiques pour les interactions protéine-protéine. J'ai donc utilisé cette technologie pour étudier l'interaction d'un anticorps à domaine unique contre l'EGFR avec le domaine extracellulaire de l'EGFR (EGFR-ECD) en comparaison à la liaison avec son ligand naturel, le facteur de croissance épidermique (EGF). J'ai démontré que des forces motrices thermodynamiques distinctes conduisent l'interaction d'EGFR-ECD avec l'anticorps en comparaison d'avec le ligand. Mes conclusions sont en accord avec les informations structurelles disponibles et fournissent un nouvel éclairage sur les mécanismes potentiels de l'activation du récepteur par l'EGF.

Telomerase, the main mechanism for telomere maintenance, is active in 85% of cancer cells. Telomerase inhibition leads to telomere erosion, chromosome damage, and cell death, thereby validating the enzyme as a prime target in the search for anticancer therapies. hTERT genome analysis revealed the potential for complex splicing patterns that may reflect a specific aspect of telomerase regulation in proliferation, differentiation and apoptosis (Sykorova and Fajkus 2009).A number of alternatively-spliced TERT mRNAs in vertebrates and plants have been identified, yet their role in telomere maintenance and cell survival is poorly characterized. We have identified several novel mTERT variants and are pursuing characterization of two variants, one contains an in-frame insertion in the N-terminus (Ins-i1[1-102]), a region important for binding to the telomerase RNA and telomeric substrates, and the other a C-terminally located deletion (Del-e12[1-40] in the RT domain that generates a premature stop codon and encodes a protein lacking the C-terminus. In-vitro, the alternatively spliced mTERT variants display decreased telomerase activity, most likely due to their defect in template RNA and telomeric DNA binding affinities. For the deletion variant, this decrease in activity was consistent in telomerase positive cells, which, by middle passage, appeared to have a noticeable growth defect. By acquiring a detailed understanding of mouse TERT alternative splicing, we can advance our knowledge on telomerase regulation and new mechanisms for inhibiting telomerase in tumour cells. / La télomérase est le mécanisme principal de maintien des télomères et est actif dans 85% des cellules cancéreuses. L'inhibition de la télomérase entraîne l'érosion des télomères, des lésions chromosomiques et la mort cellulaire, ce qui démontre que cette enzyme pourrait être une cible importante dans la recherche de thérapies anticancéreuses. L'analyse du génome de la télomérase a révélé le potentiel des motifs d'épissage complexes qui peuvent démontrer un aspect spécifique de la régulation de l'enzyme dans la prolifération, la différenciation et l'apoptose (Sykorova and Fajkus 2009)Un certain nombre d'ARNm TERT alternativement-épissés ont été identifiées chez les vertébrés et les plantes, mais leurs rôles dans le maintien des télomères et la survie cellulaire sont mal caractérisés. Nous avons identifié plusieurs nouvelles variantes de TERT murine et, en parallèle, nous poursuivons la caractérisation de deux autres variantes. La première variante, Ins-i1[1-102], contient une insertion en cadre de lecture, dans le domaine N-terminal qui une région importante pour la l'attachement aux ARN de la télomérase et aux substrats d'ADN télomérique. La deuxième variante est une délétion localisée dans le domaine C-terminal. Celle-ci est plus spécifiquement située dans le domaine RT qui génère un codon stop prématuré et code pour une protéine manquant sa partie C-terminale, Del-e12 [1-40]. In-vitro, les activités télomériques des variantes mTERT sont diminuées, probablement dû à leur manque d'affinité pour l'ADN et l'ARN télomérique. Pour la variante Del-e12 [1-40], cette baisse d'activité a été confirmée dans des cellules télomérase-positives qui, après un certain nombre de passages, semblent développer des déficiences de croissance. La compréhension détaillée des mécanismes de l'épissage alternatif de la TERT murine pourrait contribuer à l'amélioration de nos connaissances sur les différentes méthodes de régulation de la télomérase. Ceci pourrait aussi aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes d'inhibition de la télomérase dans les cellules tumorales.

Following the discovery that the anti-neoplastic agent, Rapamycin, exerts its biological activity by inhibiting mTORC1 signaling, significant scientific investments have been made in order to understand the biology of mTORC1, particularly its contributions to tumorigenesis. Herein, I use genetic approaches to address the role of mTORC1 in oncogenesis.The mTORC1 kinase is negatively regulated by the Tsc1/Tsc2 tumor suppressor protein complex. To better understand the consequence of activated mTORC1 signaling in cancer, we genetically inactivated a single Tsc2 allele in the context of a c-Myc driven mouse model of human burkitt's lymphomas. We demonstrated the resulting Tsc2+/-E-myc mice developed rapid and aggressive drug resistant lymphomas. We uncovered that mTORC1 activation blocks apoptosis through translational upregulation of Mcl-1, a pro-survival factor, which plays a critical role in B-cell survival and lymphomagenesis. Extending our initial observations, we characterized a proteasomal independent mode of Mcl-1 degradation that aids in elimination of Mcl-1 following DNA damage. We found that constitutive mTORC1 signalling interferes with this process. Lastly, Mcl-1 is a major resistance factor to a promising novel cancer therapeutic, ABT-737, a Bcl-2 antagonist currently in clinical trials. Inhibiting translation resensitizes cells to ABT-737 by inhibiting Mcl-1. We designed and implemented a protein synthesis focused shRNA-based screen to identify novel genes that may serve as potential drug targets capable of reversing ABT-737 resistance and inducing cancer cell apoptosis. Herein I described the identification and characterization of shRNAs targeting Dhx9 which potently re-activate the apoptotic program in the presence of ABT-737. / Suite à la découverte que l'agent antinéoplasique, Rapamycin, exerce son activité biologique en bloquant la voie de signalisation mTORC1, des investissements scientifiques majeurs ont été réalisés afin de comprendre la biologie de mTORC1, en particulier, ses contributions à la genèse des tumeurs. Mes recherches portent sur l'étude du rôle de mTORC1 dans l'oncogénèse par l'utilisation de manipulations génétiques.L'activité de la kinase mTORC1 est contrôlée dans la cellule par un complexe de protéines nommé Tsc1/Tsc2 qui inhibe la croissance de tumeurs . Pour mieux comprendre l'importance de la signalisation de la forme active de mTORC1 dans le cancer, nous avons modifié le code génétique de du modèle murin de la forme humaine du lymphome de Burkitt nommé Eu-myc en inactivant seulement une allèle du gène Tsc2. Nous avons ensuite démontré que les souris produites qui portent cette mutation identifiées comme Tsc2+/-E-myc ont développé des tumeurs très rapidement. De plus, les tumeurs qui en résultent sont résistantes aux traitements de chimiothérapie. Nous avons également découvert que l'activation de mTORC1 bloque la mort cellulaire programmé ou apoptose en activant la synthèse protéique ou traduction de Mcl-1, un facteur de survie, qui joue un rôle critique dans la survie des cellules B et la production de lymphomes.Pour approfondir nos connaissances, nous avons identifié un mécanisme de dégradation de Mcl-1 (autre que celui dépendant du protéasome) suite à un dommage causé à l'ADN. Nous savons désormais que ce mode de dégradation alternatif est inhibé par l'activité constante de mTORC1. Finalement, nous avons déterminé que Mcl-1 est impliqué directement dans la résistance des cellules tumorales au renommé médicament ABT-737 (un antagoniste a Bcl-2) qui est présentement en étude clinique. L'inhibition générale du phénomène de traduction empêche la production de Mcl-1 et par le fait même permet donc de régénérer la sensibilité des cellules au ABT-737. Nous avons conçu et mis en place un criblage de protéine basé sur la technique d'interférence à ARN exprimés à partir de constructions en tige-boucle (shRNA). Cette technologie nous a permis d'identifier de nouveaux gènes pouvant servir de cibles potentielles aux médicaments capables de renverser la résistance à ABT-737 et d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses. Le document ci-joint décrit les méthodes utilisées pour identifier et caractériser des molécules shRNA qui ciblent le gène Dhx9, un gène qui pourrait être impliqué dans l'activation du processus d'apoptose en présence de ABT-737.

Prolactin (PRL) and its downstream pathway Jak2/Stat5a are required for mammary gland developement and as well as differentiation of mammary alveolar structures. However, its role in breast carcinoma is still not fully understood. Some recent data including the one generated from our laboratory indicates that PRL may have a suppressive effect on breast carcinogenesis. To further investigate this matter, we performed micro array analysis to examine the PRL target genes in the mouse mammary epithelial cell line (HC11). Based on microarray analysis, we identified the gene Anp32, a small nucleo/cytoplasmic acidic protein, as a downstream target gene involved in PRL signaling. We further confirmed these results using quantitative PCR and western blot analyses. In addition, I have examined the contribution of this protein in regulating PRL signaling leading to activation of the Jak2/Stat5a pathway. The results illustrated that upon PRL stimulation, Anp32a undergoes phosphorylation and translocates to the nucleus. Unexpectedly, I found that PRL stimulation led to Anp32/Stat5 complex formation in mammary epithelial cells. We further confirmed this interaction using co-localization immunofluorescence confocal microscopy studies. Furthermore, using GST fusion proteins of various domains of Anp32 in in vitro association studies we illustrated that Stat5a interaction with Anp32a requires domains which present within both the N and C terminus of Anp32a. In a parallel analysis, to begin to examine the role of Anp32a in breast cancer, we examined the level of Anp32a expression in breast cancer cell lines. Our preliminary results exhibit a reduced expression level of Anp32a in highly metastatic mouse breast cancer cell line 4T1compared to Hc11 mammary cells. / La prolactin(PRL) et sa voie de signalisation en aval Jak2/Stat5a sont requies à la croissance de la glande mammaire, ainsi qu'à la différentiation des épithéliales mammaires. Cependant, le rôle de la PRL dans le développement du cancer du sein n'est pas encore clair. Quelques preuves récentes, obtenues par notre laboratoire, montrent que la PRL pourrait supprimer certains aspects de la carcinogenèse du sein. Par consequent, nous avons effectué une analyse de puce à ADN pour examiner les genes cibles de la en utilisant les cellules épithéliales mammaires de souris HC11. Sur la base de l'analyse micro-array, nous avons identifié la protèin Anp32a, une petite nuclèo- protein cytoplasmique acid comme une gene cible impliqué en aval de la voie de signalization de la PRL. Nous avons davantage confirmé ces résultats en utilisant la Reaction de polymerization en chaine (PCR) et l'analyse d'immunobuvardage de type western. En plus, nous avons examiné la contribution de cette protéine dans la régulation de la voie de signalisation de la PRL conduisant à l'activation de la voie Jak2/Stat5a. Les résultats ont montré que Anp32a est transloquée au noyau et deviant phosphorylée par la stimulation de la PRL. En plus, la kinase JAK2 est nécessaire pour la phosphorylation sur les tyrosines de Anp32a.De façon inattendue, nous avons constaté que la stimulation de la PRL conduit à la formation d'un complexe entre les protéines Anp32a/Stat5 dans les cellules épithéliales mammaires. En plus, nous avons confirmé cette interaction en observant la co-localisation par des études d'immunofluorescence par microscopie confocale. En outre, à l'aide des protéines de fusion de GST représentant différentes domains de Anp32 en utilisant des études d'association in vitro, nous avons illustré le fait que Stat5a nécessite les domains qui sont pré sent en N et C terminal. En parallèle, nous avons examiné le niveau d'expression de Anp32a dans les plusieurs lignées cellulaire de cancer du sein. Nos resultats preliminaries, présente un niveau d'expression réduite de Anp32a en cellules cancéreuse mammaires 4T1(hautement métastatiques) par rapport à les cellules épithéliales mammaires HC11.

The polycomb group protein Bmi1 is an epigenetic regulator essential for the proliferation of many types of cancers. By impeding the expression of the tumor suppressor p53, Bmi1 is able to prevent apoptosis and senescence. c-Myc, a prominent oncogene, cooperates with Bmi1 to stimulate cellular transformation and tumorigenesis. Further investigation of the basic biological interplay between Bmi1 and c-Myc is crucial for our understanding of their tumorigenic ability. In my project I demonstrated that c-Myc and Bmi1 directly interact with each other and form nuclear foci. Overexpression of Max, a known partner of Myc, disrupts the Bmi1 and c-Myc interaction and prevents the formation of nuclear foci. Similar results were obtained with another member of the Myc family, L-Myc. Additionally, I found that HDAC3 interacts and co-localizes with Myc. HDAC3 also forms nuclear foci with Bmi1 and the addition of Max abrogates this interaction. In addition to the well-established role of Bmi1 as an epigenetic regulator, it has been recently shown that Bmi1 is part of an E3 ubiquitin-ligase complex, known as the Bmi1/RING1A or B complex. This complex controls the stability of many proteins. I showed that Bmi1 induces an L-Myc ubiquitination, which in turn causes the degradation of L-Myc. This data proposes a novel regulatory mechanism for the stability of the Myc oncogenes. The results of this thesis provide new insight into the basic biochemical interplay ofBmi1 with Myc and Max. / La protéine de groupe polycomb Bmi1 est essentielle pour la prolifération de nombreux types de cancers. En freinant l'expression du suppresseur de tumeur p53, Bmi1 est capable de prévenir l'apoptose et la sénescence. c-Myc, une autre oncogène, s'associe à Bmi1 pour stimuler la transformation et la tumorigenèse. Une enquête plus approfondie de l'interaction biologique fondamentale entre Bmi1 et c-Myc est crucial pour notre compréhension de leur capacité à promouvoir la tumorigène. Dans mon projet, j'ai démontré que c-Myc et Bmi1 interagissent directement et forment des foyers nucléaires. La surexpression de Max, un partenaire connu de Myc, perturbe l'interaction entre Bmi1 et c-Myc et empêche la formation de foyers nucléaires. Des résultats similaires ont été obtenus avec un autre membre de la famille Myc, L-Myc. En outre, j'ai constaté que HDAC3 interagi et se co-localise avec Myc. HDAC3 forme aussi des foyers nucléaires avec Bmi1 et l'ajout de Max abroge cette interaction. En plus du rôle bien établi de Bmi1 comme un régulateur épigénétique, il a été démontré récemment que Bmi1 fait partie d'une ubiquitine-ligase E3 complexe, connu sous le nom complexe Bmi1/RING1A ou B. Ce complexe contrôle la stabilité de nombreuses protéines. J'ai démontré que Bmi1 induit l'ubiquitination de L-Myc qui à son tour provoque la dégradation de celle-ci. Ces données proposent un nouveau mécanisme de règlementation pour la stabilité des oncogènes Myc. Les résultats de cette thèse fournissent un nouvel éclairage sur l'interaction biochimique de Bmi1 avec Myc et Max.

The Adenovirus type 5 E4orf4 protein (E4orf4) is a multifunctional protein that regulates viral transcription and splicing. Much of the activity of E4orf4 is thought to be mediated through binding of the Protein Phosphatase 2A (PP2A). E4orf4 recruits target phosphoproteins into complexes with PP2A resulting in dephosphorylation of host factors, such as SR splicing factors and the AP-1 transcription factor. However, the full complement of cellular factors that interact with E4orf4, and the molecular mechanisms that E4orf4 utilizes during replication to regulate gene expression remain poorly understood. In the following study, we utilized immunoprecipitation followed by mass spectrometry to identify novel interacting proteins with E4orf4. Interestingly, we identified a nucleoporin, Nup 205, a component of the nuclear pore complex as an interacting partner. We show that the Arginine Rich Motif (ARM) of E4orf4 is required for interaction with Nup 205 and for nuclear localization of E4orf4. ARMs are commonly found on many viral nuclear proteins. Interestingly, we observed that Nup 205 interacts with three different viral nuclear proteins containing ARMs. In each case, viral ARM proteins also bound to the same region on Nup 205. Point mutations of the ARM sequence on each of the three viral proteins resulted in loss of interaction with Nup 205 and loss of nuclear localization of the viral protein. Nup 205 may therefore represent a common cellular target for viruses encoding ARM containing proteins. We have further tested the role of E4orf4 and Nup 205 in adenovirus replication and gene expression. Previous studies have shown that compared to wild type adenovirus, E4orf4 deficient adenovirus (Orf4-) have elevated E1A and E4orf6 expressions and reduced late protein production. Such effects are phenotypically copied by the loss of Nup 205, where wild type adenovirus infecting H1299 cells with reduced level of Nup 205 also results in elevated E1A and E4orf6 and reduced late protein production. Furthermore, knockdown of Nup 205 resulted in reduced cytopathic effect and a more than four-fold reduction in the replication of wild type adenovirus. Taken together, these data suggest Nup 205 is required by adenovirus for proper regulation of gene expressions and viral replication, and that interaction with E4orf4 may mediate these effects. Since E4orf4 is known to deregulate phosphorylation of its target proteins, our future studies will focus on identifying phosphorylation sites on Nup 205 and determining the effect of E4orf4 on such sites and nucleopore structure and function. / La protéine multifonctionnelle E4orf4 de l'adénovirus de type 5 régule la transcription et l'épissage viral. L'activité de E4orf4 est assurée par son interaction avec la protéine phosphatase 2A (PP2A). Le complexe E4orf4/PP2A déphosphoryle certaines phosphoprotéines, comme le facteur d'épissage SR (riche en arginines et en sérines) et le facteur de transcription AP1. Cependant, les mécanismes de régulation d'expression génique pendant la réplication virale qui sont contrôlés par E4orf4 et ses partenaires restent inconnus. Au cours de cette étude, l'utilisation de la technique d'immunoprécipitation et de spectrométrie de masse nous a permis d'identifier des nouvelles protéines qui interagissent avec E4orf4, en particulier le composé du pore nucléaire Nup 205. Nous avons démontré que le motif riche en arginine (ARM – arginine rich motif), présent dans la protéine E4orf4 et autres protéines nucléaire virales, est nécessaire pour son interaction avec Nup 205 et la translocation nucléaire d' E4orf4. De plus, nous avons constaté qu'il y a trois autres protéines nucléaires virales qui interagissent avec la même région de Nup 205 via leur motif ARM. Des mutations ponctuelles du motif ARM sur ces trois protéines virales abolissent leur interaction avec Nup 205 et leur translocation nucléaire. Ceci suggère que Nup 205 est une cible commune pour les virus comportant des protéines ayant un motif ARM. Nous avons étudié ensuite le rôle de E4orf4 et Nup 205 dans l'expression génique et la réplication adénovirale. Précédemment, des travaux avaient démontré que, comparés aux adénovirus de type sauvage, les adénovirus privés de la protéine E4orf4 (Orf4-) expriment à des niveaux élevés les protéines virales E1A et E4orf6, mais présentent une faible production des protéines virales tardives. Nous avons observé que la suppression de Nup 205 donne le même effet que celui observé par la perte de E4orf4. Ainsi, l'infection des cellules H1299, présentant une faible expression de Nup 205, par des adénovirus de type sauvages, nous permet d'observer une augmentation du niveau d'expression de E1A et de E4orf6 et une diminution de la production des protéines virales tardives. De plus, la diminution de l'expression de Nup 205 réduit l'effet cytopathique et diminue de plus de quatre fois la réplication de l'adénovirus de type sauvage.En conclusion, nos résultats démontrent que l'interaction entre Nup 205 et E4orf4 favorise la réplication de l'adénovirus et l'expression des gènes viraux. Comme E4orf4 dérégule la phosphorylation de protéines cibles grâce à son interaction avec PP2A, nos prochaines études porteront sur l'identification des sites de phosphorylation potentiels sur Nup 205, ainsi que sur l'analyse de l'effet de E4orf4 sur chaque site. Nous sommes aussi intéressés par la fonction et la structure du pore nucléaire lorsqu'en complexe avec E4orf4.

Cancer cells have aberrant DNA methylation patterns which are characterized by hypomethylation of a large set of promoters and hypermethylation of tumor suppressor genes. The dynamic nature of the epigenome makes it a valuable target for therapeutic interventions. This thesis focuses on understanding the use of various inhibitors towards DNA methylation-related proteins and their respective anti-cancer activities at both global and gene-specific levels. The widely used demethylating agent 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) are FDA-approved drugs for the treatment of myelodysplastic syndrome. However, these nucleoside analogs which trap the DNA methyltransferases (DNMTs) are non-specific. Studies have shown that 5-azaCdR induced pro-metastatic genes and caused long distance metastasis. This raises serious safety concerns for their clinical use. On the contrary, targeting the DNMTs individually or in combination did not result in dramatic induction of pro-metastatic genes as with 5-azaCdR treatment. In particular, single DNMT1-specific inhibition resulted in maximum growth suppression when compared to inhibition of all three major DNMTs, while not increasing cell invasiveness. DNMT1 has been shown to be important for cancer growth. Our study supports the idea that DNMT1 has a major role in cancer over the other DNMTs and that DNMT1 inhibitors could be effective anti-cancer drugs. 5-azaCdR has nevertheless been proven to be a potent suppressor of cancer growth. We tested the idea of a combinatorial treatment that may minimize its side-effects on cell invasion while maintaining its growth suppressor effects. The methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) protein has been shown to demethylate pro-metastatic genes. Its inhibition in concurrent with 5-azaCdR treatment synergistically suppressed cancer growth, while reversed the 5-azaCdR-induced invasion. In order to have a deeper understanding of the impact of the treatments, microarrays studies on the methylome and transcriptome of the treated cells were carried out. Bioinformatics analysis indicated that the combined treatment suppressed gene networks that were involved in cell mobility, while synergistically enhanced gene networks that were involved in cell death. This data indicate that combining 5-azaCdR treatment with MBD2 inhibition results in more potent anti-cancer effects than either treatment alone. In order to explore the currently available drugs that inhibit MBD2, we tested the combination of S-adenosylmethionine (SAM) with 5-azaCdR on the same cancer cell lines. SAM remethylated gene promoters of pro-metastatic genes and repressed 5-azaCdR-induced invasion similarly to MBD2 inhibition. We then investigated the relationship between SAM and MBD2 downregulation and observed hypermethylation on both CpG and non-CpG sites in the MBD2 promoter upon SAM treatment. Interestingly, inhibition of MBD2 using short interference RNA also resulted in hypermethylation of its own promoter. This observation suggested that SAM treatment could directly downregulate MBD2 expression, which is further downregulated through a feedback loop. These results also suggested that SAM treatment could have a direct effect on MBD2 promoter, which in turn affects multiple MBD2 targets that are involved in invasion. Together, the data from this thesis support the idea that targeting the epigenome could be a highly efficacious anti-cancer therapy and that combining drugs that target DNA methylation could increase the potency over individual treatments. / Les cellules cancéreuses présentent un profil de méthylation caractérisé par l'hypométhylation d'un grand nombre de promoteurs et l'hyperméthylation de gènes suppresseurs de tumeur. La nature dynamique de l'épigénome en fait une cible de choix pour les interventions thérapeutiques. Cette thèse vise à comprendre l'utilisation de divers inhibiteurs visant des protéines liées à la méthylation de l'ADN et leurs activités anticancéreuses à une échelle génomique globale et au niveau de gènes particuliers. Les agents déméthylants 5-azacytidine et 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) sont des médicaments pour le traitement du syndrome myélodysplasiqueapprouvés par la FDA. Cependant, ces analogues de nucléosides qui piègent les DNA méthyltransférases (DNMTs) ne sont pas spécifiques. Des études ont montrées que la 5-azaCdR induisait l'expression de gènes pro-métastatiques et l'apparition de métastases. Ceci soulève de sérieuses interrogations quant à leur utilisation en clinique. À l'inverse, le ciblage spécifique des DNMTs ne conduit pas à une induction dramatique des gènes pro-métastatiques. Plus particulièrement, l'inhibition spécifique de DNMT1 résulte en une suppression de la croissance maximale des tumeurs, sans effet sur l'invasion cellulaire, lorsque l'on compare à l'inhibition des trois principales DNMTs. Notre étude supporte l'idée que DNMT1 à un rôle majeur dans le cancer et que le développement d'inhibiteurs de DNMT1 pourraient conduire à des médicaments anti-cancéreux efficaces.Il a néanmoins été montré que la 5-azaCdR était un suppresseur potentiel de la croissance cancéreuse. Nous avons testé l'hypothèse qu'un traitement combiné permettrait de minimiser ses effets secondaires sur l'invasion cellulaire tout en maintenant ses effets suppresseurs de croissance. Il a été montré que la protéine methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) participait à la déméthylationde gènes pro-métastatiques. Son inhibition simultanée à un traitement 5-azaCdR abolit de façon synergétique la croissance cancéreuse, tout en inhibant l'invasion induite par la 5-azaCdR. Des analyses du méthylome et du transcriptome ont été réalisées par micropuces à partir de cellules traitées avec un siRNA dirigé contre l'ARNm de MBD2 et la 5-azaCdR afin d'avoir une meilleure compréhension de l'impact de la combinaison des traitements. Les analyses bioinformatiques ont indiqué que le traitement combiné réprimait des réseaux de gènes impliqués dans la mobilité cellulaire tandis que les réseaux de gènes activés étaient impliqués dans la mort cellulaire. Ces données indiquent que le traitement à la 5-azaCdR combiné avec l'inhibition de MBD2 résulte en de plus puissants effets anti-cancéreux que l'un ou l'autre des traitements individuels.Nous avons également testé la combinaison de la S-adenosylmethionine (SAM), un médicament actuellement disponible sur le marché et inhibant l'activité de MBD2, avec la 5-azaCdR sur les lignées cellulaires utilisées précédemment. La SAM, de façon similaire à l'inhibition de MBD2 par un siRNA, permet la méthylation des promoteurs de gènes pro-métastatiques et réprime l'invasion induite par la 5-azaCdR. Nous avons ensuite examiné la relation entre la SAM, la diminution de l'expression de MBD2 et l'hyperméthylation observée à la fois aux sites CpG et non-CpG au niveau du promoteur de MBD2 après traitement avec la SAM. De façon intéressante, l'inhibition de MBD2 par des petits ARN interférant résulte également en une hyperméthylation de son propre promoteur. Cette observation suggère que le traitement avec SAM pourrait directement réduire l'expression de MBD2, qui serait réduite encore plus via une boucle de rétrocontrôle. L'ensemble des données de cette thèse supporte l'idée que le ciblage de l'épigénome pourrait être une thérapie anti-cancéreuse hautement efficace et que la combinaison de médicaments qui ciblent la méthylation de l'ADN pourrait augmenter l'efficacité des traitements individuels.

The Rab5 and Rab7 GTPases are key regulators of endosome to lysosome trafficking, whose activities are positively regulated by Rab Guanine nucleotide Exchange Factors and negatively regulated by GTPase Activating Proteins (GAP). In this thesis, the nematode Caenorhabditis elegans was used as a model system to study regulation of Rab GTPase-mediated endosomal trafficking, for simple genetics and easy visualization of organelles under Differential Interference Contrast (DIC) and confocal optics. It was previously demonstrated that TBC-2 functions as a RAB-5 GAP. Loss of tbc-2 activity results in the formation of enlarged late endosomes in the intestine that require the activities of RAB-5, RAB-7 and components of the homotypic fusion and vacuole protein sorting (HOPS) complex. TBC-2 colocalizes with RAB-7 on late endosomes, and requires RAB-7 for membrane localization. My hypothesis is that RAB-7 recruits TBC-2 to late endosomes to inactivate RAB-5 and possibly RAB-7 itself, to facilitate early to late endosome maturation. The vh8 mutant was previously identified in the lab as a suppressor of the tbc-2(-) phenotype and displaces GFP::RAB-7 from vesicular membranes. It is possible that vh8 encodes for a potential RAB-7 GEF. To investigate the molecular identity of vh8, I tested candidate genes by RNAi. While none of the candidates appear to be vh8, I did find that the HOPS core complex is required for the tbc-2(-) phenotype. ARL-8, and its human homolog arl8b, have recently been shown to be important for late endosome to lysosome trafficking. To investigate whether ARL-8 is required for TBC-2 mediated early to late endosome trafficking, I performed RNAi experiments. The results of which suggest that ARL-8 functions downstream of TBC-2. ARL-8 is required for the tbc-2(-) large late endosome phenotype, but is not required for membrane localization of either TBC-2 or RAB-7.In mammalian cells, the Rac1 GTPase is able to bind Armus, a human homolog of TBC-2. That raises the possibility that RAB-7 recruits CED-10/Rac1 via TBC-2. However, I observe that in tbc-2(tm2241) mutant animals, CED-10 is still localized to vesicles. It suggests that CED-10 might be recruited to membrane via other mechanism. Active CED-10 is also crucial for phagocytosis and clearance of apoptotic cell corpses. CED-10 can be activated by the CED-5/CED-12 complex, which is proposed to be recruited and activated by PI(3,5)P2. Work from this thesis suggests that the active state might not be a requirement for CED-10 localization, as ced-5 RNAi does not change the localization of CED-10. / Les GTPases Rab5 et Rab7 participent à la régulation du traffic des endosomes. L'activité de ces protéines est régulée positivement par les "Rab Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF) et régulée négativement par les "GTPase Activating Proteins" (GAP). Dans ce projet, le nematode Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour étudier la régulation du traffic endosomal médié par les Rab GTPase car celui-ci est un bon modèle génétique et permet une visualisation des organites à l'aide de microscopie à constraste d'interférence différentielle et de microscopie confocale. Il a été démontré dans la passé que TBC-2 fonctionne en tant que GAP pour RAB-5. La perte de l'activité de tbc-2 résulte en la formation d'endosomes tardifs élargis dans les intestins des nématodes, qui requièrent normalement l'activité de RAB-5, RAB-7 et des constituants du complexe "homotypic fusion and vacuole protein sorting" (HOPS). TBC-2 se retrouve avec RAB-7 sur les endosomes tardifs et nécessite RAB-7 pour sa localisation sur la membrane. Notre hypothèse était que RAB-7 recrute TBC-2 aux endosomes tardifs pour inactiver RAB-5 et possiblement RAB-7, ce qui facilite la maturation des endosomes en endosomes tardifs. 


Le mutant vh8 a préalablement été identifié dans le laboratoire en tant que suppresseur du phénotype tbc2(-) et cause le déplacement de GFP::RAB-7 des membranes vésiculaires. Il est possible que vh8 exprime un potentiel GEF de RAB-7. Pour trouver l'identité moléculaire de vh8, nous avons testé les gènes candidats à l'aide d'ARN d'interférence (ARNi). Malgré qu'aucun des candidats ne semblaient être vh8, nous avons découvert que le complexe central de HOPS est nécessaire au phénotype tbc-2(-). ARL-8 et son homolog humain arl8b ont récessement été démontrés comme étant importants dans le traffic des endosomess tardifis aux lysosomes. Pour vérifier si ARL-8 est requis dans le traffic des endosomes médiés par TBC-2. Nos travaux à l'aide d'ARNi suggèrent qu'ARL-8 fonctionne en aval de TBC-2. ARL-8 est nécessaire à l'apparition du phénotype tbc-2(-), mais n'est pas requis pour la localisation de TBC-2 et RAB-7 à la membrane. 


Dans les cellules de mammifères, la GTPase Rac1 peut se lier à Armus, un homologue humain de TBC-2. Ceci suggère que RAB-7 pourrait recruter CED-10/RAC1 par l'entremise de TBC-2. Par contre, nous observons que chez les nématodes tbc-2(tm2241), CED-10 est toujours localisé sur les vésicules. Ceci suggère que CED-10 pourrait être recruté à la membrane par d'autres mécanismes. Un CED-10 activé est aussi nécessaire à la phagocytose et à la dégradation des corps cellulaires apoptotiques. CED-10 peut être activé par le complexe CED-5/CED-12, qui est possiblement recruté et activé par PI(3,5)P2. Nos travaux suggèrent par contre que l'activation de CED-10 n'est pas obligatoire à sa localisation, car l'ARNi de ced-5 ne change pas la localisation de CED-10.

The packaging of eukaryotic genomes into chromatin poses a barrier to mRNA transcription by RNA polymerase II (RNAPII). Covalent modifications of histones, the major protein components of chromatin, are key mechanisms by which all eukaryotic organisms modulate chromatin structure to allow gene expression to occur. Enzymes which catalyze some of these modifications are currently under investigation as drug targets in a variety of human cancers. Thus, a fundamental understanding of how histone modifications are targeted to chromatin and how they impact transcription is of significant importance to the treatment of cancer. Mono-ubiquitination of histone H2B (H2Bub1) is universally associated with the elongation phase of RNAPII. Elongation control is critical for the proper regulation of mammalian genes. Accordingly, depletion of the H2B ubiquitination enzyme RNF20 in cell lines causes aberrant cell migration and a defective apoptotic response to DNA damage. Establishment of H2Bub1 on chromatin requires two highly conserved transcription elongation factors: the Polymerase Associated Factor (PAF) complex and Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). PAF is a five-subunit complex that interacts directly with RNAPII, and P-TEFb consists of the kinase Cdk9 in complex with cyclin T. While it is currently known that both P-TEFb activity and the PAF complex are needed to form H2Bub1 on chromatin, the precise mechanisms through which these factors regulate H2Bub1 and RNAPII elongation are not understood.Here I have characterized the P-TEFb-PAF-H2Bub1 regulatory axis in the model eukaryote Schizosaccharomyces pombe. Analyses of PAF mutant strains suggested multiple functional modules within the PAF complex, consisting of the Paf1 and Leo1 subunits, the Tpr1 (Ctr9 in humans) and Cdc73 subunits, and the Rtf1 subunit. Tandem affinity purification of PAF revealed that Rtf1 does not stably associate with the rest of the complex, confirming its functional independence. Although they are recruited as separate units, ChIP indicated that both Rtf1 and the remaining PAF subunits require Cdk9 activity for their association with chromatin. We further examined the role of Cdk9 activity in recruitment of Rtf1, a key regulator of transcription-associated histone modifications. Importantly, a phosphomimetic substitution to the Cdk9 phosphorylation site within the Spt5 CTD resulted in Cdk9-independent Rtf1 association, arguing that Spt5 phosphorylation may be sufficient for Rtf1 recruitment.In conclusion, my analyses uncovered a complex regulatory divide in both the function and recruitment of the PAF proteins, and suggest that P-TEFb-directed activity of PAF involves multiple P-TEFb targets dedicated to different aspects of PAF complex function in S. pombe. / Chez les eucaryotes, l'assemblage du génome en chromatine influence la transcription de l'ARN messager effectuée par l'ARN polymerase II (ARNpolII). Les modifications covalentes des histones, composantes protéiques principales de la chromatine, sont des mécanismes clés qui permettent à chaque organisme eucaryote de modifier la structure de la chromatine afin de permettre l'expression génétique. Les enzymes qui permettent certaines de ces modifications sont présentement évaluées pour être utilisées comme cibles dans une grande variété de cancers humains. Il est donc très important de comprendre ces modifications de la chromatine et leurs impacts sur la transcription pour ainsi traiter les cancers efficacement. L'ubiquitination de l'histone H2B (H2Bub1) est connue pour être associée à la phase d'élongation de l'ARNpolII dont le contrôle est critique pour la régulation génétique chez les mammifères. L'absence de l'enzyme RNF20 responsable de l'ubiquitination de H2B dans les cellules entraîne une migration cellulaire aberrante et une réponse apoptotique déficiente suite à un bris dans la structure de l'ADN. Deux facteurs de transcription hautement conservés sont requis lors de l'ubiquitination de H2B sur la chromatine soit le complexe du facteur associé à la polymérase (PAF) et le facteur d'élongation transcriptionnel positif b (P-TEFb). PAF est un complexe de cinq sous-unités qui interagit directement avec ARNpolII et P-TEFb est la kinase Cdk9 qui est liée à la cycline T. Actuellement, il est connu que le complexe PAF et l'activité de P-TEFb sont requis pour permettre la formation de H2Bub1 sur la chromatine par contre les mécanismes précis par lequels ces facteurs affectent la régulation H2Bub1 et l'élongation de l'ARNpolII demeurent méconnus.La présente étude a permis de caractériser la régulation P-TEFb-PAF-H2Bub1 dans le modèle eucaryotique Schizosaccharomyces pombe. L'analyse de différentes souches possédant des mutations du complexe PAF suggèrent la présence de fonctions spécifiques reliées aux différentes sous-unités soit Paf1 et Leo1, Tpr1 (Ctr9 chez l'être humain) et Cdc73, et finalement Rtf1. Nous avons démontré par la méthode de purification d'affinité en tandem (TAP) de PAF que Rtf1 ne s'associe pas de manière stable avec les autres sous-unités du complexe supportant ainsi l'idée de son indépendance fonctionnelle. Malgré le fait que les sous-unités sont recrutées de manière indépendante, l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) démontre que Rtf1 et les autres sous-unités nécessitent l'activité de Cdk9 pour permettre leur association à la chromatine. Nos recherches nous ont menées à étudier le rôle de l'activité de Cdk9 lié au recrutement de Rtf1 qui est un régulateur clé dans les modifications d'histones associées à la transcription. Une mutation phosphomimétique du site de phosphorylation de Cdk9 dans le domaine C-terminal (CTD) de Spt5 démontre que l'association de Rtf1 est indépendante de Cdk9, ce qui supporte l'hypothèse que la phosphorylation de Spt5 est suffisante pour recruter Rtf1.En conclusion, mes analyses ont permis de découvrir que la régulation du complexe est divisée selon la fonction et le recrutement des protéines PAF, et suggèrent que l'activité de P-TEFb implique diverses cibles qui affectent différents aspects de la fonction du complexe PAF chez S. pombe.

Extreme deviations from what is considered normal body weight, from anorexia to obesity, have been linked to reduced reproductive function in females. Discovered in 1994, leptin is a signaling hormone released from adipose tissue to mediate satiety effects in the hypothalamus. Leptin secretion is directly proportional to amount of body fat and evidence has accumulated that leptin and its receptor (Lepr) are found in a variety of tissues including granulosa cells (GCs) of the ovary. Thus, leptin through its receptor may play a role in reproductive function in females. Many studies have examined the effects of Lepr in GCs and the ovary, however the results are contradictory and all have been in vitro. Here we present the first in vivo study to examine the role of Lepr in GCs during follicular development and ovulation. Immature superovulated mice were used in all studies and GCs collected by follicle puncture. We first determined the expression profiles of Lepr isoforms (LeprA, LeprB) during follicular and luteal development along with leptin-related signaling molecules and targets. We also analyzed transcription factors potentially regulating Lepr expression in GCs. To examine the response of GCs to leptin in vivo, leptin hormone was administered at various times of follicular and luteal development. Lastly, we blocked Lepr action using a Lepr antagonist (SMLA) and determined its effects on ovulation. LeprA and LeprB were upregulated at 4h post- human chorionic gonadotropin (hCG) with LeprA being the most abundant isoform showing a 23-fold increase from 0 to 4h post-hCG. Leptin was upregulated at the same time and Lepr signaling molecules: signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3), and suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3), were upregulated just after Lepr induction at 7 and 12h post-hCG, respectively. CCAAT/enhancer-binding protein beta (Cebpb), which was induced at 1h post-hCG, was shown to associate with the Lepr promoter and thus regulate Lepr expression. Early growth response protein 1 (Egr1) protein and mRNA data revealed it to be another potential regulatory transcription factor with upregulation at 1h post-hCG, just prior to Lepr upregulation. Thus, the mRNA profiles of genes examined provide evidence of a role for Lepr during the periovulatory period. This was further confirmed as the in vivo response of GCs to a physiological dose of leptin was enhanced at 6h post-hCG evidenced by phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (Mapk) and Stat3 proteins; however showed no change during the early follicular or luteal periods. Leptin treatment also increased expression of ovulation genes: a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (Adamts1), programmed cell death 1 (Pdcd1), and Egr1. Antagonizing Lepr action reduced ovulation rate by 60% in SMLA-treated animals. This reduction appeared, at least in part, to be due to deregulated gene expression of Adamts10, Adamts19, Hyaluronan synthase 2 (Has2), amphiregulin (Areg), Pentraxin-related protein (Ptx3), and Forkhead box protein O1 (Foxo1). Overall, the results of this study provide molecular mechanisms for Lepr induction and signaling in GCs. In addition, it provides evidence that leptin and Lepr play a positive role during ovulation and are thus essential for optimal female fertility. / Les écarts extrêmes de poids par rapport à ce qui est considéré comme un poids normal, telles que l'anorexie et l'obésité, sont liées à des problèmes de la fonction reproductrice chez la femme. Découverte en 1994, la leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux dans le but d'informer l'hypothalamus sur l'état de satiété de l'organisme. La libération de leptine est directement proportionnelle à la quantité de tissu adipeux et la présence de l'hormone et de son récepteur (Lepr) a été montrée dans différents tissus incluant les cellules de la granulosa des ovaires. Par conséquent, la leptine, via son récepteur, joue un rôle dans la fonction reproductrice de la femme. De nombreuses études ont étudié les effets de Lepr dans les cellules de la granulosa et dans l'ovaire, mais elles ont toutes été réalisées in vitro et les résultats sont contradictoires. Nous présentons ici la première étude in vivo dans le but d'examiner le rôle de Lepr dans les cellules de la granulosa pendant le développement folliculaire et l'ovulation. Des souris immature produisant un grand nombre d'ovocytes ont été utilisées dans toutes nos expériences et les cellules de la granulosa ont été collectées par ponction folliculaire. Les profils d'expression des isoformes de Lepr (LeprA et LeprB) durant les développements folliculaire et lutéal ont été d'abord déterminés, ainsi que ceux des molécules de la voie de signalisation de la leptine et leurs cibles. Les facteurs de transcription régulant potentiellement l'expression de Lepr dans les cellules de la granulosa ont aussi été analysés. Pour évaluer la réponse des cellules de la granulosa à la leptine in vivo, l'hormone leptine a été administrée à différents moments des développements folliculaire et lutéal. Enfin, le récepteur Lepr a été bloqué grâce à l'utilisation d'un antagoniste de Lepr (SMLA) et les effets de ce blocage sur l'ovulation ont été analysés. L'expression de LeprA et LeprB ont augmenté 4h après administration d'hCG, LeprA étant l'isoforme la plus abondante et présentant une expression 23 fois plus importante de 0 à 4h post-hCG. L'expression de la leptine a augmenté durant le même temps ainsi que celle des molécules de la voie de signalisation de Lepr, Stat3 et Socs3, juste après l'induction de Lepr, respectivement 7h et 12h post-hCG. Cebpb, qui a été induit 1h post-hCG, a été identifié comme étant associé au promoteur de Lepr et donc comme étant un régulateur de l'expression de Lepr. Les données concernant la protéine Egr1 et ses ARNm suggèrent qu'il peut s'agir d'un autre potentiel facteur de transcription régulant l'expression de Lepr, notamment en raison d'une augmentation de son expression 1h post-hCG, juste avant l'augmentation de l'expression de Lepr. Les profils d'ARNm des gènes examinés ont donc fourni la preuve du rôle de Lepr durant la période périovulatoire. Ceci a été ensuite confirmé par l'augmentation de la réponse des cellules de la granulosa in vivo suite à une dose physiologique de leptine 6h post-hCG , mise en évidence par la phosphorylation des protéines Mapk et Stat3. Le traitement avec la leptine a aussi accru l'expression des gènes impliqués dans l'ovulation Adamts1, Pdcd1 et Egr1. Le blocage de l'action de Lepr a réduit le taux d'ovulation de 60% chez les animaux traités avec SMLA. Cette réduction apparaît être due, au moins en partie, à la dérégulation de l'expression des gènes de Adamts10, Adamts19, Has2, Areg, Ptx3, et Foxo1. En conclusion, les résultats de cette étude éclairent les mécanismes moléculaires de l'induction du récepteur Lepr ainsi que de la voie de signalisation qui lui est associée dans les cellules de la granulosa. Pour finir, cette étude fournit des preuves concernant le rôle positif joué par la leptine et Lepr durant l'ovulation, ce qui est essentiel pour optimiser la fertilité de la femme.