Wnts are secreted extracellular signaling molecules that act locally to control diverse developmental processes such as cell fate specification, cell proliferation, and cell differentiation. Three WNT signaling pathways have been identified. The best characterized is the canonical or WNT/β-catenin signaling pathway. Recently, the WNT signaling pathway has been implicated in ovarian development and differentiation. However, little is known about the expression or role of β-catenin/Tcf-signaling activity within ovarian compartments. In order to aid in the ongoing pursuit of elucidating the mechanisms that govern ovarian differentiation and development, I explored the possible roles of the canonical WNT signaling pathway in the development of the ovarian surface epithelium (OSE) and follicular ovulatory capability. To examine canonical Wnt-signaling within the ovary, I utilized the Tcf-lacZ-reporter mice. In Manuscript I, I present a detailed spatio-temporal pattern of β-catenin/Tcf mediated expression in the OSE throughout development. Cells covering the indifferent gonad at E11.5 were β-catenin/Tcf signaling (lacZ-positive). With further development and sexual differentiation, lacZ staining was lost over the testis but maintained on embryonic ovaries. This staining became dispersed and the proportion of lacZ-positive OSE cells decreased to relative constancy when female mice reached maturity. FACS analyses revealed the lacZ-positive cell population exhibits cytoprotective mechanisms as indicated by enrichment within a side population. The results indicate that the mouse OSE is heterogeneous and may contain a population of progenitor cells. In Manuscript II, I investigated the molecular connection between β-catenin and Tcf-mediated lacZ activity and assessed whether β-catenin stabilization regulates β-catenin/Tcf-mediated gene expression and OSE proliferation. β-catenin was detected on the lateral membranes of ovarian epithelium. I demonstrated that treatment of OSE cells with Wnt agonist stabilized β-catenin but failed to induce β-catenin/Tcf-lacZ expression. Furthermore, E-cadherin expression was down-regulated and the proliferative potency of OSE cells increased. Of four ovarian cancers cell lines screened, only the HEY cell line demonstrated induction of luciferase reporter expression upon canonical WNT stimulation. These studies indicate that nuclear localization of β-catenin is insufficient for β-catenin/Tcf mediated gene expression in OSE cells, suggesting GSK-3β inhibition as a result of altered WNT signaling is of major importance in the control of epithelial-mesenchymal transition and cell proliferation leading to tumorigenesis. In Manuscript III, I investigated the role of the canonical WNT signaling pathway in the development of follicular ovulatory capability. Oocytes in primordial and primary follicles did not show active WNT signaling. β-catenin/Tcf-signaling was activated at the secondary follicle stage and the proportion of β-catenin/Tcf-signaling (lacZ-positive) follicles increased with follicular maturation. In contrast, the majority (>90%) of oocytes recovered from the oviducts at estrus and following hormone stimulation were lacZ-negative. The results indicate that the canonical WNT signaling pathway is active in growing oocytes and suggest that canonical WNT signaling may be involved in the development of follicular ovulatory capability and identifies non-ovulatory follicles. / Les Wnts sont des molécules de signalisation sécrétées dans l'espace extracellulaire pour réagir localement et contrôler divers processus du développement comme la spécification, la prolifération et la différenciation des cellules. Trois voies de signalisation WNTS ont été identifiées. La plus connue est la voie canonique appelée aussi la voie WNT/β-catenin. Récemment des études ont montré que la voie de signalisation WNT serait impliquée dans le développement et la différenciation ovarienne. Malgré ces études, peu est connu sur l'expression et la fonction de l'activité β-catenin/Tcf dans les différents compartiments d'ovaire. Pour clarifier les mécanismes moléculaires responsables dans le développement d'ovaire, j'ai étudié le rôle de la signalisation WNT/β-catenin durant la formation d'épithélium superficiel ovarien et dans la capacité ovulatoire des follicules. Pour visualiser l'implication de la voie canonique dans l'activation ovarienne, nous avons utilisé des souris transgéniques qui expriment la protéine β-galactosidase (lacZ) en réponse des protéines β-catenin/Tcf.Le premier article que je présente (Manuscrit I) décrit l'activation spatiotemporal de β-catenin/Tcf dans l'épithélium superficiel ovarien au cours du développement de la souris. Au jour E11.5, la gonade non-différenciée est marquée positivement pour LacZ indiquant que β-catenin/Tcf est activée. Au cours de la différenciation sexuelle de la souris, l'expression de LacZ disparait dans les testicules. Par contre, dans l'ovaire embryonnaire l'expression de LacZ est maintenue. À la maturation sexuelle de la souris femelle, l'expression de LacZ est devenue plus diffuse et la quantité de cellules qui expriment LacZ a diminué. Une analyse de cytométrie en flux a indiqué que la population de cellules positive pour LacZ démontre des mécanismes cytoprotecteurs. En conclusion, les résultats suggèrent que l'épithélium superficiel ovarien est constitué d'une population de cellules hétérogène et mais aussi de cellules progénitrices. Le deuxième article que je présente (Manuscrit II) étudie la stabilisation de β-catenin, les gènes induit par le complexe de β-catenin/Tcf et la prolifération d'épithélium superficiel ovarien. β-catenin est localisée dans les membranes latérales d'épithélium ovarien. J'ai démontré que la stimulation des cellules d'épithélium superficiel ovarien avec une agoniste Wnt stabilise β-catenin mais n'induit pas l'expression de lacZ dans les souris transgéniques. En plus, le niveau d'expression du gène E-cadherin a baissé et la prolifération des cellules d'épithélium superficiel ovarien a augmenté. Des quatre lignées cellulaires de cellules ovariennes cancéreuses qu'on a examinées, seulement la lignée HEY avait une réponse transcriptionelle à la stimulation de protéines WNT canoniques. Nos études révèlent que la localisation nucléaire de β-catenin n'est pas suffisante pour induire l'expression de ces gènes cibles dans l'épithélium superficiel ovarien. Dans les cellules cancereuses la voie de signalisation WNT est altèrée de sorte que l'inhibition de GSK-3β est augmentée et β-catenin est activée ce que contrôle la prolifération et la transition d'éptihelium à mésenchyme durant la tumorigenèse.Le troisième article que je présente (Manuscrit III) examine le rôle de la voie canonique durant le développement folliculaire. Les ovocytes des follicules primordiaux et primaires ne montraient aucune activation de la signalisation WNT. L'activation de β-catenin/Tcf était présente dans les follicules secondaires et la proportion de follicules positifs pour l'expression de lacZ a augmenté durant la maturation des follicules. Au contraire, la majorité (>90%) d'ovocytes retrouvés dans les oviductes durant l'oestrus et aprés un traitement hormonal n'exprimait pas le gène lacZ. Nos résultats indiquent que la voie de signalisation canonique de WNT est activée durant la croissance des ovocytes et peut identifier les follicules non-ovulatoires.

Trypanosomatid pathogens cause devastating diseases in humans and animals and continue to pose a major challenge in the drug development. Mitochondrial gene expression in trypanosomatid pathogens requires extensive post transcriptional modification, known as RNA editing which generates translatable transcripts for essential components of parasite respiratory complex. RNA editing is catalyzed by a multiprotein complex called editosome. Most of the editosome proteins are essential for parasite survival, thereby making editosome a suitable target for drug discovery. However, how editosome proteins are assembled and perform RNA editing is not fully understood. We hypothesized that identification of novel compounds targeting and perturbing this unique process will not only help to determine the function and assembly of the editosome proteins but may also be used as compounds against all three major trypanosomatid pathogens. In the first part of the thesis, I present developing and testing of a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based high throughput screening assay for identification of compounds that inhibit editosome function. Furthermore, we use our assay to confirm inhibiting effect of known inhibitors of an essential editosome protein, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Using our assay, we also show that these inhibitors are able to inhibit RNA editing in the context of partially purified editosome.The second part of thesis describes a pilot screen of a small set of compounds that were identified via virtual screening of a chemical library against TbREL1. Using secondary biochemical assays we confirmed the specificity of inhibition and showed that these compounds find other targets in addition to the intended TbREL1 target. We showed for the first time that the inhibitory compounds interfere with the interaction of editosome with substrate RNA and consequently lead to the loss of all activities associated with the functional editosome. Moreover, we show that this inhibition is able to interfere with the assembly of the editosome proteins and propose a model to describe possible mode of inhibition by these compounds. In the third part of thesis, I present a study that compares the mechanism of action of inhibitory compounds in the context of recombinant versus native TbREL1 in the editosome. We show that these compounds interfere with RNA substrate binding activities of the editosome accessory factors MRP1&MRP2 (mitochondrial RNA binding proteins 1&2) which result in perturbing other editing activities. We show that these compounds can only inhibit TbREL1 function when the accessory factors are not present. Furthermore, we performed alanine mutagenesis of the amino acid residues of TbREL1 that are predicted to bind inhibitors. We provide a detailed map of the structure of enzyme-inhibitor complex with an opportunity for future design of more potent inhibitors of TbREL1. These studies have led to identification and characterization of novel inhibitors that result in inactivation of editosome function. Moreover, elucidation of the mechanism of RNA editing inhibition provides a basis for future selection of more efficient and potent inhibitors against the editosome proteins. Therefore, this work contributes to both the functional studies of an essential gene expression mechanism and to an exciting possibility for future drug development against three related trypanosomatid pathogens. / Pathogènes des trypanosomatides sont responsable de maladies dévastatrices chez les humains et les animaux et continuent de poser un défi majeur dans le développement de médicaments. L'expression du gène mitochondrial chez les agents pathogènes de la famille des trypanosomatides nécessite une modification post transcriptionnelle vaste, connue sous le nom d'édition de l'ARN, qui génère des transcrits traduisibles pour les composants essentiels du complexe respiratoire du parasite. L'édition de l'ARN est catalysée par un complexe multiprotéique appelé éditosome, dont la plupart des protéines sont essentiels pour la survie du parasite, ce qui fait de l'éditosome une cible appropriée pour la découverte de médicaments. Cependant, la façon dont les protéines de l'éditosome sont assemblés et effectue l'édition de l'ARN n'est pas entièrement comprise. Nous émettons l'hypothèse que l'identification de nouveaux composés ciblant et perturbant ce processus unique permettra non seulement de déterminer la fonction et l'assemblage des protéines de l'éditosome mais également d'être utilisé en tant que composés contre les trois principaux pathogènes de la famille des trypanosomatides. Dans la première partie de la thèse, je présente l'élaboration et l'essai basé sur la fluorescence avec un criblage à haut débit pour l'identification de composés qui inhibent la fonction de l'éditosome. En outre, nous avons utilisé notre test pour confirmer l'effet inhibiteur des inhibiteurs connus d'une protéine essentielle de l'éditosome, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Grâce à notre test, nous avons montré également que ces inhibiteurs sont capables d'inhiber la fonction d'édition de l'ARN dans le contexte de l'éditosome partiellement purifié. La deuxième partie de la thèse décrit un essai pilote d'un petit ensemble de composés qui ont été identifiés par criblage virtuel contre TbREL1. En utilisant des tests secondaires, nous avons confirmé la spécificité de l'inhibition et montré que ces composés ont trouvé d'autres cibles en plus de celle de TbREL1. Nous avons montré pour la première fois que les composés inhibiteurs interférent avec l'interaction de l'éditosome à l'ARN substrat et par conséquent entraîne la perte de toutes les activités liées à la fonction de l'éditosome. De plus, nous avons montré que cette inhibition est capable d'interférer avec l'assemblage des protéines de l'éditosome et avons proposé un modèle pour décrire le mécanisme possible d'inhibition par ces composés. Dans la troisième partie de la thèse, je présente une étude qui compare le mécanisme d'action des composés inhibiteurs dans le contexte de TbREL1 recombinant ou natif dans l'éditosome. Nous avons montré que ces composés interfèrent avec les activités de liaison à l'ARN des facteurs accessoires de l'éditosome MRP1 et MRP2 (protéines liant les ARN mitochondriaux 1 & 2) qui aboutissent à la perturbation d'autres activités d'édition. Nous avons montré que ces composés peuvent seulement inhiber la fonction de TbREL1 en l'absence des facteurs accessoires. En outre, nous avons effectué une mutagenèse d'alanine des résidus d'acides aminés de TbREL1 qui sont prévus dans la liaison aux inhibiteurs. Nous fournissons une carte détaillée de la structure du complexe enzyme-inhibiteur avec une opportunité de conception future de plus puissants inhibiteurs de TbREL1. Ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de nouveaux inhibiteurs qui se traduisent par l'inactivation de la fonction de l'éditosome. En outre, l'élucidation du mécanisme d'inhibition de l'édition de l'ARN fournit une base pour la sélection future d'inhibiteurs plus efficaces et plus puissants contre les protéines de l'éditosome. Par conséquent, ce travail contribue à la fois aux études fonctionnelles d'un mécanisme d'expression d'un gène essentiel et à une possibilité passionnante pour le développement de futur médicament contre trois agents pathogènes liés de la famille des trypanosomatides.

Cancer is a leading cause of death worldwide and accounts for about one fifth of all death in the Western world. In 2008, nearly 12.7 million new cancer cases and 7.6 million cancer deaths occurred worldwide. The development of cancer is a multistage process, during which cells acquire a series of mutations that eventually lead to unrestrained cell growth, evasion of cell death, angiogenesis, invasion of the surrounding tissue and finally spreading to other parts of the body. The mammalian proprotein convertases (PCs) constitute a family of nine secretory serine proteases that are related to bacterial subtilisin and yeast kexin. They have been associated with cancer since the early 1990s. By processing cancer-associated factors, PCs are believed to play key roles in almost every step of cancer development. Seven of these PCs (PC1, PC2, furin, PC4, PC5/6, PACE4 and PC7) activate, or less frequently inactivate, a wide variety of substrates, including hormones, growth factors, receptors, adhesion molecules, angiogenic factors, metalloproteases. Among these substrates, some of them are key factors controlling cancer progression and metastasis. The last member of this family proprotein convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9) only cleaves itself and participates in maintaining the levels of cholesterol, which was shown to have impacts on cancer incidence.In this thesis, I focused on the role of two PCs, PC5/6 and PCSK9, in cancer development. I first showed that PC5/6 is systematically down-regulated in human and mice intestinal tumors. In ApcMin/+ mice which are a colonic cancer model and develop numerous adenocarcinomas along the intestinal tract, the specific knockout of PC5/6 in the intestine and colon leads to higher number of tumors, particularly in duodenum. This suggests that PC5/6 plays a protective role against tumorigenesis in the intestine. Although PC5/6 is protective in intestinal cancer, it has been shown to promote tumor progression in other cancer types e.g., brain and skin. Interestingly, PC5/6 is inhibited by some natural inhibitors, the latent TGFbeta binding proteins 2 and 3 (LTBP-2, -3). These two proteins reduce the enzymatic activity of PC5/6A and reduce the bio-availability of PC5/6A by sequestering the zymogen proPC5/6 in the extracellular matrix. Finally, I demonstrated that the lack of PCSK9 leads to a significantly lower level of liver metastasis of melanoma cells. This cancer protective effect is due to low plasma cholesterol levels as well as high apoptosis in liver stroma and metastasized tumors that are associated with PCSK9 deficiency.In summary, the present cumulative data define some of the in vivo roles of PC5/6 and PCSK9 in cancer and should enhance our appreciation of the physiological impact of PC inhibition. / Le cancer est à l'origine d'environ 20% des décès dans le monde occidental. En 2008, près de 12,7 millions de nouveaux cas et 7,6 millions de décès sont survenus dans le monde. Le développement du cancer est un processus multi-étapes, au cours duquel les cellules acquièrent des mutations qui mènent à une croissance cellulaire incontrôlée, l'échappement à la mort cellulaire, l'angiogenèse, l'invasion des tissus environnants et, finalement, la propagation des tumeurs à d'autres parties du corps. Les proprotéines convertases (PC) constituent une famille de neuf sérine-protéases sécrétoires similaires à la subtilisine bactérienne et à la kexine de levure. Dès le début des années 1990, il a été montré que les PC contrôlent l'activation de facteurs clés dans presque toutes les étapes du développent du cancer. Les sept premiers membres de la famille des PC (PC1, PC2, furin, PC4, PC5/6, PACE4 et PC7) activent, et moins fréquemment inactivent, des hormones, des facteurs de croissance, des récepteurs, des molécules d'adhésion, des facteurs angiogéniques, ou encore des métalloproteases, qui peuvent être impliqués dans la progression du cancer. Le dernier membre de cette famille, la proprotéine convertase de type subtilisine/kexin 9 (PCSK9), participe au maintien de l'homéostasie du cholestérol. Ce dernier a été lié à la fois positivement et négativement au dévelopement de cancers.Au cours de mon travail de thèse, je me suis concentrée sur le rôle de deux PC, PC5/6 et PCSK9, dans le développement du cancer. J'ai d'abord montré que l'expression de PC5/6 est systématiquement diminuée dans les tumeurs intestinales chez l'homme et chez la souris. Chez les souris ApcMin/+, modèle du cancer du côlon, qui développent de nombreux adénocarcinomes le long de l'intestin, l'absence de PC5/6 spécifiquement dans l'intestin et le côlon conduit à un plus grand nombre de tumeurs, en particulier dans le duodénum. Ceci suggère que PC5/6 ait un rôle protecteur contre la tumorigenèse dans l'intestin. Cependant, PC5/6 a été montré favoriser la progression de tumeurs dans d'autres types de cancers, par exemple le cancer du cerveau et de la peau. J'ai ensuite mis en évidence l'existence de deux inhibiteurs naturels de PC5/6 : les «latent TGFbeta binding proteins -2 et -3» (LTBP-2 et -3). Ils réduient l'activité enzymatique de PC5/6A ainsi que sa disponibilité en séquestrant le zymogène dans la matrice extracellulaire. Enfin, j'ai également démontré qu'une déficience en PCSK9 conduit à plus de métastases hépatiques, induites par injection de cellules mélanocytaires. Cet effet protecteur est dû aux faibles taux de cholestérol associé à la perte de PCSK9 et à une mort cellulaire programmée accrue dans le foie injecté ainsi que dans les métastases chez les souris n'exprimant pas PCSK9.En résumé, ces travaux définissent le rôle des PC5/6 et PCSK9 dans le cancer in vivo et nous aident à évaluer l'impact physiologique potentiel de l'inhibition des PC.

Female reproduction is limited by the oocyte pool, which establishes soon after birth in the mouse. It is dogma that more than half of the initial oocyte population is eliminated during the first meiotic prophase progression in fetal life. Apoptosis has been proposed as a mechanism for this oocyte loss; however, its pathway remains to be clarified. The mitochondrial apoptotic pathway is mediated by initiator caspase 9, which in turn activates effector caspase 3, 6, or 7 leading to cell death. The purpose of my study is to investigate the role of caspase 9 in the loss of oocytes during meiotic prophase progression. We first examined the activation of various caspases by immunofluorescence (IF) staining of cleaved caspases in ovarian sections. The results showed that both caspase 9 and 7 were constitutively activated in oocytes in the meiotic prophase. We then examined Casp9 deficient mice. Casp9 +/- mutants were crossed and ovaries were isolated from female progeny at 16.5-19.5 days postcoitum (dpc). The ratio of Casp9 -/- females drastically decreased during this period, confirming the perinatal lethality of caspase 9 deficiency. The total number of germ cells, identified by IF staining of GCNA1, in dissociated cells of Casp -/- ovaries were comparable to those in control ovaries at 16.5 dpc but became twice as large than those in +/+ or +/- ovaries at 19.5 dpc. Meiotic prophase progression, assessed by IF staining of synaptonemal complex components, was similar in all genotypes. IF staining of GCNA1 and γH2AX, a marker of double strand breaks, showed that the excessive numbers of oocytes were accumulated at the end of meiotic prophase in the Casp -/- ovary. Our results suggest that caspase 9 plays an essential role leading to oocyte loss and a block of caspase 9 dependent apoptotic pathway allows for a greater number of oocytes to survive and progress through the meiotic prophase / La reproduction chez les femelles est limitée par le pool d'ovocytes qui est établi peu après la naissance chez la souris. Il est considéré comme un dogme que la moitié de la population initiale d'ovocytes est éliminée durant la vie fœtale pendant la première progression de la prophase méiotique. L'apoptose a été proposée comme mécanisme expliquant la perte de ces ovocytes, mais ceci reste à être clarifié. La voie apoptotique mitochondriale est médiée par la caspase 9 initiatrice, qui active à son tour les caspases effectrices 3, 6 ou 7, amenant à la mort cellulaire. Le but du projet était d'étudier le rôle de la caspase 9 dans la perte des ovocytes pendant la progression de la prophase méiotique. Premièrement, nous avons étudié par immunofluorescence (IF) l'activation de différentes caspases en marquant des caspases clivées dans des sections de tissus ovariens. Les résultats ont montré que les caspases 9 et 7 sont activées de manière constitutive dans les ovocytes durant la prophase méiotique. Par la suite, nous avons étudié des souris déficientes pour Casp9. Des souris mutantes Casp9 +/- ont été croisées, puis les ovaires des femelles de la progéniture ont été isolés aux jours 16,5-19,5 post-coïtum. Le ratio de femelles Casp9 -/- a drastiquement diminué pendant cette période, confirmant la mortalité périnatale lorsqu'il y a une déficience de caspase 9. Le nombre total de cellules germinales dans des cellules dissociées d'ovaires de souris Casp9 -/-, identifiées par IF en marquant GCNA1, était comparable au contrôle des ovaires au jour 16,5 post- coïtum mais a augmenté deux fois chez les ovaires de souris +/+ ou +/- au jour 19.5 post-coïtum. La progression de la prophase méiotique, telle qu'observée par IF en marquant les composantes de complexe synaptonemale, était similaire dans tous les génotypes. Le marquage par IF de GCNA1 et H2AX, un marqueur de bris doubles brins de l'ADN, a démontré que le nombre excessif d'ovocytes est accumulé à la fin de la prophase méiotique dans les ovaires des souris -/-.Nos résultats suggèrent que la caspase 9 joue un rôle essentiel amenant à la perte des ovocytes et le blocage de la voie apoptotique dépendante à la caspase 9 permet la survie d'un nombre plus important d'ovocytes qui progresseront dans la prophase méiotique I.

Visceral glomerular epithelial cells (GEC), also known as podocytes, are essential components of the kidney glomerulus, and play a pivotal role in maintaining normal glomerular permselectivity. The regulation of the actin cytoskeleton is central to podocyte morphology and function. In the rat model of membranous nephropathy, passive Heymann nephritis (PHN), heterologous antibody binds to GEC antigens. Following immune complex formation the complement system is activated with the assembly of the C5b-9 membrane attack complex. In GEC, C5b-9 induces sublytic injury associated with morphological changes and proteinuria. We have previously reported that complement activates RhoA, member of the Rho family of small GTPases, in vitro and in vivo. The current study addresses the role of GEF-H1, a Rho GEF protein, in complement-mediated RhoA activation in GEC injury. In glomeruli from rats with PHN and cultured GEC, complement stimulation increased GEF-H1 activity, in a parallel fashion with RhoA activation. Activation of GEF-H1 by complement was at least partially dependent on the extracellular signal-regulated kinases (ERK) pathway, but not on the epidermal growth factor (EGF) receptor, or Src-family kinases, or microtubules. To address the functional effects of GEF-H1, GEC were transduced with lentivirus-mediated shRNA of GEF-H1, to knockdown the expression. GEC transduced with shRNA of GEF-H1 significantly blocked RhoA activation and augmented cytotoxicity in response to complement stimulation, implicating a cytoprotective effect of GEF-H1 on GEC in complement-mediated injury. / Les cellules glomérulaires épithéliales viscérales (CGE), ou podocytes, sont des composantes essentielles du glomérule du rein, et jouent un rôle important dans le maintien de la permsélectivité glomérulaire. La régulation du cytosquelette d'actine est à la base du fonctionnement normal du podocyte, ainsi qu'à sa morphologie. Dans le modèle de rat de la néphropathie membraneuse, passive Heymann nephritis (PHN), les anticorps hétérologues se lient aux antigènes des podocytes. Après formation de complexes immuns, le système du complément est activé avec l'assemblage du complexe d'attaque membranaire C5b-9. Dans les CGE, C5b-9 induit des effets sublytiques associés à des modifications morphologiques et à la protéinurie. Nous avons déjà signalé que le complément active RhoA, membre de la famille Rho des petites GTPases, in vitro et in vivo. La présente étude porte sur le rôle de GEF-H1, une protéine de la famille des Rho GEF, dans l'activation de RhoA dans les CGE méditée par le complément. Dans les glomérules de rats avec PHN et dans les CGE cultivés in vitro, la stimulation du complément a augmenté l'activité de GEF-H1, d'une façon parallèle avec l'activation de RhoA. L'activation du GEF-H1 par le complément a été au moins partiellement dépendante de l'extracellular signal-regulated kinase (ERK), mais pas du facteur de croissance épidermique (EGF), de la famille des kinases Src, ou des microtubules. Pour faire face aux effets fonctionnels de GEF-H1, CGE ont été infectées par des lentivirus contenants un petit ARN en épingle à cheveu, pour réduire l'expression de GEF-H1. Les CGE infectées par les lentivirus ont bloqué de manière significative l'activation de RhoA et ont augmenté la toxicité en réponse à la stimulation du complément, impliquant un effet protecteur de GEF-H1 sur les CGE.

Spliced-leader (SL) trans-splicing is a splicesomal process by which the 5'-ends of diverse mRNAs are replaced by a common sequence originating from a specialized SL donor RNA. The patchy phylogenetic distribution of SL trans-splicing, including its recent discovery in the deuterostomes in the tunicate Ciona intestinalis presents two equally possible evolutionary histories. Either it is an ancestral eukaryotic trait that has been lost in multiple lineages, or, it was invented de novo in various lineages including the tunicates. SL trans-splicing has a known function in the resolution of polycistronic operons. However, for monocistronic transcripts there are many proposed but not substantiated functions, including the 5'-untranslated region (5'-UTR) sanitization hypothesis. I investigated the phylogenetic distribution of SL trans-splicing in the deuterostomes and its possible function as a 5'-UTR sanitization mechanism in the monocistronic troponin I gene (CiTnI) in Ciona. I produced oligo-capped 5'-RACE cDNA libraries to survey mRNA 5'-end sequences for common candidate SL sequences in the cephalochordate Branchiostoma, the hemichordate Saccoglossus and the echinoderm Strongylocentrotus. Following steps taken to eliminate short primer-related sequences created during the 5' oligo-capping reaction, and apparently hidden in the form of heteroduplex complexes, the cDNA libraries were subjected to 454 ultra high-throughput sequencing. Several indicators, including the presence of 5'-TOP sequences at the 5'-termini of mRNAs encoding ribosomal proteins and translation factors showed that the 5'-RACE libraries effectively represented the extreme 5'-termini of mRNAs. No common 5'-ends that could represent SL sequences were observed in any of the species examined. This result strongly supports the independent evolution of SL trans-splicing in the tunicates. To further examine the postulated functional role of SL trans-splicing in removing deleterious sequences from the 5'-UTR, I made and used an internal transfection control construct to validate the observation, previously made in our lab, that an experimental CiTnI reporter construct with a long retained-outron 5'-UTR showed low reporter gene activity when electroporated in Ciona embryos. I then created a new CiTnI construct to directly assess the possible presence of a specific deleterious element in the long retained-outron 5'-UTR. My results clearly indicated that there is no specific deleterious element, but that it is the length of the retained-outron 5'-UTR, per se, that leads to low TnI reporter construct expression. / Le “spliced-leader” (SL) trans-épissage est un processus dépendant du spliceseome dont l'éxtremité 5' de divers ARNms sont remplacés par une séquence commune dérivant d'un SL ARN donneur spécialisé. À cause de sa répartition phylogénétique compliquée et sa découverte récente dans le tunicier Ciona intestinalis, un deutérostomiens, il existe deux possibilités d'évolution plausible pour le SL trans-épissage. Le SL trans-épissage est soit; un caractère ancestral qui s'est perdu plusieurs fois dans différentes lignées où il s'est inventé de novo dans différentes lignées, y compris les tuniciers. Une des fonctions connues du SL trans-épissage est la résolution de transcrits polycistroniques, cependant sa fonction concernant les transcrits monocistroniques est moins évidente. Il existe plusieurs hypothèses en ce qui concerne la fonction du SL trans-épissage de gènes monocistroniques, une d'entre-elles est l'assainissement des régions 5' non-traduit (5'-UTR). Mes travaux de recherche ont portés sur la répartition phylogénétique de SL trans-épissage dans les deutérostomiens et sa fonction en tant d'assainissement de la région 5' non-traduite pour le gène troponine I (CiTnI) de Ciona. J'ai créé des banques d'ADNc 5'-RACE coiffés d'oligonucleotide pour bien étudier les séquences à l'extrémité 5' de différents ARNms et ainsi découvrir un motif SL commun dans le Branchiostoma céphalochordé, le Saccoglossus hemichordate et le Strongylocentrotus échinodermes. Après avoir éliminé les courtes séquences reliées à l'amorce qui se sont crée au cours de la réaction de coiffe des ARNs et qui étaient apparemment cachées sous forme de complexes hétéroduplexes, les banques d'ADNc ont été soumises au séquençage 454 ultra à haut débit. La présence des séquences 5'-TOP sur les ARNms des proteines ribosomique et gènes de facteurs de traduction était un des indicateurs confirmant que les banques comprenaient des extrémités 5' de ARNm de qualité. Des extrémités 5' en communs, qui pourraient représenter des séquences SL, n'ont pas été observées dans les organismes examinés. Ce résultat appuie fortement l'évolution indépendante de SL trans-épissage dans les tuniciers.Pour examiner davantage le rôle d'élimination des séquences néfastes de la 5'-UTR postulé pour le SL trans-épissage, j'ai produit et utilisé un contrôle interne de transfection. Ce contrôle a été construit afin de valider des résultats obtenus il y a quelques années dans notre laboratoire, qu'un rapporteur expérimental de CiTnI qui contient un outron-5'-UTR non-épissé a une faible activité du gène rapporteur lorsqu'électroporé dans des embryons de Ciona. Ensuite, j'ai créé un nouveau rapporteur CiTnI pour évaluer la présence possible d'un élément néfaste dans la séquence du 5'-UTR. Mes résultats indiquent qu'il n'y a aucun élément néfaste spécifique, mais que la longueur du outron-5'-UTR retenu, en soi, mène à la faible expression du rapporteur TnI.

MCLK1 (a.k.a. COQ7) is an evolutionarily conserved mitochondrial hydroxylase necessary ubiquinone biosynthesis. Mclk1+/- mice display a 50% reduction in this protein, as well as an array of phenotypes including increased longevity, decreased ubiquinone in the inner mitochondrial membrane, decreased mitochondrial respiration, and increased mitochondrial oxidative stress. We report here by various measures that Mclk1+/- mutants also exhibit an enhanced immune response in vivo. That is, Mclk1+/- mice mount a more extreme inflammatory response to bacterial lipopolysaccharide stimulation and bacterial infection, evidenced by increased measures of plasma cytokine levels. These mice also demonstrate resilience to tumour development, evidenced by a prolonged, dose-dependent delay in tumour onset following tumour cell xenograft. Furthermore, we report that Mclk1+/- mice react differently than wild-type mice following rapamycin injection. That is, circulating cytokine levels are attenuated in mutants but increased in wild-type mice following rapamycin administration. Despite their more extreme immune response, we demonstrate that Mclk1+/- mutants sustain less tissue damage as a result of infection or old age. Finally, using mouse models of high mitochondrial or cytoplasmic oxidative stress, we report that the Mclk1+/- phenotype is not simply due to increased reactive oxygen species in the mitochondria. These findings suggest characteristics that may contribute to the increased lifespan of these mice, though the causes of these characteristics require further investigation. / MCLK1 (COQ7) est une enzyme hydroxylase conservée au cours de l'évolution et nécessaire pour la biosynthèse de l'ubiquinone. Les souris Mclk1+/- présentent une réduction de 50% du niveau de cette protéine, ainsi qu'une gamme de phénotypes, tels qu'un accroissement de la longévité, une réduction de la quantité d'ubiquinone dans la membrane interne mitochondriale, une réduction de la respiration mitochondriale, et une augmentation du stress oxydatif mitochondrial. Différentes mesures ont démontrées que les souris Mclk1+/- arborent également une meilleure réponse immunitaire suite à la stimulation par des lipopolysaccharides bactériens (LPS) ainsi que par l'infection bactérienne, comme en témoigne une augmentation du niveau de plusieurs cytokines plasmatiques en réponse à ces stimulations. Les mutants Mclk1+/- sont aussi plus résistants au développement de tumeurs, comme en témoigne le délai dans l'apparition de tumeurs après une xénogreffe de cellules tumorales. En outre, nous avons découvert que les souris Mclk1+/- réagissent différemment par rapport aux souris de type sauvage à un traitement avec la rapamycine. Nous avons observé que suite à l'administration prolongée de rapamycine suivi par une injection de LPS, le niveau de cytokines circulantes diminue chez les souris mutantes alors que chez les souris de type sauvage ce niveau augmente. Malgré leur réponse immunitaire plus intense, nous avons démontré que les souris Mclk1+/- subissent moins de dommages tissulaires à la suite d'une infection ou du processus de vieillissement. Enfin, en utilisant des modèles murins de stress oxydatif mitochondrial ou cytoplasmique augmenté, nous avons aussi établi que le phénotype Mclk1+/- ne résulte pas simplement de l'augmentation des radicaux libres dans les mitochondries.

One of the major challenges facing cancer therapy today is the resistance to radiation and chemotherapy that some tumor cells exhibit. Our study was aimed at exploring the role of CUX1 in resistance to both radiation and chemotherapy. CUX1 is a metazoan transcription factor which is cleaved by cathepsin L from its p200 full-length form into the p110 isoform during the G1/S phase transition, thus allowing transcriptional activation of genes involved in cell cycle progression and DNA replication. Overexpression of p110 CUX1, as seen in many tumors and cancer cell lines, is known to accelerate cell proliferation by shortening the G1 phase of the cell cycle. We first investigated whether a relationship existed between the CUX1 and RAS oncogenes in the context of radioresistance. Expression of constitutively activated RAS has been shown to promote radioresistance in many cell lines. Previous results from our laboratory have demonstrated a correlation between RAS activation and upregulation of p110 CUX1. Throughout this study, we have shown that overexpression of p110 CUX1 leads to radioresistance whereas knockdown of CUX1 sensitizes cells to radiation therapy. It has been documented that RAS activation stimulates production of short nuclear cathepsin L and production of p110 CUX1. In line with this, we have demonstrated that inhibition of cathepsin L causes a reduction in p110 CUX1 levels and concomitantly sensitizes cells to radiation therapy. As such, we hypothesize that there is interplay between RAS, cathepsin L and CUX1 leading to radioresistance. In parallel to this, CUX1 has been linked to DNA damage response via transcriptional activation of several genes enabling cells to mount an efficient response to DNA damage. We have shown that compromising the DNA binding activity of p110 CUX1 in the presence of radiation, a potent source of DNA damage, causes decreased clonogenic survival. We have also shown that compromising the DNA binding activity of p110 CUX1 impairs recruitment of Ku80 to DNA, thus suggesting a direct role for CUX1 in Non-Homologous End Joining (NHEJ) DNA repair. During the second part of our study, we investigated whether CUX1 plays a role in resistance to chemotherapy. We found that overexpression of p110 CUX1 increases resistance to chemotherapeutic drugs affecting microtubule dynamics such as Paclitaxel and Vincristine. Conversely, knockdown of CUX1 was shown to promote sensitivity to the aforementioned drugs. RAS-transformed cells are known to exhibit heightened mitotic stress and CUX1 knockdown was found to be synthetic lethal for RAS-transformed cells. We have found that knockdown of CUX1 selectively over-sensitizes RAS cells to chemotherapeutic drugs affecting microtubule dynamics, thus suggesting that CUX1 helps alleviate mitotic stress exhibited by RAS-transformed cells. / L'un des défis majeurs auquel est confronté le traitement du cancer aujourd'hui est la résistance à la radiothérapie et la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. Notre étude visait à explorer le rôle de CUX1 dans la résistance à la radiothérapie et la chimiothérapie. CUX1 est un facteur de transcription métazoaire qui est clivé pendant la transition de phase G1/S par la cathepsine L à partir de sa forme pleine longueur p200 pour générer l' isoforme p110. p110 CUX1 permet l'activation transcriptionnelle de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire et de la réplication d'ADN. La surexpression de p110 CUX1, observée dans de nombreuses tumeurs et lignées cellulaires cancéreuses, stimule la prolifération cellulaire en raccourcissant la phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons d'abord cherché à connaître si une relation existait entre les oncogènes CUX1 et RAS dans le contexte de la radiorésistance. Il a été démontré que l'expression constitutive de RAS promouvoit la radiorésistance dans de nombreuses lignées cellulaires. De plus, certains résultats antérieurs provenant de notre laboratoire ont démontré une corrélation entre l'activation de RAS et l'augmentation de p110 CUX1. À travers cette étude, nous avons démontré que la surexpression de p110 CUX1 conduit à la radiorésistance alors qu'une diminution dans l'expression de CUX1 sensibilise les cellules à la radiothérapie. Il a été démontré que l'activation de RAS stimule la production de la cathepsine L nucléaire ainsi que celle de p110 CUX1. Nous avons démontré que l'inhibition de la cathepsine L entraîne une réduction des niveaux de p110 CUX1 et sensibilise les cellules à la radiothérapie. De ce fait, nous émettons l'hypothèse qu'il existe un mécanisme reliant RAS, la cathepsine L et CUX1 conduisant à la radiorésistance. En parallèle à cela, CUX1 a été lié à la réponse du dommage à l'ADN à travers l'activation transcriptionnelle de plusieurs gènes permettant aux cellules de monter une réponse efficace aux dommages à l'ADN. Nous avons démontré que compromettre l'activité de liaison à l'ADN de p110 CUX1 en présence de radiation, une puissante source de dommages à l'ADN, entraîne une diminution de la survie cellulaire. Nous avons également démontré que compromettre l'activité de liaison à l'ADN de p110 CUX1 prévient le recrutement de Ku80 à l'ADN, suggérant ainsi la possibilité que CUX1 puisse jouer un rôle direct dans le mécanisme de réparation de l'ADN de type « NHEJ ». Au cours de la deuxième partie de notre étude, nous avons examiné si CUX1 pouvait jouer un rôle dans la chimiothérapie. Nous avons trouvé que la surexpression de p110 CUX1 augmente la résistance aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le paclitaxel et la vincristine qui affectent la dynamique des microtubules. De même, une réduction de CUX1 semble favoriser la sensibilité aux médicaments mentionnés ci-dessus. Il a été démontré que les cellules contenant RAS constitutivement activé contiennent non seulement un niveau de stress mitotique élevé, mais possèdent aussi CUX1 comme cible synthétique létale. Nous avons constaté qu'une réduction de CUX1 résulte en une sensibilisation séléctive des cellules surexprimant RAS envers les médicaments chimiothérapeutiques affectant la dynamique des microtubules. Ainsi, ceci suggère que CUX1 aide à soulager le stress mitotique subit par les cellules RAS.

RPTP_Sigma, RPTP_Delta and RPTP_Lar are the three members of the LAR_RPTPs family. These members share similar structures and superposed expression patterns in different tissues. Although they are key players in different cellular functions their role in embryonic development is little known. We show that RPTP_Sigma, RPTP_Delta and RPTP_Lar are redundant in the heart and liver. Triple mutant (SDLKO) embryos show lethality starting with E12.5 and have defect in erythrocytes maturation translated by a delay in erythroblasts enucleation and persistent truncus arteriosus that leads to a failure in separation of aorta from pulmonary artery. / RPTP_Sigma, RPTP_Delta et RPTP_Lar sont trois membres de la famille des LAR_RPTPs. Ces membres partagent un patron d'expression dans différents tissus et des structures similaires. Malgré le fait qu'ils sont des acteurs important de différentes fonctions cellulaires, leur rôle dans le développement embryonnaire reste mal compris. Nos résultats montrent que RPTP_Sigma, RPTP_Delta et RPTP_Lar agissent de façon redondante dans le cœur et le foie. Les embryons triple mutants (SDLKO) commencent à présenter une létalité à partir E12.5 et un défaut dans la maturation des érythrocytes se traduisant par un délai d'énucléation des érythroblastes. De plus, ces embryons montrent un truncus arteriosus persistant causant un défaut dans la séparation entre l'aorte et l'artère pulmonaire.

Cells, and in fact all living organisms, are capable of responding to stimuli. Regardless of the source and purpose of the signal, when responding to varying factors, complex mechanisms ensure tight regulation of cellular processes. This is particularly true during cellular response to stress. Depending on the severity of a stress stimulus, cells may attempt to cope with and overcome the assault, or they may opt for an organized suicide, in the face of too potent a signal. To provide a tight control over cellular survival and death, numerous protein factors promote or inhibit apoptotic cell death. Intriguingly, not only does the mRNA-binding protein HuR contribute to regulating the expression of pro- and anti-apoptotic factors, but we previously discovered that in response to lethal stress, HuR is cleaved by active caspases, and that this event enhances apoptotic cell death. Given the broad spectrum of mRNAs regulated by HuR, and the well-documented overexpression of this protein in cancer development, we aimed to characterize the caspase-mediated cleavage of HuR and its implication in apoptotic progression. In doing so, we first delineated the signalling cascade that enables stress stimuli to trigger the cleavage of HuR, and confirmed that the HuR cleavage products (HuR-CPs) are capable of inducing apoptosis in non-lethal conditions. Furthermore, we clarified how one of these HuR-CPs, HuR-CP1, can further promote the cleavage of HuR. This is done by competitively binding to the HuR nuclear import factor TRN2, thus causing full-length HuR to accumulate in the cytoplasm, as has been reported to occur during apoptosis. Finally, we obtained data suggesting that the HuR-CPs may coordinate a post-transcriptional regulatory program that is distinct from that of full-length HuR. The HuR-CPs bind and stabilize the mRNA of the pro-apoptotic caspase-9 to a greater extent than does full-length HuR, and bind to a lesser degree to the HuR mRNA target Prothymosin α, which encodes an anti-apoptotic regulator of cell death. Collectively, our findings have revealed the mechanism by which HuR switches its function from promoting cell survival in normal and non-lethal conditions, to becoming a promoter of apoptotic cell death in response to lethal stress. Mechanistically, this occurs via the cleavage of HuR, through particular signalling pathways. The two HuR-CPs that are generated may exercise different functions to mediate altered post-transcriptional regulatory events, thus enhancing the progress of apoptosis. Beyond extensively characterizing the cleavage of HuR, this cumulative work brings to light previously undiscovered mechanisms of regulation of gene expression, particularly during the strictly-controlled process of cell stress response. / Les cellules, ainsi que tous les êtres vivants sont capables de réagir à des stimuli. Quelque soit la source et le rôle de ces signaux, les mécanismes d'action en réponse à ces stimuli sont fortement régulés au sein de la cellule. Ceci s'avère particulièrement vrai en réponse à des stress puisque leur intensité détermine la réponse cellulaire. En effet, les cellules peuvent décider de continuer à vivre, en s'adaptant à cet assaut, ou bien elles peuvent décider d'induire leur mort si le stress est trop fort. Pour bien contrôler la balance entre la survie et la mort, plusieurs protéines activent ou inhibent la mort cellulaire par l'apoptose. Notamment, la protéine HuR, qui s'associe avec des ARN messagers (ARNms), peut réguler l'expression de facteurs activateurs et inhibiteurs de l'apoptose. De plus, nous avons découvert que de forts stress induisent un clivage de HuR par des caspases activées ainsi que l'apoptose. Malgré l'implication de HuR dans l'apoptose, ses niveaux d'expression sont élevés durant le développement de certains cancers et permettent la régulation de l'expression de divers ARNms. Nous nous sommes donc posés comme objectif de caractériser le clivage de HuR et son rôle dans l'apoptose. Premièrement, nous avons déterminé la cascade de signaux induisant le clivage de HuR. En même temps, nous avons confirmé que les produits de clivage de HuR (HuR-CPs) sont capables d'induire l'apoptose dans des conditions non toxiques. Deuxièmement, nous avons découvert comment un de ces produits de clivage, HuR-CP1, peut augmenter le clivage propre de HuR. HuR-CP1 accompli ceci en s'associant compétitivement avec le facteur TRN2, qui régule l'import nucléaire de HuR, causant ainsi une augmentation du niveau de HuR non-clivé dans le cytoplasme, comme déjà constaté durant l'apoptose. Finalement, nous avons obtenu des résultats qui suggèrent que les HuR-CPs peuvent coordonner un programme de régulation au niveau post-transcriptionel différent de celui effectué par HuR. Les produits de clivage de HuR s'associent et stabilisent l'ARNm du facteur apoptique caspase-9 plus fortement que HuR non-clivé, et ils s'associent moins fortement que HuR avec l'ARNm de Prothymosin α, qui code un facteur de survie. En résumé, nos découvertes ont dévoilé le mécanisme par lequel la fonction de HuR transite entre activateur de la survie cellulaire dans des conditions normales et non-toxiques, et inducteur de l'apoptose suite à un signal toxique. Ceci est dû au clivage de HuR induit par des voies de signalisations spécifiques. Les deux HuR-CPs qui sont produits ont des effets différents de HuR pour influencer la régulation post-transcriptionel, et en conséquence, peuvent promouvoir l'apoptose. Nos travaux ont non seulement caractérisé le clivage de HuR, mais nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation d'expression génétique, spécifiquement durant la réponse cellulaire aux stress.