G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest group of cell surface receptors, translating environmental signals into cellular responses via cognate G protein partners. Contrary to our initial understanding, most GPCRs do not function in living cells as monomers, but most likely dimers, or even larger arrays of receptors. Standard drug design approaches rely on the notion that drugs binding the two receptors in a given dimer likely function independently of one another. However, this view has been challenged by recent work showing that ligand binding at both receptors can modulate dimeric receptors via allosteric communication. While one receptor may actually be needed to drive signalling, the other acts to control or modulate these signals, without a direct signalling outcome itself. Based on the notion of allosteric modulation within homo- and heterodimers, I tested and compared changes in signalling downstream as well as at the level of the receptor-G protein-effector (RGE) complex in response to different combinations of ligands at each protomer. Using a combination of calcium, cyclic adenosine monophosphate, and mitogen-activated protein kinase signalling assays, I have demonstrated functional interactions for a putative D2 dopamine receptor, oxytocin receptor heterodimer (D2R/OTR), in HEK 293 cells. Immunoprecipitation, bioluminescence resonance energy transfer (BRET) and confocal microscopy experiments reveal D2R and OTR do in fact form a heterodimer in vitro, which may explain the nature of these potential allosteric functional interactions. Using BRET, I assessed the RGE complex conformational dynamics in HEK 293 cells for two other heterodimers, β2-adrenergic receptor with cannabinoid CB1 receptor (β2AR/CB1R) and β2AR/OTR, in order to determine how they manifest in parallel to signalling events themselves. These studies reveal functional interactions can occur in terms of signalling complex conformation. Thus GPCR signalling can be modulated by its partner receptor at the level of downstream effector signalling or at the level of the signalling complex itself. With that said, putative heterodimers need to be reanalyzed in vivo for their allosteric properties, which may explain some of the side effects of so many drugs, and may have implications in drug design. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent le plus grand groupe de récepteurs de la surface cellulaire, qui traduisent les signaux environnementaux en réponses cellulaires via leurs protéines G associées. Contrairement à notre compréhension initiale, la majorité des RCPG ne fonctionnent pas en tant que monomères, mais possiblement en tant que dimères ou même oligomères. Les approches actuelles de conception de médicament estiment que lors de la liaison d'un médicament aux deux récepteurs d'un dimère quelconque, ces derniers fonctionnent potentiellement indépendamment l'un de l'autre. Cependant, cette notion a été reconsidérée par une étude récente montrant que la liaison d'un ligand aux deux récepteurs peut les altérer par voie de communication allostérique. Alors qu'un premier récepteur peut être requis pour initialiser la signalisation, un second peut contrôler ou modifier ces signaux, n'ayant pas nécessairement une signalisation directe comme résultante. Dans l'étude suivante, basée sur la notion de modulation allostérique au sein d'homodimère et d'hétérodimère, les changements de signalisation en aval ainsi qu'au niveau du complexe récepteur/protéine G/effecteur (RGE) ont été étudiés et comparés en réponse à différentes combinaisons de ligands pour chaque protomère. En utilisant une combinaison d'essais de signalisation de calcium, d'adénosine monophosphate cyclique (cAMP) et de protéine kinase activée par des agents mitogènes (MAPK), une interaction fonctionnelle entre le récepteur dopaminergique D2 et le récepteur de l'ocytocine (D2R/OTR) a été démontrée dans les cellules HEK 293. Des expériences d'immunoprécipitation, de transfert d'énergie de résonance par bioluminescence (BRET) et de microscopie confocale ont révélé la présence d'hétérodimère entre le D2R et l'OTR in vitro, ce qui pourrait expliquer la nature des interactions fonctionnelles allostériques. En utilisant la technique de BRET, la dynamique fonctionnelle du complexe RGE dans les cellules HEK 293 a été examinée chez deux autres hétérodimères, soit celui composé du récepteur adrénergique β2 et du récepteur cannabinoïde CB1 (β2AR/CB1R) et l'hétérodimère β2AR/OTR, afin de déterminer comment ils traduisent les évènements de signalisation. Ces études démontrent donc qu'une interaction fonctionnelle peut survenir sur le plan de la conformation du complexe de signalisation. Par conséquent, la signalisation d'un RCPG peut être modulée par son récepteur partenaire au niveau des effecteurs ou au niveau du complexe de signalisation lui-même. Pour cette raison, il serait impératif de réanalyser in vivo les propriétés allostériques d'hétérodimères putatifs, ce qui pourrait expliquer certains effets secondaires d'une multitude de médicaments et ce qui pourrait impliquer des changements majeurs dans la façon de concevoir de nouveaux médicaments.

The two rounds of cell division that constitute meiosis are a conserved process that generates the gametes required for sexual reproduction. Given the importance of this specialized cell division in forming new life it is imperative for meiotic cells to ensure that the homologous chromosomes (at meiosis I) and subsequently the sister chromatids (at meiosis II) are properly segregated to avoid aneuploidy and infertility. As a first step in this process the maternal and paternal chromosomes (the homologs) have to be able to recognize each other and align along their length (pairing). In many organisms this culminates in the formation of the synaptonemal complex (SC) to further stabilize their interactions. Since SC formation is independent of chromosome homology, pairing and synapsis processes must be coordinated to ensure SC formation only after homology assessment. During the chromosome pairing process in the nematode C. elegans, one end of each chromosome (the pairing centers, PCs) interacts with the nuclear envelope (NE) and is thought to generate their movement within the nucleus through a connection to cytoskeletal forces across an intact NE, a process well conserved from yeasts to mammals. The function of chromosome movement and how it is established and regulated is still poorly understood in any system and here I present my contribution to understanding the mechanism and regulation of meiotic chromosome pairing and synapsis and the role of chromosome movement during these events in C. elegans.My initial work focused on the characterization of polo-like kinase 2 (PLK-2); PLK-2 localizes to the PCs associated with the NE upon meiotic entry and loss of plk-2 function severely disrupts homologue pairing and results in nonhomologous synapsis. Previous work has shown that at meiosis I onset, the NE is reorganized such that integral NE SUN-1/ZYG-12 modules that bridge the NE and interact with cytoskeletal forces aggregate in the vicinity of chromosome PCs to form mobile foci that can further coalesce into patches. I showed that PLK-2 activity at the PCs is required for the meiotic reorganization of SUN-1/ZYG-12 complexes within the NE and I directly show that these bridges connect nuclear chromosomes with the cytoskeletal forces that are required to generate chromosome movement during pairing stages. Using a kinase dead PLK-2, I found that PLK-2 kinase activity is required for chromosome motion and loss of this motion results in nonhomologous synapsis between the unpaired chromosomes. Using a separation-of-function allele of PLK-2, I demonstrate for the first time that chromosome movement per se is not sufficient for homologous pairing. In these mutants, the chromosomes retain wild-type like movements, despite the failure to reorganize the NE and form SUN-1/ZYG-12 foci and patches. Analysis of the chromosome movement indicates that chromosome ends undergo fewer encounters and separate more rapidly in comparison to wild-type. Consequently, I propose that SUN-1/ZYG-12 patch formation is not required for chromosome movement but to restrain this movement in order to provide a window of opportunity for the chromosomes to undergo homology assessment. The balance of forces between NE protein aggregates that constrain chromosome ends together and cytoskeletal microtubules that try to separate them might be at the basis of chromosome homology establishment. Since many of the proteins participating in these events are conserved, including PLK-2, this mechanism may be a conserved feature of meiotic chromosome pairing in different species. / Les deux cycles de division cellulaire qui constituent la méiose représentent un processus conservé au cours de l'évolution des espèces qui permet de créer les gamètes nécessaires à la reproduction sexuelle. Compte tenu de l'importance de ce processus dans la formation de toute nouvelle vie, il est essentiel pour les cellules méiotiques d'assurer la séparation correcte des chromosomes homologues lors de la première division de méiose (MI), puis des chromatides sœurs lors de la deuxième division de méiose (MII) afin d'éviter aneuploïdie des gamètes et infertilité. Au cours de la méiose I, les chromosomes maternels et paternels homologues se reconnaissent et s'alignent sur toute leur longueur (appariement). Dans de nombreux organismes cette première étape aboutit à la formation du complexe synaptonémal (SC) qui stabilise davantage leurs interactions. Puisque la formation du SC est indépendante de l'homologie des chromosomes, les processus d'appariement et de synapse doivent être dûment coordonnés pour que la formation du SC n'ait lieu qu'après vérification de l'homologie. Pendant le processus d'appariement des chromosomes chez le nématode C. elegans, une extrémité de chaque chromosome (les centres d'appariement, PC) interagit avec l'enveloppe nucléaire (NE) et génère vraisemblablement leur mouvement à l'intérieur du noyau par le biais d'une connexion au cytosquelette via l'enveloppe nucléaire, un processus bien conservé des levures aux mammifères. La fonction du mouvement des chromosomes et la façon dont il est établi et réglementé est encore mal comprise dans tout système. Je présente dans ce manuscrit ma contribution à la compréhension du mécanisme et de la fonction précise de ce processus dans le mouvement des chromosomes lors de la méiose chez C.elegans.Mon travail initial a porté sur la caractérisation d'une protéine polo-like kinase 2 (PLK-2). PLK-2 se localise au niveau des centres d'appariement associés à l'enveloppe nucléaire au début de la méiose; son absence perturbe gravement l'appariement des homologues et conduit à la formation de synapse non-homologue. Des travaux antérieurs avaient montré que à l'entrée en méiose l'enveloppe nucléaire est réorganisée de telle façon que les complexes protéiques SUN-1/ZYG-12 qui permettent de créer la liaison physique entre le cytosquelette à l'extérieur du noyau et les chromosomes à l'intérieur s'agrègent entre eux au voisinage des centres d'appariement des chromosomes. J'ai montré que c'est l'activité de PLK-2 qui préside à la réorganisation de ces complexes SUN-1/ZYG-12 dans l'enveloppe nucléaire, et que ces complexes sont directement nécessaires au mouvement des chromosomes durant le processus d'appariement. Par mutagénèse dirigée j'ai créé une protéine PLK-2 sans activité kinase, et j'ai ainsi pu démontrer qu'une réaction de phosphorylation par PLK-2 est essentielle au mouvement des chromosomes; en son absence les chromosomes forment des synapses non homologues. La découverte et l'étude d'un allèle non nul de plk-2 (vv44) a aussi permis de comprendre que le mouvement des chromosomes n'est pas suffisant à la reconnaissance des homologues, puisque dans ces mutants vv44 les chromosomes, bien que mobiles, ne créent pas de réorganisation des complexes SUN-1/ZYG-12 dans l'enveloppe nucléaire et forment aussi des synapses non homologues. Une analyse détaillée du mouvement des chromosomes dans ces mutants montre que les chromosomes se séparent plus rapidement que dans le type sauvage. Je propose donc un modèle dans lequel la formation des agrégats SUN-1/ZYG-12 n'est pas nécessaire au mouvement des chromosomes mais bien à leur rétention entre eux. Ainsi il existe un équilibre des forces entre les agrégats qui contraignent les extrémités des chromosomes dans un micro-environnement et les forces du cytosquelette qui permettent de séparer les chromosomes non homologues; cet équilibre offre une fenêtre d'opportunité pour tester l'homologie des chromosomes.

The nascent-polypeptide-associated complex and coactivator-alpha (αNAC) is a subunit of a cytosolic heterodimer that binds to ribosomes and newly synthesized polypeptides in a chaperone-like manner. In the nucleus, αNAC acts as a transcriptional coregulator that can potentiate the expression of the osteoblast-specific gene, Osteocalcin (Ocn). One unique feature of αNAC is its sequence-specific DNA binding capacity. By virtue of this unique characteristic, ChIP-chIP technology was used to identify potential target genes of αNAC in mineralizing osteoblasts. One target that emerged from this analysis was Itgβ6. To confirm the result obtained by ChIP-chIP, we performed a formaldehyde cross-linking ChIP in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells. αNAC was shown to bind the Itgβ6 promoter. We next examined the expression profile of Itgβ6 in mineralizing and unmineralized MC3T3-E1 pre-osteoblasts over the course of differentiation. No induction of Itgβ6 expression was observed at any timepoint throughout differentiation. Double cross-linking ChIP in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells showed that αNAC and the corepressor molecule, HDAC1, occupied the Itgβ6 promoter. The ChIP data suggested that HDAC corepressor complexes were recruited by αNAC to the promoter region of Itgβ6 to repress its expression. In differentiating C2C12 myoblasts, a 5-fold induction was observed for Itgβ6 at day 5 suggesting that Itgβ6 is differentially regulated in muscle and bone. We proposed that a possible mechanism of Itgβ6 induction in day 5 myotubes was due to the dissociation of the HDAC1 corepressor complex from the promoter. We performed a double cross-linking ChIP in day 5 myotubes and observed a marked decrease in HDAC1 enrichment suggesting that the release of HDAC1 relieved repression of Itgβ6 and resulted in its induction. To determine if Itgβ6 expression could be induced by suppressing HDAC1 activity we tested the effects of two HDAC inhibitors Trichostatin-A (TSA) and Sodium Butyrate (NaB). In pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells, Itgβ6 expression was not induced following treatment with HDAC inhibitors. Similarly, treatment of C2C12 myoblasts with TSA and NaB also showed no induction of Itgβ6 expression. However, a dose-dependent induction of Ocn expression occurred following treatment with TSA and NaB. We concluded that class I HDACs including HDAC1 are important for the repression of Ocn expression in cells of the muscle-cell lineage. Our data demonstrated that αNAC is able to recruit HDACs and form a corepressor complex at the promoter region of the Itgβ6. This suggests a model for αNAC as a multifunctional transcriptional coregulator that could be involved in both gene activation and repression. / La sous-unité alpha du Nascent polypeptide Associated Complex (αNAC) migre au noyau des ostéoblastes différenciés où elle se lie au promoteur du gène Osteocalcin (Ocn) afin de contrôler son expression. Un criblage génomique à l'aide de séquences de promoteurs immunoprécipitées par des anticorps anti-αNAC (ChIP-on-chip) a identifié le gène Integrin β6 (Itβ6) comme un autre gène-cible potentiel de l'activité régulatrice d'αNAC. Nous avons confirmé l'interaction d'αNAC avec le promoteur Itβ6 par méthode conventionnelle d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Lorsque nous avons mesuré l'expression d'Itβ6 au cours de la différenciation ostéoblastique, nos résultats montrent que le gène n'est pas exprimé de façon significative. Ces données suggèrent un mode actif de répression de l'expression d'Itβ6. En accord avec ce modèle, nous avons confirmé l'interaction des co-répresseurs Histone De-Acetylase 1 (HDAC1) et HDAC3 au promoteur d'Itβ6, dans un fragment contenant le site de liaison pour αNAC. Cette intéraction est détectée dans les pré-ostéoblastes ainsi qu'au cours de la différenciation, suggérant qu'elle contribue aux mécanismes de répression de l'expression d'Itβ6 dans les ostéoblastes. Par contraste, l'expression d' Itβ6 est induite lorsque des myoblastes se différencient en myotubes, et ce profil d'expression est concommittant à une diminution de l'association de HDAC1 au promoteur Itβ6 dans les myotubes différenciés. Le traitement d'ostéoblastes ou de myoblastes avec des inhibiteurs de l'activité enzymatique HDAC n'influencent pas l'expression de Itβ6, mais induit l'expression d'Ocn dans les myoblastes, démontrant que l'activité enzymatique des HDACs est importante dans la répression des niveaux d'Ocn dans les cellules musculaires mais n'est pas le seul facteur contrôlant la transcription de Itβ6. Nos résultats confirment l'interaction d'αNAC avec le promoteur du gène Itβ6 et indiquent que l'expression du gène est modulée de façon différentielle au cours de la différenciation de cellules mésenchymateuses. Dans l'ensemble, nos données sont en accord avec un modèle dans lequel les protéines HDACs contribuent au fin contrôle de l'expression de Itβ6 au cours de la différenciation des cellules mésenchymateuses.

REV1 is a DNA polymerase that is involved in the process of translesion synthesis, both as an enzyme and as a scaffolding protein. The BRCT domain of this protein has been extensively studied since it was found to play a role in the recruitment of REV1 to DNA. The objective of the first part of this study was to investigate the role of the N-terminal fragment of REV1, which contains the BRCT domain, in generation of point mutations, using two tissue culture-based assays: the imatinib- and ouabain-resistance assays. Resistance to imatinib and ouabain is generally due to point mutations in the BCR-ABL and ATP1A1 genes, respectively. In both assays, the N-terminal fragment of REV1 leads to a higher rate of resistance than the control. Analysis of imatinib-resistant clones suggests that the increase in resistance in cells overexpressing the N-terminal fragment of REV1 is indeed due to point mutations in the BCR-ABL gene. The objective of the second part of this study was to elucidate a possible mechanism for the increase in frequency of resistance to imatinib and ouabain in cells expressing the N-terminal fragment of REV1. Although the results from this section remain inconclusive, we hypothesize that this fragment could possibly dimerize with the wild-type REV1 protein in cells, thus increasing REV1 recruitment to DNA and increasing the rate of translesion synthesis. In the third part of the study, a phage display library was screened to find possible binding partners for the N-terminal fragment of REV1. However, results from this section require further study. / REV1 est une polymérase d'ADN qui participe au processus de synthèse de translésion comme une enzyme ainsi qu'un adapteur. Le domaine de BRCT de REV1 a été considérablement étudié. Ce domaine contribue au recrutement de REV1 à l'ADN. L'objectif de la première partie de cette étude est de déterminer le rôle de la région N-terminale de REV1 dans la production des mutations ponctuelles en utilisant des modèles de lignées cellulaires. Les modèles utilisés dans cette étude sont la résistance à imatinib et la résistance à ouabain. La résistance à imatinib et la résistance à ouabain sont souvent causées par des mutations ponctuelles dans les gènes BCR-ABL et ATP1A1, respectivement. Les résultats de ces expériences ont démontré que l'expression de la région N-terminale de REV1 cause une augmentation du taux de résistance dans les deux systèmes étudiés. De plus, les résultats suggèrent que l'augmentation du taux de résistance à imatinib dans les cellules qui expriment la région N-terminale de REV1 est due aux mutations ponctuelles. La deuxième partie de cette étude consistait à trouver un mécanisme qui pourrait contribuer à l'augmentation du taux de résistance à imatinib et à ouabain observée dans les cellules exprimant la région N-terminale de REV1. Les résultats de cette partie ne sont pas concluants; par contre, notre hypothèse est qu'il existe un mécanisme de dimérisation entre le REV1 endogène et la région N-terminale exprimée dans les cellules. Cette dimérisation pourrait ensuite élever le niveau de recrutement de REV1 à l'ADN et augmenter le taux de synthèse de translésion. Le troisième but de cette étude était de trouver des partenaires d'interaction avec la région N-terminale de REV1 en utilisant un "Phage Display Library". Par contre, les résultats de cette section doivent être étudié plus profondément.

The soybean genome has between 46,000-66,000 protein coding genes, which determine the traits of the soybean plant. Out of these thousands of genes only a few gene promoters have been studied and well characterized. Promoter evaluation is very important especially for biotechnology applications as they determine gene expression levels, patterns and their profiles. Some of these characterized promoters in soybean are the lectins promoters of Le1, Le2, Le3 genes. In this study we have cloned the Le4 gene promoter and transformed into Arabidopsis thaliana by floral dip transformation technique to determine the expression profile using gusA as reporter gene. The expression profile was compared with plants already transformed with the promoters from Le1, Le2 and Le3. Part of the project was conducted in silico, in which promoter sequences of these homologues were retrieved from Phytozome (www.phytozome.net) and DNA motifs present in these promoters were predicted using PLACE database. The protein 3D structure of Le1 was used as template to compare with Le4. / Le génome du soja contient 46,000 à 66,000 gènes codant pour des protéines, qui déterminent les traits de la plante de soja. Cependant, parmi ces milliers de gènes, seulement quelques promoteurs de gènes ont été étudiés de façon approfondie. L'évaluation du promoteur est très importante, surtout pour les applications de biotechnologies, car elles déterminent les niveaux d'expression, les habitudes et les profils des gènes. Certains de ces promoteurs caractérisés dans le soja sont les promoteurs de lectines des gènes Le1, Le2 et Le3. Dans cette étude, nous avons cloné le promoteur du gène Le4 dans un vecteur binaire. Puis, nous l'avons transformé en Arabidopsis thaliana par la technique « floral dip transformation » afin de déterminer le profil d'expression en utilisant gusA comme étant un gène rapporteur. Le profil d'expression a été comparé avec les promoteurs déjà transformés à partir des gènes Le1, Le2 et Le3. Une partie du projet a été réalisée « in silico » dans lesquelles des séquences promotrices de ces homologues ont été récupérées à partir du programme Phytozome (www.phytozome.net). Des motifs d'ADN présents dans ces promoteurs ont été prédits en utilisant la base de données PLACE. Les motifs uniques ont été comparés. La structure des protéines en 3D de Le1 a été utilisée comme modèle pour comparer avec le gène Le4.

Type 1 diabetes susceptibility is associated with genetic variants that cause a lower level of insulin expression in the thymus, and more specifically in the medullary thymic epithelial cells (mTECs). The expression of insulin as well as other self-antigens in these mTECs has been demonstrated to be an essential component in the maintenance of self-tolerance. Although the Aire regulator is a known modulator of self-antigen expression in mTECs, not much else is known on the regulation of specific self-antigens and particularly of insulin's expression. My thesis project centers on this question.I first generated direct evidence that higher glucose, the main metabolic stimulus regulating insulin secretion in the pancreas, had no effect on the expression of insulin in the thymus with studies both in vivo and in vitro. I then showed that pro-inflammatory cytokines Ifn-γ and Tnf-α have a regulatory effect whereby their addition to cultured mTECs decreased levels of insulin, and mice lacking either of the two cytokines had increased levels of both insulin and other self-antigens. In addition, this mechanism was found to be independent of Aire, the first finding where Aire and insulin expression are discordant. Another factor that modulated the expression of insulin was the co-culturing of thymocytes with mTECs. The direct cell-to-cell contact of the two cell types upregulated insulin expression, as well as the expression of Aire. Furthermore, a microarray analysis generated an expression profile for two individual clones of mTECs, one that expresses insulin and one which does not. This has enabled a comprehensive view of the genes expressed by single mTECs, which had previously been impossible to define. A new surface marker was found to be differentially expressed in the insulin positive clone; CD34. The isolation of CD34+ primary mTECs showed an increased level of insulin expression and Aire expression. These findings have uncovered some of the Aire-independent regulatory mechanisms for insulin expression as a self-antigen in mTECs. / La prédisposition au diabète de type 1 est associé aux variantes génétiques qui modulent le taux d'expression de l'insuline dans le thymus et particulièrement dans les cellules médullaires epithéliales (mTECs). Cette expression de l'insuline ainsi que d'autres auto-antigènes dans les mTECs est essentielle pour maintenir l'auto-tolérance. Bien que le régulateur Aire est reconnu comme le principal contrôleur de l'expression des auto-antigènes il n'existe pas beaucoup plus d'information sur la régulation des auto-antigènes spécifiques et particulièrement sur l'insuline. Ma thèse est centrée sur ces questions.J'ai premièrement obtenu la preuve directe que le taux de glucose, le stimulus principal qui module l'insuline dans le pancréas ne modifie pas les niveaux d'expression de l'insuline dans le thymus, et ceci avec des études in vivo et in vitro. J'ai par après aussi démontré que les cytokines pro-inflammatoires Ifn-γ et Tnf-α ont des effets régulateurs dans le thymus, et l'addition de ces cytokines aux lignées cellulaires mTECs réduit les niveaux de l'insuline. Dans les souris manquant les gènes pour ces cytokines l'expression de l'insuline et d'autres auto-antigènes augmente. En plus, ce mécanisme est indépendant du régulateur Aire et constitue la première observation montrant l'absence de correlation entre l'insuline et Aire. Un autre facteur qui modifie les niveaux de l'insuline est la co-culture des thymocytes avec les mTECs. Le contact direct des deux types de cellules a augmenté l'expression de l'insuline ainsi que l'expression de Aire. De plus, nous avons procédé à l'analyse du profil transcriptionnel d'ARN de deux souches clonales de mTECs, une qui exprime l'insuline et une qui ne l'exprime pas. Ces résultats ont permis une vue d'ensemble des gènes qui sont exprimés par un mTEC individuel, que auparavant était impossible. Un nouveau marqueur de surface a été ainsi identifié, CD34, qui est exprimé à plus haut niveau dans le clone positif pour l'insuline. Les cellules mTECs primaires qui expriment CD34 ont étés séparées et elles expriment un niveau élevé l'insuline et le Aire. Ces résultats ont démontrés des nouveaux mécanismes indépendants de Aire qui contrôlent l'expression de l'insuline comme auto-antigène dans les mTECs.

Short, repetitive G-rich DNA sequences present at telomeres are synthesized by telomerase, a ribonucleoprotein consisting of a catalytic subunit, the telomerase reverse transcriptase, TERT, and an integrally associated RNA, TR. Human TERT (hTERT) can repetitively reverse transcribe its short RNA template, acting processively to add multiple telomeric repeats onto the same DNA substrate. We investigated if threshold levels of telomerase activity and processivity are required to maintain telomere length and/or function and immortalize human cells with limited lifespan. Specifically, we assessed hTERT variants with mutations in several motifs implicated in processivity, namely the N terminus (E79A, E90K), RT motif 1 (I624M), the 'Insertion in Fingers' domain (V791Y), the C 'catalytic center' motif (L866Y), the E 'primer grip' motif (W930F) and the C terminus (∆1047-1056 and ∆1107-1118). The N-terminal and motif 1 hTERT mutants did not reveal any interesting phenotypes in vitro or in cells. On the other hand, the remaining variants, except L866Y, displayed a substantial decrease in processivity. Despite the presence of short telomeres in cells expressing these low processivity telomerase variants, only W930F could immortalize limited lifespan human cells. We demonstrate that limiting levels of DNA synthesis on the order of 20% of wild-type, and extension of as few as three telomeric repeats displayed by W930F are sufficient to maintain functional telomeres and immortalize limited lifespan human cells. The hTERT-C-terminal mutants likely could not immortalize cells due to synthesis of only 2 or less telomeric repeats. V791Y could not maintain telomere function due to a failure to localize to telomeres. On the other hand, L866Y displayed a 2-3 fold increase in proccessivity compared to wild-type telomerase. Cells expressing this mutant displayed telomere elongation followed by heterogenous telomere lengths and an increase in short telomeres, and fragile sites at telomeres accompanied by telomere trimming, indicating that processivity levels above that displayed by wild-type telomerase lead to telomere replication stress. These results suggest that telomere function and length, and immortalization in human cells are regulated by telomerase enzyme processivity. / Des courtes séquences répétées et G-riches d'ADN présentes aux télomères sont synthétisées par télomérase, une ribonucléoprotéine constituée d'une sous-unité catalytique, 'telomerase reverse transcriptase' ou 'TERT', et un ARN associé nommé 'TR'. TERT humain (hTERT) peut diriger de façon répétitive la transcription inverse de son ARN, agissant processivement en ajouteant de multiples répétitions télomériques sur le substrat d'ADN. Nous avons étudié si des niveaux limites d'activité ou de processivité de télomérase sont nécessaires pour maintenir la taille ou la fonction des télomères et pour immortaliser des cellules humaines possédant une durée de vie limitée. Plus précisément, nous avons évalué plusieurs variants de hTERT avec des mutations dans des motifs impliqués dans la processivité, incluant l'extrémité N-terminale (E79A, E90K), le motif 1 du Reverse Transcriptase (RT) (I624M), le domaine 'Insertion in Fingers' (V791Y), le motif C (L866Y), le motif E (W930F) et l'extrémité C-terminale (Δ1047-1056 et Δ1107-1118). Les mutations dans le terminus N et le motif 1 de hTERT n'ont pas révélées de phénotypes intéressants. Les autres variants, sauf L866Y, ont demontré une diminution substantielle des niveaux de processivité. Malgré la présence de télomères courts dans les cellules exprimant ces variantes de processivité faibles, seul W930F pouvait immortaliser les cellules. Nous démontrons que le niveau de synthèse d'ADN de l'ordre de 20% de hTERT sauvage, et l'extension de seulement trois répétitions télomériques par W930F sont suffisants pour maintenir des télomères fonctionnels et immortaliser les cellules. Les variants avec des mutations dans le terminus C ne pouvaient pas immortalizer les cellules dues à la synthèse de seulement 2 ou moins de répétitions télomériques. V791Y ne pouvait pas maintenir la fonction des télomères en raison d'une incapacité à se localiser aux télomères. D'autre part, L866Y a demontré une augmentation des niveaux de proccessivité de 2-3 fois par rapport à la télomérase sauvage. Les cellules exprimant ce mutant ont presenté un rallongement des télomères, suivi de télomères de tailles hétérogènes et une augmentation du nombre de télomères courts, accompagné d'une augmentation de sites fragiles aux télomères et de télomères tronqués, tout ce qui indique que des niveaux de processivité plus élevés que ceux du type sauvage mènent à des difficultés réplicatives aux télomères. Ces résultats suggèrent que la fonction et la taille des télomères, et l'immortalisation des cellules humaines sont réguléss par la processivité de l'enzyme télomérase.

Immunoglobulin superfamily, member 1 (IGSF1, formerly known as InhBP/p120) is a protein of unknown function, highly expressed in the pituitary gland. In this thesis, I characterized: 1) co- and post-translational processing of IGSF1, 2) expression of IGSF1 in several tissues, and 3) the link between IGSF1 and the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. The IGSF1/Igsf1 gene is located on the X chromosome, and multiple mRNA isoforms have been identified in both humans and mice. The canonical full-length protein is encoded by human mRNA isoforms IGSF1-1, IGSF1-3, and IGSF1-4, and murine Igsf1-1. Along with our collaborators, I demonstrated that the canonical full-length protein is co-translationally cleaved at an internal signal peptide into N-terminal (NTD) and C-terminal domains (CTD), and that N-linked glycosylation is important for trafficking of the CTD to the cell surface. I then investigated expression of IGSF1-CTD in the pituitary gland and several other tissues. Using a combination of approaches, I demonstrated Igsf1/IGSF1-CTD expression in anterior pituitary thyrotropes, somatotropes, and lactotropes, as well as in the murine hypothalamus and fetal liver. I also characterized the relative abundance of Igsf1 isoforms in the pituitary and hypothalamus, and the glycosylation patterns of IGSF1-CTD in different tissues.Finally, I sought to determine the function of IGSF1. Igsf1-deficient mice were previously generated by ablation of non-coding exon 1 (Igsf1Δex1). The mice were reported to be overtly normal, although analyses were largely limited to reproductive function, as IGSF1 had been predicted to play a role in the regulation of follicle-stimulating hormone synthesis. Our clinical collaborators identified mutations in IGSF1 in several male patients with central hypothyroidism. I showed that the disease-associated mutations lead to intracellular retention of the IGSF1-CTD protein, consistent with IGSF1 loss-of-function. Further, I analyzed HPT axis function of Igsf1-deficient male mice, and found that they phenocopy several features of the human disorder, thus confirming that loss of IGSF1 leads to central hypothyroidism. In addition, the mice have decreased pituitary thyroid-stimulating hormone (TSH) content and thyrotropin-releasing hormone receptor (Trhr) expression, suggestive of impaired TRH signaling. Overall, my work contributes to our understanding of IGSF1 expression, and describes a potential function for IGSF1 in regulating the HPT axis. Delineating molecular mechanisms of how IGSF1 acts in the pituitary gland to affect endocrine axes will contribute to the ongoing search for the function of this mysterious protein. / Le membre 1 de la superfamille des immunoglobulines (IGSF1, anciennement connu sous le nom InhBP/p120) est une protéine ayant une fonction inconnue, fortement exprimé dans la glande pituitaire. Dans cette thèse, j'ai caractérisé: 1) les processus co-et post-traductionnels de IGSF1, 2) l'expression de IGSF1 dans plusieurs tissus, et 3) le lien entre IGSF1 et l'axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT).Le gène IGSF1/Igsf1 est situé sur le chromosome X, et de multiples isoformes d'ARNm ont été identifiés chez les humains et les souris. La protéine canonique complète est codée par l'ARNm des isoformes IGSF1-1, IGSF1-3, et IGSF1-4 (homme), et Igsf1-1 (murine). Avec nos collaborateurs, j'ai démontré que la protéine canonique est clivé durant sa traduction en deux parts: le domaine N-terminal (NTD) et le domaine C-terminal (CTD) à cause d'un peptide signal interne, et que la N-glycosylation est importante pour le transport du CTD à la surface de la cellule. J'ai ensuite étudié l'expression d'IGSF1-CTD dans la glande pituitaire et de plusieurs autres tissus. En utilisant une combinaison d'approches, j'ai démontré l'expression d'Igsf1/IGSF1-CTD dans les thyrotropes, somatotropes, et lactotropes de l'hypophyse antérieure, ainsi que dans l'hypothalamus murin et le foie fœtal. J'ai également caractérisé l'abondance relative des isoformes Igsf1 dans l'hypophyse et l'hypothalamus, et les motifs de glycosylation des IGSF1-CTD dans différents tissus.Enfin, j'ai cherché à déterminer la fonction d'IGSF1. Des souris déficientes en Igsf1 ont été précédemment générées par l'ablation de l'exon 1 non-codant (Igsf1Δex1). Les souris ont été ouvertement normales, même si les analyses ont été largement limitées à la fonction de reproduction, comme cela avait été prédit IGSF1 à jouer un rôle dans la régulation de la synthèse de l'hormone folliculo-stimulante. Nos collaborateurs cliniciens ont identifiés des mutations dans IGSF1 dans plusieurs patients de sexe masculin atteints d'hypothyroïdie centrale. J'ai démontré que les mutations associées à la maladie causent la rétention intracellulaire de la protéine IGSF1-CTD, menant à une perte de fonction d'IGSF1. De plus, j'ai analysé la fonction de l'axe HPT des souris males déficientes en Igsf1, et j'ai constaté qu'ils phénocopient plusieurs traits de la maladie humaine, confirmant ainsi la perte de IGSF1 conduisant à l'hypothyroïdie centrale. En outre, les souris ont une diminution de thyrotropine (TSH) dans l'hypophyse et une diminution des récepteurs thyréolibérine (Trhr) suggérant une détérioration de la signalisation de thyréolibérine (TRH).Dans l'ensemble, mon travail contribue à notre compréhension de l'expression d'IGSF1, et décrit une fonction potentielle pour IGSF1 dans la régulation de l'axe HPT. La recherche des mécanismes moléculaires de la façon dont IGSF1 affecte les axes endocriniens dans l'hypophyse contribuera à la recherche permanente de la fonction de cette protéine mystérieuse.

Cancer and chronic pain are two common pathologies affecting millions of patients worldwide. Much like most other disease states, they can be determined genetically, environmentally, or both. Unlike the static genome, the epigenome is responsible for interpreting environmental interactions and is often altered in disease states. A subset of epigenetic modifications, known as DNA methylation, is capable of mediating gene silencing. In this thesis, two cases will be explored probing the nature of DNA methylation in cancer and in peripheral neuropathy. Aberrant DNA methylation is a common hallmark of cancer often resulting in the methylation of tumor suppressors and the demethylation of oncogenes. The identity of a DNA methylase, however, remains elusive. One candidate, methyl binding domain 2 (MBD2), has been previously characterized as a demethylase and also functions as a transcriptional repressor. One possible explanation for its role as a repressor may involve the direct activation of a repressor which can then mediate silencing. An attractive class of genes for this model are microRNAs, which are capable of binding several targets in the cell and mediate their silencing. We therefore test the hypothesis that MBD2 is capable of activating a microRNA which is capable of negatively-regulating target genes. In this thesis, we delineate mechanisms that demonstrate MBD2 is capable of binding a microRNA, mir-496, which is then capable of inducing itsiactivation. We further show that mir-496 can mediate a repressive action on three separate genes in the cell that have tumor suppressive roles in cancer. Chronic pain has been shown to alter gene expression and brain anatomy and is often accompanied with comorbidities that affect cognitive processing, sleep and anxiety. Interestingly, these changes have been shown to be reversible following effective treatment of pain, suggesting the mechanisms behind pain may also be reversible, thus prompting the study of pain epigenetics. We therefore proposed to test the hypothesis that the methylome and transcriptome are altered in the brain following peripheral nerve injury. We were able to identify a signature of DNA methylation and transcription specific to the prefrontal cortex and amygdala that accompanied peripheral nerve injury and behavioral signs of neuropathy. Furthermore we were able reverse behavioral signs of neuropathic pain and altered methylation states in the prefrontal cortex with environmental enrichment, demonstrating their reversible nature. Taken together, this thesis explores the role of DNA methylation in two complex diseases: through small scale processes in cancer and through broader changes at the level of the methylome and transcriptome in chronic pain. In identifying these molecular pathways and signatures, we hope to improve the mechanistic understanding of these pathologicaliistates, ultimately resulting in better treatment outcomes for millions of patients worldwide. / Le cancer et la douleur chronique sont deux pathologies courantes qui affectent des millions de personnes à travers le monde. Comme beaucoup d'autres états pathologiques, ils peuvent être déterminés génétiquement et par l'environnement. Contrairement au génome qui est statique, l'épigénome est responsable de l'interprétation des interactions avec l'environnement et est souvent altéré dans des états pathologiques. Un sous-ensemble de modifications épigénétiques, appelé méthylation de l'ADN, est capable de médier l'inactivation génique. Dans cette thèse, deux cas seront explorés pour sonder la nature de la méthylation de l'ADN dans le cancer et dans la neuropathie périphérique. Une méthylation de l'ADN aberrante est une caractéristique commune du cancer qui entraîne souvent la méthylation de gènes suppresseurs de tumeurs et la déméthylation d'oncogènes. L'identité d'une déméthylase de l'ADN, cependant, reste insaisissable. Un candidat, "methyl binding domain 2" (MBD2), a été précédemment caractérisé comme étant une déméthylase et fonctionnant également comme un répresseur transcriptionnel. Une explication possible pour son rôle en tant que répresseur pourrait impliquer l'activation directe d'un répresseur qui pourrait ensuite servir de médiateur de la répression. Une classe de gènes intéressante dans ce modèle est celle des microARN, qui sont capables de se lier à plusieurs cibles dans la cellule et de conduire à leur répression. Nous avons donc testé l'hypothèse que MBD2 serait capable d'activer un micro-ARN capable de réguler négativement les gènes cibles. Dans cette thèse, nous avons étudié les mécanismes qui démontrent que MBD2 est capable de se lier à un microARN, mir-496, qui est alors capable d'induire son activation. Nous montrons en outre que mir-496 peut servir de médiateur d'une action répressive sur trois gènes distincts qui ont des rôles de suppresseurs de tumeur dans les cellules cancéreuses. La douleur chronique a été montrée comme modifiant l'expression des gènes et l'anatomie du cerveau. Elle est souvent accompagnée de comorbidités qui touchent le traitement cognitif, le sommeil et l'anxiété. Fait intéressant, ces changements se sont montrés réversibles après un traitement efficace de la douleur, suggérant que les mécanismes à l'origine de la douleur pourraient aussi être réversibles, incitant ainsi à l'étude de l'épigénétique de la douleur. Nous avons donc proposé de tester l'hypothèse que le méthylome et le transcriptome seraient altérés dans le cerveau après une lésion nerveuse périphérique. Nous avons pu identifier une signature de méthylation de l'ADN et de transcription spécifique au cortex préfrontal et à l'amygdale qui accompagne une lésion du nerf périphérique et les signes comportementaux de la neuropathie. En outre, nous avons pu inverser les signes comportementaux de la douleur neuropathique et les niveaux de méthylation dans le cortex préfrontal par un enrichissement de l'environnement, démontrant ainsi leur caractère réversible. L'ensemble de cette thèse explore le rôle de la méthylation de l'ADN dans deux maladies complexes : au travers de processus à petite échelle dans le cancer et par des changements plus larges au niveau du méthylome et du transcriptome dans la douleur chronique. En identifiant ces voies moléculaires et les signatures épigénétiques, nous espérons améliorer la compréhension mécanistique de ces états pathologiques, ouvrant la voie à de meilleurs traitements pour des millions de patients dans le monde.

The objective of my research project was to study and characterize the transcriptional role of the CUX1 transcription factor both on a global scale and with regards to specific cellular processes. I have carried out genome-wide location analysis experiments to identify large numbers of potential direct targets of CUX1 and investigated their regulation by CUX1 using expression profiling experiments following both overexpression of the active p110 CUX1 isoform and following its knockdown using shRNA. This study demonstrated that CUX1 can both activate and repress its targets even when binding at a distance from their promoters and that its consensus binding sequence does play a role in its binding but is not required forit in many cases. Analysis of the putative targets of CUX1 identified by genome-wide location analysis strongly suggested a role for the factor in the cellular response of cells to DNA damage. I used molecular biology methods to investigate this and demonstrated that CUX1's transcriptional activity is required for the maintenance of adequate levels of several key proteins constituting the machinery necessary for an effective response to DNA damage. Cells lacking CUX1 expression have defective cell cycle arrest and DNA damage repair capacities, reduced survival following DNA damage and show a phenotype of increased genomic instability. Previous studies of a mouse model of mammary gland tumours showed that a subset of tumours from p110 and p75 CUX1 over-expressing mice display activation of the Wnt/β-Catenin pathway. However, the mechanism by which only some of these tumours displayed this phenotype were not fully understood. I used expression profiling on microdissected material from these tumours to characterize the transcriptional effect of p110 and p75 CUX1 expression in these tumours and to identify collaborating events in Wnt/β-Catenin pathway activation. I identified members of the GLI family of transcription factors as being required for activation of the Wnt/β-Catenin pathway in these tumours. I also showed that these tumours display features of epithelial to mesenchymal transition, which may have implications for the invasiveness and severity of these tumours. The cooperation between CUX1 and GLI genes was confirmed by meta-analysis of human tumour datasets as well as cell based assays testing the ability of each factor to activate the Wnt/β-Catenin pathway on their own and in combination. / L'objectif global de ma thèse était d'étudier et de caractériser l'activité transcriptionelle du facteur de transcription CUX1, autant de façon globale que dans le contexte de processus cellulaires spécifiques. J'ai effectué des expériences de localisation génomiques à grande échelle afin d'identifier un grand nombre de cibles potentielles directes de transcription de CUX1 et j'ai analysé leur régulation par CUX1 en effectuant des expériences de profilage d'expression génétique à la suite de la surexpression de l'isoform p110CUX1 ainsi qu'à la suite de la répression de CUX1 par shRNA. Cette étude a démontré que CUX1 peut activer ou réprimer l'expression de ces cibles, même lorsqu'il se lie à une distance considérable du promoteur de ces gènes, et que la séquence consensus de liaison de CUX1 joue un rôle dans sa liaison à l'ADN mais n'est pas nécessaire pour celle-ci dans plusieurs cas. L'analyse de cibles potentielles de CUX1 identifiées par des expériences de localisation génomique a grande échelle ont fortement suggéré l'implication de CUX1 dans la réponse des cellules au dommage à l'ADN. J'ai utilisé diverses techniques de biologie moléculaire pour étudier ce phénomène et j'ai démontré que l'activité transcriptionelle de CUX1 est nécessaire au maintien de niveaux suffisants de nombreuses protéines constituant la machinerie essentielle à la réponse des cellules au dommage à l'ADN. Les cellules n'exprimant pas ou peu de CUX1 sont déficientes dans leur capacité d'arrêt du cycle cellulaire et de réparation du dommage à l'ADN, sont plus sensibles au dommage et montrent un phénotype d'instabilité génomique accrue. Des études précédentes de tumeurs des glandes mammaires dans un modèle de souris ont montré qu'une partie des tumeurs provenant de souris surexprimant p110 ou p75 CUX1 montraient une activation du processus de signalement Wnt/β-Catenin. Cependant, le mécanisme par lequel seule une partie des tumeurs montrait ce phénotype n'était pas connu. J'ai donc effectué du profilage d'expression génétique sur ces tumeurs afin de caractériser l'effet transcriptionel de CUX1 dans celles-ci et d'identifier d'autres facteurs qui collaborent dans l'activation de Wnt/β-Catenin. J'ai ainsi identifié des membres de la famille de facteurs de transcription GLI comme étant requis pour l'activation de Wnt/β-Catenin dans ces tumeurs. J'ai aussi observé des caractéristiques de transition épithélio-mésenchymateuse dans ces tumeurs, ce qui pourrait avoir des implications sur la capacité d'invasion et la sévérité de celles-ci. La coopération entre CUX1 et les gènes GLI a été confirmée par une méta-analyse de données de profilage d'expression de tumeurs humaines ainsi qu'avec des expériences cellulaires testant la capacité de chacun de ces deux facteurs à activer Wnt/β-Catenin, individuellement et en combinaison.