Retinoblastoma (RB) is a tumour-suppressing protein involved in many cellular functions including: cell cycle regulation, cellular differentiation and cell death. In the past, its function has been intrinsically linked to its role in the cell cycle, wherein it acts as a key regulator of the G1 to S-phase transition checkpoint. However, evidence has emerged in support of cell cycle-independent roles for RB. In particular, it has been demonstrated that RB plays an important role in promoting normal animal development and survival to adulthood, a function that is conserved between mammals and metazoans. This role has been extensively studied using RBF1, the Drosophila melanogaster homolog of mammalian RB. An outstanding question in this field is whether or not the mutation of RB results in tissue-specific biological outcomes that ultimately affect adult viability. The results of this research thesis suggest that the mutation RBF1 can lead to tissue-specific developmental defects; however, the defects observed did not affect the ability of animals in surviving to adulthood. For example, a male germline-specific phenotype was observed when RBF1 expression was absent from germ cells. Adult male flies in which RBF1 expression was absent from the germline were sterile. Upon closer inspection, changes in germ cell number and patterning in the testes were observed. As well, an increase in cyclin E expression in RBF1-null mutants suggested that germ cells were being arrested at an early stage of spermatogenesis. A role for RBF1 in the fly germline has not been previously investigated. Therefore, this research project has identified a novel function of RBF1 with respect to germline regulation. Additionally, this research thesis also aimed to investigate whether RB interacted with a subset of known RB-associating factors in a tissue-specific manner. While this question was not completely addressed by the research presented herein, phosphorylation of Serine 728 on RBF1 was detected in vivo. This site was previously investigated in vitro and was suggested to be a putative phosphorylation target by cyclin/Cdk complexes. Therefore, the data of this research thesis have demonstrated the potential for this site to be phosphorylated in vivo. Further experimentation is required in order to verify the authenticity of this site as an endogenous target of phosphorylation. Overall, the data presented in this research thesis provide new insight into the various roles of RBF1 and the manner in which it is regulated. / Le rétinoblastome (RB) est une protéine classifiée comme suppresseur de tumeur. Elle joue plusieurs rôles importants dans la cellule, incluant: la régulation du cycle cellulaire, la différentiation cellulaire et l'apoptose. Dès sa découverte, le rétinoblastome a été caractérisé par son rôle primaire en règlant le cycle cellulaire dans lequel RB fonctionne comme régulateur de la transition entre la phase G1 et la phase S. Depuis ce temps, d'autres rôles pour RB indépendents de son fonctionnement dans le cycle cellulaire ont été identifiés. Notamment, il a été démontré que RB joue un rôle important dans la promotion de processus de dévelopement normal dans l'animal et la survie jusqu'à l'âge d'adulte. La plupart des recherches concentrant sur ce rôle ont été faites en utilisant la Drosophile, une espèce modèle qui convient à la manipulation génétique et en laquelle l'homologue de RB se nomme RBF1.Il reste plusieurs questions à rechercher à propos du rôle de RBF1 concernant la survie de l'animal jusqu'à l'âge d'adulte. Cette thèse essaie de répondre à la question suivante; est-ce que les effets biologiques résultant de mutater RBF1 sont spécifiques à des tissus particuliers, et est-ce qu'ils ont un effet sur l'abilité de la Drosophila de survivre jusqu'au stage d'adulte? Les résultats de cette thèse indiquent qu'en mutant RBF1, il est possible de produire des effets biologiques unique dans des tissus spécifiques. Quand même, aucun de ces effets ont affecté la survie de l'animal. Par example, il a été démontré que RBF1 joue un rôle unique dans le tissu gonade des mâles. Dans des Drosophiles qui n'expriment pas RBF1 dans les cellules de la lignée germinale, les adultes mâles étaient stériles. En examinant les testicules, le phénotype des cellules de la lignée germinale était différent en comparaison au phenotype sauvage. Aussi, le nombre de cellules da la lignée germinale qui expriment la cycline E avait augmenté. Précédemment, il n'y avait pas d'études qui ont recherché un rôle pour RBF1 dans la lignée germinale des Drosphiles mâles; donc, les résultats de cette thèse ont démontré un rôle unique pour RBF1 en régularisant la spermatogenèse dans les Drosophiles.En plus, cette thèse essaie de répondre à une autre question liée à celle ci-haut: est-ce que RB s'associe avec des macromolécules particulières (dont il est déjà connue à faire des associations), mais d'une manière unique à chaque tissu de la Drosophile? Les données de cette thèse ne donnent pas une réponse complète à cette question, mais elles ont identifié in vivo un site de phosphorylation (Sérine 728) sur RBF1. Ce site a déjà été recherché et a été suggéré in vitro d'être une cible de phosphorylation par les complexes Cdk-cyclines. Alors, les données présentées ci-haut démontrent que Sérine 728 peut être phosphorylé in vivo aussi. Plus de recherche est requis pour vérifier si ce site est un cible authentique de phosphorylation endogène in vivo. En conclusion, les données de cette thèse démontrent de nouvelles façons de régler le fonctionnement de RBF1, et elles présentent des informations nouvelles à propos des rôles variés de RBF1 dans la Drosophile.

Histone deacetylase inhibitors (HDACi) are anti-cancer agents, which have shown promising activity in hematological malignancies. However, only a small percentage of patients initially respond to treatment and all will eventually develop resistance. HDACi are known to inhibit deacetylation of histones as well as various non-histone proteins. Revealing mechanisms of HDACi resistance will help elucidate their modes of action, as well as help overcome de novo and acquired resistance in the clinic. We chose to conduct our studies on vorinostat, which is a pan-HDACi and the first HDACi to be approved by the FDA for cancer treatment. To study HDACi resistance in hematological malignancies, we developed two vorinostat resistant cell lines from the diffuse-large B cell lymphoma (DLBCL) cell line SUDHL6 and the monocytic-like lymphoma cell line U937, which is associated with acute myeloid leukemia (AML). The resistant clones are called SUDHL6-X and U937-B8. Our lab has previously shown that these clones are also cross-resistant to other HDACi (such as LBH). However they are highly sensitive to autophagy inhibitors such as chloroquine, suggesting that elevated autophagy is necessary to maintain vorinostat resistance. Endoplasmic reticulum (ER) stress is caused by an accumulation of misfolded proteins in the ER lumen. This causes a multifaceted response that is primarily cytoprotective called the unfolded protein response (UPR). The misfolded proteins that are deemed unsalvageable by the ER are targeted for degradation by the proteasome. We found that, in addition to elevated autophagy, vorinostat resistant cells have dilated ER and an accumulation of ubiquitinated proteins compared to their parental counterparts. Moreover, they show increased sensitivity to induction of cell death by the proteasome inhibitor bortezomib. We hypothesized that activation of UPR could be a mechanism of vorinostat resistance, because the UPR induces the upregulation of pro-survival genes and may induce autophagy. Understanding vorinostat resistance holds clinical relevance in terms of improving HDACi therapy and being able to identify subsets of patients who would benefit most from combination therapy such as vorinostat with bortezomib. / Les inhibiteurs d'histones deacetylases (HDACi) ont démontré des résultats prometteurs chez des patients atteints de cancers hématologiques. Cependant, une faible proportion de patients répondent favorablement à cette thérapie et de ce nombre, la presque totalité tombera en rechute. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires menant à la résistance aux HDACi permettra de surmonter la résistance acquise en clinique et, aiderait à développer des combinatoires permettant d'augmenter leur efficacité. Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux HDACi, nous avons développé des lignées cellulaires résistantes au vorinostat dans un modèle en culture de de lymphome diffus à grandes cellules B, les SUDHL6, et de lymphome d'apparence monocytique, les U937. Notre laboratoire a récemment démontré que ces lignées cellulaires résistantes, les SUDHL6-X et les U937-B8 sont également résistantes à plusieurs autres HDACi, tel le LBH589 (panobinostat). En contraste, ces lignées cellulaires présentent une plus grande sensibilité aux inhibiteurs d'autophagie que leurs lignées parentales respectives. L'autophagie est activée en réponse à un stress au niveau du réticulum endoplasmique (ER). Ce dernier est causée par un mauvais repliement des protéines nouvellement synthétisées, ce qui occasionne l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) ayant pour fonction entres autres, de diriger les protéines mal repliées vers la dégradation par le protéasome. Nous avons découvert que, les cellules résistantes au vorinostat présentent certaines caractéristiques de stress au niveau du ER dont notamment, un ER dilaté, et une accumulation considérable de protéines ubiquitinées contrairement à leur lignée parentale respective. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que l'activation de la réponse UPR est responsable de la survie des cellules résistantes. Par l'activation de gènes favorisant la survie et l'autophagie, l'activation de la réponse UPR pourrait être un mécanisme de résistance au vorinostat.

Patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) develop limb muscle atrophy partly due to proteasomal activation. Whether autophagy, a proteolysis pathway involved in organelles recycling, is also induced in limb muscles of COPD patients remains unclear. We investigate whether autophagy is induced in limb muscles of COPD patients and identify the mechanisms of initiation and maintenance of autophagy in these patients. Two studies were performed. Study 1 was aimed at counting autophagosome formation using electron microscopy in the vastus lateralis and tibialis anterior of control subjects and COPD patients. Study 2 was aimed at detecting LC3B protein lipidation (marker of autophagosome formation) and autophagy-related gene expression in the vastus lateralis of control subjects and COPD patients. Proteasome activation, oxidative stress and AKT, mTOR and AMPK pathway activation were also monitored. Autophagosome numbers were significantly greater in limb muscles of COPD patients compared to control subjects. LC3B protein lipidation and expression of autophagy-related genes in the vastus lateralis of COPD patients were significantly higher than control subjects. LC3B protein lipidation correlated negatively with thigh cross sectional areas and FEV1/FVC ratios. Autophagy induction was associated with inhibition of AKT and mTOR pathways and upregulation of AMPK and FOXO1 transcription factor expressions and with the development of oxidative stress in muscles of COPD patients. These results indicate that autophagy is significantly induced in limb muscles of COPD patients and the level of autophagy correlates with the severity of muscle atrophy and lung disease. / Les patients souffrant de la Broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) développent de l'atrophie musculaire des membres causée en partie par l'activation de la protéasome. L'implication de l'autophagie, une méthode de protéolyse utilisée pour le recyclage des organites, dans le développement de l'atrophie musculaire des patients de la BPCO n'est pas encore certaine. Nous investiguons si l'autophagie est induite dans l'atrophie musculaire des membres des patients de la BPCO et nous identifions le mécanisme de l'initiation et de la maintenance de l'autophagie dans ces patients. Deux études ont été conduites. La première étude visait à compter le nombre d'autophagosomes formés dans le vastus lateralis et le tibialis antérieur des patients contrôle et des patients de la BPCO en utilisant le microscope électronique. La deuxième étude consistait de la détection de la lipidation de la protéine LC3B (un marquer de formation d'autophagosome) et de mesuré l'expression de gènes liés a l'autophagie dans le vastus lateralis et le tibialis antérieur des patients contrôle et des patients de la BPCO. L'activation de la protéasome, le stresse oxydatif ainsi que l'activation des systèmes de l'AKT, mTOR et l'AMPK ont été surveillés. Le nombre d'autophagosome était largement augmenté dans les muscles des patients de la BPCO comparé aux contrôles. La lipidation de la protéine LC3B ainsi que l'expression des gènes de l'autophagie dans la vastus lateralis des patients de la BPCO étaient largement plus élevées comparé aux contrôles. Une corrélation inverse existe entre la lipidation de la protéine LC3B et l'aire de la section des cuisses et le rapport du FEV1/FVC (coefficient de Tiffeneau) des patients. L'induction de l'autophagie était associée avec l'inhibition des systèmes d'AKT et mTOR et l'augmentation de l'expression de l'AMPK et FOXO1. De plus, l'induction de l'autophagie correspondait avec le stress oxydatif dans les muscles des patients de la BPCO. Ces résultats indiquent que l'autophagie est induite significativement dans les muscles des membres des patients de la BPCO et que le niveau d'autophagie suit la sévérité d'atrophie des muscles et de la maladie du poumon.

Breast cancer is a heterogeneous disease, but is invariably associated with genome wide deregulation of transcription. The silencing of tumor suppressor genes (TSGs) in particular is thought to be an early, initiating event in many cancers. While re-expressing these genes is a clinically relevant goal, the development of therapeutics targeting the reactivation of TSGs has been hampered by a lack of understanding of the mechanisms responsible for TSG silencing. Recently, however, we have described a novel means through which several TSGs become silenced in cancer, which may highlight new therapeutic targets. This involves the epigenetic regulatory factor Ctcf which is critical for maintaining transcriptional activation and organizing chromatin at several TSG loci. In cells where these TSGs are silenced, the DNA binding of Ctcf to these TSGs is lost. This lack of DNA binding is associated with a loss of the post-translational modification by poly(ADP)ribosylation (known as PARylation). Aberrant dePARylation of Ctcf is associated with breast cancer progression, underscoring the importance of this Ctcf post-translational modification. We have novel data indicating that the dePARylating enzyme Parg is overexpressed in cancer. We hypothesize that inhibition of Ctcf PARylation by Parg disrupts normal epigenetic patterns at TSGs leading to subsequent gene silencing. We propose to examine the impact of Parg overexpression on the epigenetic programming and expression of Ctcf target genes, as well as the proliferation of breast epithelial cells. To determine the relevance of Parg in breast cancer, we have accumulated evidence from bioinformatics sources and through our own experimentation revealing an enrichment of Parg in a significant proportion of breast cancers. For instance, we have evidence from the Oncomine database and the UCSC Cancer Genome Browser that Parg is overexpressed at the mRNA level in 30-50% of breast cancers. Likewise, at the protein level, higher Parg expression is found in breast cancer cell lines compared to untransformed cell lines and is found to be enriched in more aggressive stages of a mouse tumor model. This is complemented with clinical breast tissue samples showing overexpression of Parg protein in breast cancer.In support of clinical data, we have generated Parg-overexpressing Mcf10a cells to assess the role of this protein in mediating cellular transformation. Interestingly, Parg overexpression induced cells to shift from an epithelial morphology to a mesenchymal one. This was met with a decrease in the rate of proliferation in vitro. The expression of the Parg transgene, however, was quickly lost and alludes to a significant role for Parg in cellular biology. Overexpression studies were complemented with drug and knockdown studies. This work illustrated that a shRNA knockdown of Parg was met with a significant decrease in cell growth. Similar results were obtained for cells treated with the Parg inhibitor, tannic acid. Use of this drug caused a decrease in the repressive histone mark H3K27me3 which we believe may restore the expression of silenced TSGs. Likewise, tannic acid induced DNA damage foci over the course of long treatments with the drug, suggesting that DNA damage, too, may contribute to the decrease in cellular proliferation observed. Ultimately, this work provides evidence for a therapeutic benefit of targeting Parg in breast cancer. / Le cancer du sein est une maladie hétérogène, invariablement associée à une perturbation de l'expression génique. Le silençage des gènes suppresseurs de tumeurs (GST) est l'un des phénomènes jouant un rôle lors de l'initiation du cancer. Si la réactivation de l'expression de ces gènes est une stratégie attractive sur le plan clinique, la mise au point de traitements efficaces a été entravée par la compréhension insuffisante des mécanismes responsables du silençage des GST. Récemment, de nouveaux mécanismes régulant le silençage des GST dans le contexte du cancer ont été décrit, ce qui pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Un des exemples concerne la protéine CTCF, un facteur essentiel au maintien de l'organisation de la chromatine et de l'activité transcriptionnelle à de nombreux loci du génome. Dans des cellules où des GST sont « silencés », la capacité de liaison de CTCF proche de ces gènes est perdue. La perte de cette liaison est due à l'abrogation d'une modification post-traductionnelle sur CTCF : la poly-(ADP)-ribosylation (aussi appelée PARylation). Selon notre hypothèse, l'inhibition de la PARylation de CTCF par l'enzyme PARG, responsable de la déPARylation, perturbe les patrons de modification épigénétiques normaux des GST, ce qui aboutit au silençage de ces gènes. Nous nous proposons d'analyser l'impact de la surexpression de PARG dans le cadre du cancer du sein sur la programmation des modifications épigénétiques et l'expression de gènes cibles de CTCF, ainsi que sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires.Dans un premier temps, nous avons recueilli des données de sources bio-informatiques et de nos propres expériences, et nous avons pu observer une surexpression de l'ARNm de PARG dans 30 à 50% des cas de cancer du sein (UCSC Cancer Genome Browser et Oncomine). De plus, les niveaux protéiques de PARG sont plus importants dans les lignées cellulaires de cancer du sein par rapport aux lignées cellulaires non transformées. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la lignée MCF10A (immortalisée mais non transformé) pour générer une lignée cellulaire surexprimant PARG afin d'évaluer le rôle de cette protéine dans la transformation cellulaire. Nous avons pu observer que les cellules surexprimant PARG étaient passées d'une morphologie épithéliale à une morphologie mésenchymateuse, et que leurs vitesses de prolifération avaient diminué. L'expression du transgène PARG a toutefois été rapidement perdue, ce qui laisse entrevoir le rôle significatif de PARG en biologie cellulaire.Dans un troisième temps, nous avons voulu observer les effets de la perte de PARG sur des lignées de cancer du sein en utilisant soit une drogue (acide tannique : TA) soit la technique des shARNs. Par ces deux méthodes, nous avons montré que la déplétion de PARG (ou inactivation) ralentie significativement la prolifération des cellules cancéreuses. De plus, le traitement avec l'acide tannique conduit d'une part à la formation de nombreux foyers de dommages à l'ADN, et d'autre part à la diminution de la marque répressive H3K27me3, ce qui pourrait conduire à la réexpression de GST. Enfin, ce travail permet de mettre en avant le potentiel de PARG comme cible thérapeutique dans le traitement du cancer du sein.

Soybean, Glycine max, (L.) Merr., is usually covered in trichomes and has three leaflets per compound leaf. Two mutant soybean cultivars, one without trichomes, cv. Glabrous, and the other with five leaflets per compound leaf, cv. 5-LF, are compared with a wild type cultivar to detect gene expression differences. Trichomes develop and differentiate from the epidermis and the fate of leaves, whether they are compound or simple, is decided in the meristem. Cell-specific gene expression of the epidermis as compared to the meristem is investigated in the three cultivars using Laser Capture Microdissection and high-throughput RNA sequencing. The results indicate about 200 differentially expressed genes in the two tissues (meristem and epidermis) of each of the three cultivars. The meristem had higher expression of genes containing sequence-specific DNA binding domains whereas the epidermis had higher expression of genes related to plant defense. / Soya, Glycine max, (L.) Merr., est généralement couvert de trichomes et possède trois folioles par feuille composée. Deux cultivars de soya mutant, un sans trichomes, cv. Glabrous, et un avec cinq folioles par feuille composée, cv. 5-LF, ont été comparés avec un cultivar sauvage pour étudier la différence dans l'expression des gènes. Comme les trichomes se développent et se différencient depuis l'épiderme et comme le sort des feuilles (qu'elle devienne composée ou simple) se décide au niveau du méristème, l'expression des gènes des cellules spécifiques de l'épidermes a été comparée au méristème dans les trois cultivars via un instrument de microdissection au laser ainsi qu'à l'aide de séquençage d'ARN à haute capacité. Les résultats indiquent qu'environ 200 gènes distincts dans les deux tissues (méristème et épiderme) ont été exprimés différemment dans chacun des trois cultivars. Le méristème avait une expression plus élevée de domaines de liaison à l'ADN spécifiques de séquence alors que l'épiderme avait une plus forte expression de gènes liés à la défense des plantes.

The ShcA adaptor protein is a key signaling molecule in the regulation of survival, angiogenesis, immune suppression and metastasis in breast cancer cells. The mammalian ShcA gene encodes three isoforms which are produced through alternative translation initiation (p46Shc, p52Shc) or different promoter usage (p66Shc). Although p46Shc and p52Shc are constitutively expressed and confer pro-tumorigenic signals, p66Shc levels vary in cancer cell lines. While activation of p66Shc through phosphorylation of its serine-36 (S36) is known to induce reactive oxygen species (ROS) formation, the role it plays in tumourigenesis is poorly understood. Our objective was to characterize the impact of p66Shc expression on mammary tumourigenesis both in vitro and in vivo. To this end, p66Shc-expressing vectors were stably transfected into two cell lines low in endogenous p66Shc; one driven by oncogenic ErbB2 activation (NIC-4360) and one lacking ErbB2 expression altogether (MDA-MB-231). These cells were characterized in vitro before being injected into the mammary fat pad (MFP) of immune-compromised mice for characterization in vivo. Our data revealed that while increased p66Shc expression promotes tumour initiation by way of increased angiogenesis, sustained p66Shc activation serves to decrease tumour cell proliferation. Our observation that p66Shc delayed tumour outgrowth in ErbB2-expressing cells also indicates a link between p66Shc activation and ErbB2 expression. The results of this study demonstrate that p66Shc confers both pro- and anti-tumourigenic properties, and that its role in mammary tumourigenesis is largely dependent on its ability to induce production of ROS. / La protéine adaptatrice ShcA est une molécule clé dans la régulation de la survie, de l'angiogénèse, de la suppression tumorale et des métastases des cellules cancéreuses du sein. Le gène ShcA, chez les mammifères, encode trois isoformes qui sont produites par site d'initiation alternatif pour la transcription (p46Shc, p52Shc) ou l'utilisation d'un différent promoteur (p66Shc). Malgré le fait que p46Shc et p52Shc soient constitutivement exprimés et confèrent un signal bénéfique aux tumeurs, les niveaux de p66Shc varient dans les lignées cellulaires cancéreuses. L'activation de p66Shc via la phosphorylation de Sérine36 (S36) est connue pour induire la formation de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS), toutefois le rôle que cela joue dans la tumorigénèse est mal compris. Notre objectif était de caractériser l'impact de l'expression de p66Shc sur la tumorigénèse mammaire, à la fois in vitro et in vivo. À cette fin, des vecteurs exprimant p66Shc ont été transfectés, de façon stable, dans deux lignées cellulaires ayant une expression endogène faible en p66Shc : une mû par l'activation de l'oncogène ErbB2 (NIC-4360), l'autre complètement exempte de ErbB2 (MDA-MB-231). Ces cellules ont été caractérisées in vitro avant leur injection dans les tissus graisseux mammaires de souris immunodéficientes pour la caractérisation in vivo. Nos données démontrent qu'une augmentation de l'expression de p66Shc promouvoit l'initiation tumorale via une augmentation de l'angiogénèse, toutefois une activation soutenue de p66Shc entraîne une diminution de la prolifération des cellules tumorales. Notre observation que p66Shc retarde la croissance tumorale dans les cellules exprimant ErbB2 dénote un lien entre l'activation de p66Shc et l'expression de ErbB2. Les résultats de cette étude démontrent que p66Shc confèrent des propriétés à la fois bénéfiques et néfastes pour les tumeurs, et que son rôle dans la tumorigénèse mammaire est largement dépendante de son habilité à induire la production de ROS.

At the restrictive temperature of 39(DEGREES)C, DNA synthesis in ts20, a temperature-sensitive mutant of Balb/3T3 cells, decreases progressively after an initial increase during the first 3 h while RNA and protein synthesis remains at a high level for 40 h. Infection with polyomavirus does not bypass the defect in cell DNA synthesis and the mutant does not support virus DNA replication at 39(DEGREES)C. The synthesis of form I and replicative intermediates of virus DNA at 39(DEGREES)C decrease at about the same rate. The block to cell DNA synthesis is reversible while the block to virus DNA synthesis is not. The defects in virus and cell DNA synthesis are expressed in vitro as reduced ('3)H-dTTP incorporation, consistent with the in vivo data. The addition of wild-type cell extracts complements the depressed cell DNA synthesis in vitro. The complementary factor is detectable in cytosol and can be partially purified. Analysis of virus DNA synthesized in vitro in the mutant cells with ts phenotype reveals an accumulation of DNA molecules migrating between form I and form II. This indicates a topological block in the mutant. Both the complementing activity and DNA topoisomerase I activity are extractable into cytosols. In extracts from mutant cells both activities are present in lower amounts and both are thermolabile. Ts20 is a DNA('ts) mutant whose defect blocks an early step in DNA chain elongation and includes the loss of DNA topoisomerase I activity. These studies provide evidence for a role for this enzyme at this step in eukaryotic DNA replication.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a cancer of the white blood cells (B cell lymphocytes). It is an indolent disorder that results in the accumulation of CD5+ B cells. In CLL, resistance to cell death is attributed to the overexpression of several key pro-survival proteins (i.e. B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and myeloid cell leukemia- 1 (Mcl-1)) that belong to the apoptotic Bcl-2 family of proteins. Bcl-2 and Mcl-1 overexpression deregulates both the apoptotic and autophagic signaling pathways and contributes to tumorigenesis. Oncolytic virotherapy has emerged as a novel anti-cancer therapy for the treatment of a variety of malignant disorders. Oncolytic virus (OV) Vesicular stomatitis virus (VSV)-AV1 takes advantage of genetic defects present within cancerous cells and preferentially targets and kills them. Normal cells are spared the cytotoxic effects of viral lysis and are left unharmed. CLL cells are largely resistant to VSV oncolysis due to an elevated protein expression level of Bcl-2 and Mcl-1 as well as the inhibitory interactions Bcl-2 and Mcl-1 form with pro-apoptotic and pro-autophagic proteins. It is a common approach to use combination therapy to overcome limitations with single agent treatment. In the studies presented within, VSV-AV1 treatment was combined with small-molecule Bcl-2 inhibitors as a means to overcome resistance to oncolytic virtotherapy observed in CLL patients.In the first strategic approach, we combined low-dose amounts of the pan–Bcl-2 inhibitor, Obatoclax, with VSV-AV1 and examined the effect on the apoptotic signaling pathway. Obatoclax and VSV-AV1 synergistically enhanced cell death in primary CLL cells. The combination therapy induced intrinsic apoptotic signaling through the activation of caspases-3 and -9 cleavage. Inhibitory complexes between Bcl-2:Bax and Mcl-1:Bak were disrupted as well. Pro-death protein, Noxa, was upregulated following VSV-AV1 infection and as identified as a critical mediator of apoptotic cell death..In the second approach, we examined VSV-AV1 virotherapy in combination with Bcl-2 inhibitors (Obatolcax or ABT-737) to elucidate the role of the autophagic pathway on cell death in primary CLL cells. We also investigated the crosstalk between the autophagic and apoptotic pathways following combination treatment. Bcl-2 inhibitor/VSV-AV1 therapy led to increased LC3-II and reduced p62 proteins levels, which signify the activation of autophagy. Inhibition of autophagy, with 3-methyladenine, significantly increased apoptotic cell death induced by Bcl-2 inhibitor/VSV-AV1 treatment. The combination therapy also abrogated Bcl-2:Beclin interactions thus stimulating the induction of autophagy.Altogether, our therapeutic strategies indicate that Bcl-2 inhibitors improve VSV-AV1 oncolysis in treatment-resistant hematological malignancies, such as CLL, with characterized defects in apoptotic and autophagic responses. / La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est un cancer qui affecte les globules blancs et provient de l'accumulation des lymphocytes B CD5+. La résistance à la mort cellulaire est attribuée à la surexpression de plusieurs protéines de pro-survie tel que « B-cell lymphoma 2 » (Bcl-2) et « myeloid cell leukemia (Mcl-1) » qui appartiennent à la famille de protéines apoptotiques Bcl-2. La surexpression de Bcl-2 et Mcl-1 dérégule les voies de signalisations apoptotiques et autophagiques et contribue au développement de la tumeur. La virothérapie oncolytique a démontré son efficacité comme nouvelle thérapie anticancéreuse pour le traitement de plusieurs types de tumeur. Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV)-AV1 est un virus oncolytique qui prend avantage des anomalies génétiques présentes dans les cellules cancéreuses pour préférentiellement infecter et détruire ces dernières tandis que les cellules normales sont épargnées de la lyse virale. Cependant, les cellules affectées par LLC sont tout de même résistante à l'oncolyse par VSV à cause d'un niveau d'expression élevé des protéines Bcl-2 et Mcl-1, et de leur effet inhibiteur sur les protéines pro-apoptotiques et pro-autophagiques. Les thérapies combinées permettent de dépasser les limites imposées par les traitements utilisant un seul agent anticancéreux. Dans la présente étude, le traitement oncolytique VSV-AV1 a été combiné avec un autre agent anticancéreux, une molécule inhibitrice de Bcl-2, pour surpasser la résistance au traitement oncolytique par VSV-AV1. Dans une première stratégie, nous avons combiné une faible dose d'Obatoclax, un inhibiteur de Bcl-2, avec VSV-AV1 et examiné l'effet sur la voie de signalisation apoptotique. Obatoclax et VSV-AV1 ont augmenté de façon synergique la mort cellulaire des cellules primaires isolées de patients atteints de LLC. La thérapie combinée a induit la signalisation apoptotique intrinsèque en activant la caspase-3 et caspase-9 ainsi qu'en séparant les complexes inhibiteurs Bcl-2:Bax et Mcl-1:Bax. De plus, l'expression de la protéine pro-apoptotique Noxa a augmenté suite à l'infection avec VSV-AV1 et il a été démontré que cet événement est critique pour enclencher la mort cellulaire par apoptose. Dans une deuxième stratégie, nous avons examiné le rôle de la voie de signalisation de l'autophagie dans la mort cellulaire des cellules primaire LLC suite à la thérapie oncolytique avec VSV-AV1 en combinaison avec Obatoclax ou ABT-737, deux inhibiteurs de Bcl-2. Nous avons étudié l'interaction entre l'autophagie et l'apoptose suite au traitement combiné et démontré que le traitement a augmenté le niveau de LC3-II et a réduit le niveau de la protéine p62, ce qui indique une activation de l'autophagie. En contrepartie, l'inhibition de l'autophagie avec le 3-methyladénine a augmenté de façon significative la voie apoptotique. La thérapie combinée a également bloqué l'interaction entre Bcl-2 et Bectin et par conséquent stimulé l'induction de l'autophagie. Les stratégies thérapeutiques examinées dans cette étude indiquent que les inhibiteurs de Bcl-2 améliorent l'oncolyse virale dans les leucémies résistantes aux traitements simples et qui sont caractérisées par des anomalies dans la réponse apoptotique et autophagique, tel qu'observé chez les patients atteints de LLC.

Auxins are an important class of phytohormones that play a critical role in various aspects of plant growth and development such as cell elongation, cell division, apical dominance, tropisms, and fruit ripening. The most abundant naturally occurring auxin is indole-3-acetic acid (IAA). IAA is found in plants both as the free acid and in conjugated forms. It is believed that the balance between IAA biosynthesis, metabolism, and transport determines the actual levels of IAA in a cell at any given time, but the molecular mechanisms controlling this regulation are largely unknown. In my thesis project, an IAA-alanine resistant mutant from Arabidopsis thaliana, iar4, has been phenotypically characterized and mapped to chromosome 1. Three mutants potentially defective in the last step of IAA biosynthesis have also been characterized. One of these mutants has been tested for complementation with a gene encoding a putative aldehyde oxidase, AtAO4.

Abstract Not Available.