Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2015-02-06T13:03:02Z No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-02-20T18:50:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-20T18:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KleberVânioGomesBarros.pdf: 1798973 bytes, checksum: d4bbf2bd5af07663a0994e98cdd68737 (MD5) / O desenvolvimento de metologias que permitam a purificação de biomoléculas de interesse industral é alvo de estudo devido sua importância comercial. Foi avaliada a purificação de proteases produzidas pelos fungos isolados do Cerrado, Penicillium fellutanum e Penicillium restrictum por extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (ATPS), composto por polietilenoglicol (PEG) e poliacrilato de sódio (NaPA). As duas fases no ATPS NaPA/PEG foram formadas através da mistura dos polímeros com um sal (NaCl) e caldo fermentado de P. fellutanum ou P. restrictum. Para os sistemas formados com o caldo fermentado de P. restrictum foram estudados o efeito da massa molar de PEG (2000, 4000 e 6000 g.mol-1), concentração de PEG (4, 6, 8 e 10% p/p), concentração de NaPA (4, 6, 8, 10, 15 e 20% p/p) e concentração do caldo fermentado (25, 35 e 45% p/p) na partição da enzima a 25 °C. Os valores do coeficiente de partição (K) obtidos variavam de 0,06 a 37,73, mostrando a versatilidade do método para a purificação da biomolécula sob investigação. Na maioria dos sistemas analisados conseguiu-se a partição da biomolécula de interesse para a fase oposta àquela das proteínas totais, proporcionando assim efetiva purificação da enzima. O maior K (partição preferencial na fase rica PEG) foi obtido usando-se: concentração de NaPA igual a 20% p/p, concentração de PEG 2000gmol-1 igual a 4% p/p e concentração de caldo fermentado igual a 45% p/p. Para grande número dos sistemas analisados foram obtidos elevados valores referentes ao balanço de massa (BM) indicando a estabilidade da enzima em relação aos componentes do sistema. Diversos sistemas analisados apresentaram elevados níveis de rendimentos (η) – alguns acima de 90%. Para os sistemas formados com o caldo fermentado de P. fellutanum foram analisados o efeito da massa molar de PEG (2000, 4000 e 6000 g.mol-1), a concentração de PEG (3, 6, 8 e 10 % p/p) e a concentração de NaPA (6, 8, e 10 % p/p) sobre o coeficiente de partição (K) a 25°C. Também foi analisada a influência da concentração de Na2SO4 (5, 10 e 15% p/p) na reextração da enzima. Os valores do coeficiente de partição K obtidos variaram de 1,21 até 77,51. A partição na fase superior foi maior em sistemas com maior concentração de NaPA, maior massa molar de PEG e menor concentração de PEG. Usando a estratégia de reextração foi possível direcionar a partição da protease para a fase oposta às demais proteínas, proporcionando assim uma etapa de prépurificação da biomolécula. Os resultados obtidos através dos APTS NaPA/PEG e posterior reextração com Na2SO4 demonstraram as potencialidades do método no processo de prépurificação de proteases a partir dos caldos fermentados de P. restrictum e P. fellutanum. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of metologias allowing purification of biomolecules of industrial interest is target of study because of its commercial importance. The partition of proteases produced by fungi of the Brazilian Cerrado, Penicillium fellutanum and Penicillium restrictum, in aqueous two-phase system (ATPS) composed of polyethylene glycol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA) was evaluated. The two phases in ATPS NaPA/PEG were formed by mixing the polymers with a salt (NaCl) and fermented broth of P. fellutanum or P. restrictum. For those systems formed with fermented broth of P. restrictum were studied the effect of molecular size of PEG (2000, 4000 and 6000 g.mol-1), PEG concentration (4, 6, 8 and 10% w/w), concentration NaPA (4, 6, 8, 10, 15 and 20% w/w) and fermented broth concentration (25, 35 and 45% w/w) in partitioning of enzyme at 25°C. The values of partition coefficient (K) obtained varied from 0.064 to 37.73, showing the versatility of the method for the purification of the biomolecule under investigation. In most systems examined it was achieved the partition of biomolecule in the opposite phase to that of total proteins and thus provide effective enzyme purification. The highest K (preferential partitioning in PEG-rich phase) was obtained using: 20% w/w of NaPA concentration, 4% w/w of PEG 2000 g.mol-1 and 45% w/w of broth concentration. For large number of systems analyzed, high values of BM were obtained indicating the stability of the enzyme in relation to system components. Several systems analyzed showed high levels of yield (η) - some over 90%. For those systems formed with the fermented broth of P. fellutanum were analysed the effect of molecular size of PEG (2000, 4000 and 6000 g.mol-1), PEG concentration (3, 6, 8 and 10% w/w) and NaPA concentration (6, 8, and 10% w/w) over the partition coefficient (K) at 25°C. It was also analyzed the influence of Na2SO4 concentration (5, 10 and 15% w/w) in the re-extraction of the enzyme. The values of partition coefficient K obtained ranged from 1.21 to 77.51. The partition in the upper layer was greater in systems with higher NaPA concentration, higher PEG molecular weight and lower PEG concentration. By using the re-extraction strategy it was possible to partition the target protease to the opposite phase to the other proteins, thereby providing a pre-purification step of the biomolecule. The results obtained by ATPS NaPA/PEG/NaCl and subsequent re-extraction with Na2SO4 demonstrated the potential of this method in the pre-purification of proteases from the fermentation broth of P. restrictum and P. fellutanum.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-27T14:25:47Z No. of bitstreams: 1 dhienifferferreiradecarvalho.pdf: 5689053 bytes, checksum: fec45b3ef7e9df5f96e4b20d31f2177e (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-13T13:02:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dhienifferferreiradecarvalho.pdf: 5689053 bytes, checksum: fec45b3ef7e9df5f96e4b20d31f2177e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-13T13:02:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dhienifferferreiradecarvalho.pdf: 5689053 bytes, checksum: fec45b3ef7e9df5f96e4b20d31f2177e (MD5) Previous issue date: 2011-12-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta dissertação foi utilizada a espectroscopia Raman intensificado por superfície (Surface Enhanced Raman Scattering – SERS) para monitorar a adsorção de moléculas de interesse biológico em superfície metálica de ouro ou cobre. Foram sintetizadas diferentes nanopartículas metálicas de ouro, variando-se a concentração, a ordem de adição dos reagentes e a temperatura em que as sínteses foram feitas. Através dos espectros de extinção dos coloides metálicos foi possível estimar a distribuição de tamanhos obtida em cada uma das sínteses, e as amostras foram também analisadas por medidas de microscopia eletrônica de varredura e espalhamento dinâmico de luz. As nanopartículas de cobre foram obtidas em meio aquoso, sofrendo oxidação da superfície com formação de óxido de cobre (II), cuja cinética foi acompanhada por espectros de extinção. Quando um adsorbato com caráter redutor foi adicionado à superfície metálica, houve redução do óxido de cobre, presente na superfície da nanopartícula, permitindo a obtenção do espectro SERS da forma oxidada da espécie adsorvida. A molécula que possibilitou o estudo deste mecanismo redox foi a p fenilenodiamina, sendo obtido o espectro SERS da espécie oxidada radical cátion. Serotonina, adrenalina, L-carnosina, melatonina, rifampicina e albumina sérica bovina foram os adsorbatos utilizados para a obtenção dos espectros SERS em coloide de ouro. Estas moléculas apresentam anéis aromáticos, que contribuem para uma elevada polarizabilidade molecular e por isso se espera elevado sinal SERS. Estas espécies também possuem átomos de nitrogênio e oxigênio, os quais estão disponíveis como sítios de coordenação para a interação com a superfície metálica. Para obtenção dos espectros SERS foram utilizadas diferentes radiações excitantes, na busca da ressonância com as transições do plasmon de superfície localizado das nanopartículas de ouro. Foi ainda realizado o cálculo teórico vibracional para cada um dos adsorbatos estudados, isolados ou coordenados a um ou mais átomos de ouro ou cobre, através dos quais foi realizada a atribuição dos espectros Raman e SERS dos sólidos e dos complexos de superfície formados, respectivamente. Através desta atribuição e das regras de seleção de superfície foi possível determinar a geometria de adsorção da biomolécula à superfície da nanopartícula metálica. / In this dissertation the Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) spectroscopy was used to monitor molecules with biological interest adsorbed on gold or copper metallic surfaces. Different gold metallic nanoparticles were synthesized varing the concentration, the addition order of the reagents and the temperature in which the syntheses were made. The size distributions were estimated for each colloid synthesis by the extinction spectra of the suspensions, and the samples were also analyzed by scanning electronic microscopy and dynamic light scattering techniques. Copper nanoparticles were obtained in aqueous media, undergoing surface oxidation with the formation of Cu(II) oxide, whose kinetic was followed by extinction spectra. When a reducer adsorbate was added to the nanoparticle suspension, the copper oxide, present in the metallic surfaces, undergoing reduction, allowing the achievement of SERS spectrum of the adsorbate in the oxidized form. The molecule which allowed the study of this redox mechanism was p-phenylenediamine, and the SERS spectrum was obtained from the radical cation species. Serotonin, adrenaline, L-carnosine, melatonin, rifampicin and bovine serum albumin were the adsorbates selected to obtain the SERS spectra in gold colloids. These molecules exhibit aromatic rings, whose is expected high contribution for the molecular polarizability, and in consequence of this a great SERS signal. Such species also have nitrogen and oxygen atoms, which are available coordination sites for interaction with the metallic surface. Different exciting radiations were used for searching of the resonance with the localized surface plasmon transitions of the gold nanoparticles. It was made the vibrational theoretical calculations for each studied adsorbate, isolated and coordinated to one or more gold or copper atoms, that were used for the assignment of Raman and SERS spectra of the solid and the surface complex, respectively. Through such assignment and the surface selection rules it was possible to determinate the adsorption geometry of biomolecule on the metallic surface.

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.

In the present work we performed electronic structure calculations within the Kohn-Sham scheme of the density functional theory (DFT). We studied two molecules with potential applications in life sciences and medicine: ferrioxamine B and 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)-21H,23H (TMPyP) porphyrin. We used different methods and different exchange and correlation functionals, analyzing optical and vibrational properties and hyperfine interactions. In the case of ferrioxamine B, results in the crystalline phase (molecular crystal), and gas phase were compared with experimental results obtained using Mössbauer spectroscopy from the literature. We analyzed hyperfine parameters such as the electric quadrupole splitting, asymmetry parameter, hyperfine field and isomer shift. In the case of TMPyP porphyrin we analyzed vibrational properties in the gas phase and optical properties. For the electronic absorption, solvent effects and electronic charges states were analyzed. / In the present work we performed electronic structure calculations within the Kohn-Sham scheme of the density functional theory (DFT). We studied two molecules with potential applications in life sciences and medicine: ferrioxamine B and 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)-21H,23H (TMPyP) porphyrin. We used different methods and different exchange and correlation functionals, analyzing optical and vibrational properties and hyperfine interactions. In the case of ferrioxamine B, results in the crystalline phase (molecular crystal), and gas phase were compared with experimental results obtained using Mössbauer spectroscopy from the literature. We analyzed hyperfine parameters such as the electric quadrupole splitting, asymmetry parameter, hyperfine field and isomer shift. In the case of TMPyP porphyrin we analyzed vibrational properties in the gas phase and optical properties. For the electronic absorption, solvent effects and electronic charges states were analyzed.

Um estudo experimental sobre os aspectos estruturais e dinâmicos de um complexo hidratado de fragmentos de DNA (150 pb) e fases lamelares de lipídios zwitteriônicos é apresentado. Variando-se a hidratação, é possível controlar o confinamento imposto por essa matriz hospedeira sobre os nucleotídeos inseridos na camada aquosa. O arranjo supramolecular do complexo é investigado por difração de raios X e técnicas de microscopia óptica e eletrônica. Um rico polimorfismo de mesofases é observado em função do confinamento. No regime mais hidratado, os fragmentos se distribuem segundo uma orientação nemática entre as membranas. À medida que a quantidade de água diminui, o confinamento das bicamadas sobre os nucleotídeos aumenta e correlações transmembranares aparecem, dando origem a fases altamente organizadas, com simetrias hexagonais 2D de DNA entre as lamelas. A incorporação completa de nucleotídeos é observada apenas quando grandes quantidades de DNA estão presentes. Esse fato aponta para importância maior de interações de volume excluído. Uma análise do parâmetro de Caillé mostra que as flutuações das membranas diminuem com a inserção de DNA. A partir dessas observações,é sugerido que a alteração das interações entre membranas, aliada à aparição de efeitos interfaciais entre DNA e membranas, é um mecanismo relevante no comportamento de fase. As propriedades dinâmicas dos nucleotídeos são investigadas através da técnica de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Um modelo recentemente desenvolvido para análise de difusão anisotrópica é testado com sucesso, demonstrando estreita correlação entre estrutura e dinâmica. / An experimental study on the structural and dynamical properties of a hydrated DNA zwitterionic lipids complex is presented. By varying the water amount, it is possible to control the connement imposed by this host matrix over the organization of the nucleotides inserted within the water layers. The supramolecular assembly is investigated by X-rays diraction and techniques involving both optical and electron microscopy. A rich polymorphism of mesophases is observed as a function of connement. In the more hydrated regime, the fragments are distributed according to nematic orientation in-between lamellae. As the water amount decreases, the connement of bilayers over the particles increases and transmembrane correlations appear, giving raise to highly-ordered phases, with 2D-hexagonal symmetries of DNA embodied in the lamellar phase. The full incorporation of nucleotides by the lamellar phase is observed only in the presence of large amounts of DNA. This nding points to the major importance of excluded volume interactions. An analysis of the Caillé parameter shows that the insertion of DNA reduces the fluctuations of membranes. From these observations, it is suggested that changes in the interactions between bilayers, together with the appearance of interfacial eects between DNA and membranes, are a relevant mechanism for the phase behavior of these systems. The dynamical properties of nucleotides are investigated through the fluorescence recovery after photobleach (FRAP). A model recently developed for analyses of anisotropic difusion is sucessfully tested, demonstrating a close relationship between structure and dynamics.

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.

Este trabalho de mestrado trata da implementação de um espectrômetro de correlações angulares perturbadas no Laboratório do Acelerador Pelletron do Instituto de Física da Universidade de São Paulo. O espectrômetro é formado por seis detectores cintiladores com cristais de \'BaF IND.2\', de 3 polegadas de diâmetro por 6 de comprimento, com um sistema eletrônico e de aquisição de dados multiparamétrico padrão CAMAC. Diferentemente do usual, os espectros de energia dos raios gama dos núcleos de prova são adquiridos para cada detector, o que permite manter um controle maior sobre todo o experimento. Além disso, um mesmo experimento pode ser revisto com diferentes abordagens por diversas vezes, pois todas as informações sobre ele são armazenadas. Com a configuração eletrônica adotada, os espectros de energia são obtidos por meio de um QDC (charge to digital converter), dispensando o uso de pré-amplificadores. Os espectros de tempo são adquiridos com um TDC (time do digital converter). A seleção dos eventos de coincidência é realizada computacionalmente, procedimento que pode ser realizado durante a aquisição dos dados. Como a motivação para a implementação desse espectrômetro é o estudo de estruturas e interações de biomoléculas por meio da técnica de correlações angulares (PAC), foram realizadas medidas exploratórias, com o uso do espectrômetro do Laboratório de interações Hiperfinas (LIH) do Centro do Reator de Pesquisas (CRPq) no IPEN, paralelamente à implementação do espectrômetro. As primeiras medições foram realizadas com amostras de vesículas lipídicas. Com essas medidas foi possível notar a influência da variação de tamanho das moléculas (diminuição de tamanho em uma ordem de grandeza) no tempo de correlação rotacional à temperatura ambiente, quando adicionado SDS (sodium dodecyl sulfate) na suspensão para formação de um agregado micelar. As duas séries de medidas seguintes foram realizadas com amostras de SDS nas quais variaram-se as concentrações para se tentar verificar alterações na geometria ou na mobilidade das moléculas em função desse parâmetro. Foi possível notar que o comportamento das funções perturbação experimentais variaram com as amostras, porém não foi possível notar sistemática no comportamtento. Outro fator notado foi a influência do meio. O comportamento das moléculas quando na presença de metanol nas amostras era bem diferente das soluções aquosas. Também não foi possível obter uma conclusão clara quanto à concentração micelar crítica para soluções aquosas. Por fim foram realizadas medidas com amostras de proteína calmodulina. Foram feitas medidas à temperatura ambiente e a 77K. Notou-se que essa proteína é passível de ser estudada por meio da técnica PAC. Para confirmar a presença da proteína nas amostras e também tentar verificar um deslocamento na massa devido à presença do íon \'ANTPOT.111 Cd\' \'ANTPOT.2+\' foram realizadas medidas de espectrometria de massas no Laboratório de Espectrometria de Massas na Embrapa em Brasília. Foi possível confirmar a presença da proteína nas amostras, porém não foi possível notar a presença de \'ANTPOT.111 Cd\' devido à baixa concentração de íons utilizados com a técnica PAC. / This work is related to the implementation of a perturbed angular correlation (PAC) spectrometer at the University of São Paulo Pelletron Laboratory. The spectrometer consists of 6 cylindrical BaF$_2$ scintillator detectors, with 3 inches diameter and 6 inches length and a multiparameter CAMAC data acquisition system. Different from usual, the gamma ray energy spectra of the cascade nuclei are acquired for each detector, which allows us to have more control of the experiment. Besides, the same experiment can be revised with different approaches at any time. With the adopted electronics configuration, the energy spectra are obtained through a QDC (charge to digital converter) module, which dispenses the use of pre-amplifiers. The time spectra are acquired with a TDC (time to digital converter) module. The selection of coincidence events is performed computationally, and this procedure can be evaluated during the data acquisition. The main motivation for implementing this spectrometer is the study of the structure and interactions of biomolecules through the perturbed angular correlation technique. Test measurements were performed, parallel to the spectrometer construction, with the use of the Hyperfine Interactions Laboratory spectrometer at the Centro do Reator de Pesquisas do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (CRPq-IPEN). The first measurements were performed with lipidic vesicles samples. In this case it was possible to observe the influence of the molecule dimension change (decrease in one order) on the rotational correlation time at room temperature, when SDS (sodium dodecyl sulfate) was added in the suspension to form micellar aggregation. The two following series of measurements were performed with SDS samples in which the concentration was varied in order to verify modifications in the geometry or mobility of the molecules as a function of that parameter. The behavior of the experimental perturbation functions varied with the samples. However, it was not possible to point out any systematics in their behavior. The molecules behavior when in presence of methanol in the samples was very different from the aqueous solutions. Also, it was not possible to obtain a clear conclusion about the critical micellar concentration for the aqueous solutions. Finally, the last measurements were performed with calmodulin protein samples, at room temperature and at 77K. In this case we concluded that this protein can be studied through the PAC technique. In order to confirm the presence of the protein in the samples and at same time to verify if any mass displacement occurred due to the presence of the $^{111}$Cd$^{2+}$, mass spectrometry measurements were performed at the Laboratório de Espectrometria de Massas -- Embrapa in Brasília. It was possible to confirm the presence of the protein in the samples, but it was not possible to observe the mass displacement due to the presence of the $^{111}$Cd, since the ions concentration used with the PAC technique is very low.

Orientador: Jorge Fernando Brandão Pereira / Banca: Carlota de Oliveira Rangel Yagui / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: A L-asparaginase destaca-se como um importante biofármaco utilizado no tratamento de leucemia, além da sua utilização na indústria alimentícia. Seu alto custo de produção se deve principalmente às etapas de purificação, que correspondem em geral a mais de 70% do valor do produto final. Assim, novos processos de extração líquido-líquido, como a aplicação de Sistemas Aquosos Bifásicos (SABs), surgem como técnicas alternativas de extração/purificação mais econômica e biocompatível. Nesse sentido, este trabalho avaliou um processo alternativo para a purificação de baixa resolução da enzima L-asparaginase (ASNase) utilizando-se SABs com polímeros e sais ou líquidos iônicos (LIs). Inicialmente, foi realizado um estudo comparativo de diferentes metodologias de quantificação da atividade da ASNase comercial, a fim de compreender as interferências dos métodos em diferentes condições, e assim estabelecer um método de quantificação adequado para determinação da atividade de ASNase nos SABs. A seguir, a estabilidade da ASNase foi avaliada frente aos diferentes componentes de fases dos SABs. Dessa forma, LIs derivados de colinas e polímeros foram testados como solventes alternativos na biocatálise, e a fim de compreender o efeito do tamanho da cadeia do ânion dos LIs sob a estabilidade da enzima, foram testadas soluções aquosas contendo as colinas com os seguintes ânions: cloreto ([Ch]Cl); acetato ([Ch][Ac]); propanoato ([Ch][Pro]); butanoato ([Ch][But]) e hexanoato ([Ch][Hex]). O aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: L-asparaginase (ASNase) is an important biopharmaceutical used in the treatment of leukemia, as well in industrial food processes. Its high production costs are mainly due to purification steps, in general, up to 70% of the final product value. Therefore, new liquid-liquid extraction processes, such as Aqueous Biphasic Systems (ABS), have appeared as more economical and biocompatible extraction/purification alternatives. In this work an alternative process for the purification of the enzyme L-asparaginase (ASNase) using ABS composed of polymers and salts or ionic liquids (ILs) was evaluated. In the first stage, a comparative study of different activity quantification methods of the commercial ASNase was carried out. This study intended to determine the interferences of the quantification methods and to establish the most adequate method for the quantification of ASNase activity after the extraction with different ABS. Further, the stability of the ASNase in the presence of different type and concentration of phase-forming agents, namely cholinium based-ILs ([Ch]+ -ILs) and polymers, was evaluated. Thus, in order to understand the effect of the increase of anion alkyl chain length of the ILs in the enzyme stability, aqueous solutions of [Ch]+ -ILs, with the following anions, were tested: chloride ([Ch]Cl), acetate ([Ch][Ac]), propanoate ([Ch][Pro]), butanoate ([Ch][But]) and hexanoate ([Ch][Hex]). The increase of the anion alkyl chain length had a negative effect on the enzymatic activity due to the affinity of these compounds to the protein structure. [Ch]Cl and [Ch][Ac] were selected as the best alternative solvents, because of their ASNase stability aptitude, as well enzymatic activity enhancing effect. The stability and activity of ASNase in aqueous solutions of polyethylene glycol... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Este trabalho de mestrado trata da implementação de um espectrômetro de correlações angulares perturbadas no Laboratório do Acelerador Pelletron do Instituto de Física da Universidade de São Paulo. O espectrômetro é formado por seis detectores cintiladores com cristais de \'BaF IND.2\', de 3 polegadas de diâmetro por 6 de comprimento, com um sistema eletrônico e de aquisição de dados multiparamétrico padrão CAMAC. Diferentemente do usual, os espectros de energia dos raios gama dos núcleos de prova são adquiridos para cada detector, o que permite manter um controle maior sobre todo o experimento. Além disso, um mesmo experimento pode ser revisto com diferentes abordagens por diversas vezes, pois todas as informações sobre ele são armazenadas. Com a configuração eletrônica adotada, os espectros de energia são obtidos por meio de um QDC (charge to digital converter), dispensando o uso de pré-amplificadores. Os espectros de tempo são adquiridos com um TDC (time do digital converter). A seleção dos eventos de coincidência é realizada computacionalmente, procedimento que pode ser realizado durante a aquisição dos dados. Como a motivação para a implementação desse espectrômetro é o estudo de estruturas e interações de biomoléculas por meio da técnica de correlações angulares (PAC), foram realizadas medidas exploratórias, com o uso do espectrômetro do Laboratório de interações Hiperfinas (LIH) do Centro do Reator de Pesquisas (CRPq) no IPEN, paralelamente à implementação do espectrômetro. As primeiras medições foram realizadas com amostras de vesículas lipídicas. Com essas medidas foi possível notar a influência da variação de tamanho das moléculas (diminuição de tamanho em uma ordem de grandeza) no tempo de correlação rotacional à temperatura ambiente, quando adicionado SDS (sodium dodecyl sulfate) na suspensão para formação de um agregado micelar. As duas séries de medidas seguintes foram realizadas com amostras de SDS nas quais variaram-se as concentrações para se tentar verificar alterações na geometria ou na mobilidade das moléculas em função desse parâmetro. Foi possível notar que o comportamento das funções perturbação experimentais variaram com as amostras, porém não foi possível notar sistemática no comportamtento. Outro fator notado foi a influência do meio. O comportamento das moléculas quando na presença de metanol nas amostras era bem diferente das soluções aquosas. Também não foi possível obter uma conclusão clara quanto à concentração micelar crítica para soluções aquosas. Por fim foram realizadas medidas com amostras de proteína calmodulina. Foram feitas medidas à temperatura ambiente e a 77K. Notou-se que essa proteína é passível de ser estudada por meio da técnica PAC. Para confirmar a presença da proteína nas amostras e também tentar verificar um deslocamento na massa devido à presença do íon \'ANTPOT.111 Cd\' \'ANTPOT.2+\' foram realizadas medidas de espectrometria de massas no Laboratório de Espectrometria de Massas na Embrapa em Brasília. Foi possível confirmar a presença da proteína nas amostras, porém não foi possível notar a presença de \'ANTPOT.111 Cd\' devido à baixa concentração de íons utilizados com a técnica PAC. / This work is related to the implementation of a perturbed angular correlation (PAC) spectrometer at the University of São Paulo Pelletron Laboratory. The spectrometer consists of 6 cylindrical BaF$_2$ scintillator detectors, with 3 inches diameter and 6 inches length and a multiparameter CAMAC data acquisition system. Different from usual, the gamma ray energy spectra of the cascade nuclei are acquired for each detector, which allows us to have more control of the experiment. Besides, the same experiment can be revised with different approaches at any time. With the adopted electronics configuration, the energy spectra are obtained through a QDC (charge to digital converter) module, which dispenses the use of pre-amplifiers. The time spectra are acquired with a TDC (time to digital converter) module. The selection of coincidence events is performed computationally, and this procedure can be evaluated during the data acquisition. The main motivation for implementing this spectrometer is the study of the structure and interactions of biomolecules through the perturbed angular correlation technique. Test measurements were performed, parallel to the spectrometer construction, with the use of the Hyperfine Interactions Laboratory spectrometer at the Centro do Reator de Pesquisas do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (CRPq-IPEN). The first measurements were performed with lipidic vesicles samples. In this case it was possible to observe the influence of the molecule dimension change (decrease in one order) on the rotational correlation time at room temperature, when SDS (sodium dodecyl sulfate) was added in the suspension to form micellar aggregation. The two following series of measurements were performed with SDS samples in which the concentration was varied in order to verify modifications in the geometry or mobility of the molecules as a function of that parameter. The behavior of the experimental perturbation functions varied with the samples. However, it was not possible to point out any systematics in their behavior. The molecules behavior when in presence of methanol in the samples was very different from the aqueous solutions. Also, it was not possible to obtain a clear conclusion about the critical micellar concentration for the aqueous solutions. Finally, the last measurements were performed with calmodulin protein samples, at room temperature and at 77K. In this case we concluded that this protein can be studied through the PAC technique. In order to confirm the presence of the protein in the samples and at same time to verify if any mass displacement occurred due to the presence of the $^{111}$Cd$^{2+}$, mass spectrometry measurements were performed at the Laboratório de Espectrometria de Massas -- Embrapa in Brasília. It was possible to confirm the presence of the protein in the samples, but it was not possible to observe the mass displacement due to the presence of the $^{111}$Cd, since the ions concentration used with the PAC technique is very low.

Este trabalho apresenta a síntese e a caracterização de quatro complexos trinucleares de acetato de rutênio, de fórmula geral [Ru3O(CH3COO)6(L)2(CO)] nos quais L são ligantes N-heterocíclicos 4-aminopiridina, isonicotinamida, 4-(dimetil)aminopiridina e 2,6-dimetilpirazina com características -aceptoras ou -doadoras. Os derivados de rutênio foram sintetizados de acordo com adaptações de rotas sintéticas já reportadas na literatura, e caracterizados por meio de técnicas de cunho espectroscópico, eletroquímico e outras, a saber: análise elementar, 1H RMN, absorção UV-vis, infra-vermelho, voltametria cíclica e difração de raios-X. Foi investigada a liberação fotoinduzida de monóxido de carbono proveniente dos complexos trinucleares em acetonitrila, por meio de acompanhamento espectrofotométrico. O rendimento quântico envolvido na liberação do CO foi calculado por meio de actinometria química. Foi estudada a interação entre os complexos com as biomoléculas HSA e o DNA de timo de bezerro por meio das técnicas espectroscópicas de fluorescência, UV-vis e dicroísmo circular. Além disso, foram realizados ensaios preliminares in vitro para avaliar a citotoxicidade dos complexos frente a uma linhagem de células de melanoma murinho (B16F10) e foi avaliada a atividade tripanocida dos complexos sobre a forma amastigota do parasita Tripanossoma cruzi. / This work describes the synthesis and characterization of four ruthenium trinuclear complex of general formula [Ru3O(CH3COO)6(CO)(L)2] where L = 2,6-dimethylaminopyridine; isonicotinamide; 4-aminopyridine and 4-dimethylpyrazine (N-heterocyclic ligands with -acceptor or -donor characteristics). The ruthenium derivatives were synthesized according to adaptations of synthetic routes already reported in literature and characterized by spectroscopic and electrochemical techniques such as nuclear magnetic ressonance (NMR), UV-vis, infrared, cyclic voltammetry, X-ray diffraction and elemental analysis. The photoinduced release of carbon monoxide in acetonitrile was investigated by means of spectrophotometric monitoring. The quantum yield involved in the CO release was calculated by chemical actinometry. It was studied the interaction between the complexes with the biomolecules HSA and calf thymus DNA by spectroscopic techniques of fluorescence, UV-vis and circular dichroism. In addition, preliminary tests were performed in vitro in order to evaluate the cytotoxicity of the complexes against a murine melanoma cell line (B16F10) and trypanocidal activity of the complexes over the amastigote form of the parasite Trypanosoma cruzi.