Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la incidencia de E. coli formadora de biopelículas y resistente a antibióticos aisladas del Hospital Cayetano Heredia, se lleva a cabo un estudio observacional, descriptivo, prospectivo y serie de casos donde se recolectaron 100 cepas de E.coli aisladas de muestras de orina de pacientes con ITU del Hospital de biopelículas por microtitulación con tinción de CV, durante noviembre a diciembre del 2017, se verifican sus características fenotípicas en agar MacConkey y la prueba bioquímica IMVIC, además se realiza el ensayo caracterización molecular por PCR convencional para el gen usp, y Multiplex PCR para los genes fim H, hly A, agn 43, electroforesis y antibiograma mediante difusión de discos. / Tesis

Tesis por compendio / [ES] Se ha estimado que obtenemos más de las tres cuartas partes del nitrato que ingerimos de la fruta y la verdura. Los vegetales ricos en nitratos incluyen verduras de hoja verde y ciertos tubérculos (p. ej., remolachas y rábanos). Las glándulas salivales concentran activamente el nitrato plasmático, lo que da lugar a concentraciones elevadas de nitrato en la saliva (5 a 8 mM) después de una comida rica en nitratos. El nitrato es un factor ecológico que puede inducir cambios rápidos en la estructura y función de las comunidades polimicrobianas. Sin embargo, los efectos sobre la microbiota oral no se han estudiado en detalle, mientras que un número limitado de estudios previos a esta tesis indican que es probable que el nitrato sea beneficioso para la salud bucal. El objetivo de esta tesis es, por tanto, estudiar los cambios microbiológicos inducidos por nitratos e identificar posibles mecanismos de homeostasis generados por este compuesto, con el fin de determinar si el nitrato puede considerarse un prebiótico para la salud bucal. Un segundo objetivo fue aislar cepas reductoras de nitrato y probar su potencial probiótico in vitro. En el capítulo 1, se realizó un estudio in vitro para testar el efecto del nitrato 6,5 mM en comunidades orales cultivadas a partir de la saliva de 12 individuos sanos. En el capítulo 2, se obtuvieron 53 aislados de bacterias reductoras de nitrato y se probó el efecto de seis candidatos a probióticos en comunidades orales sanas cultivadas a partir de saliva de diferentes donantes con o sin nitrato 6,5 mM. En el capítulo 3, se estudió el efecto de un extracto de remolacha rico en nitrato sobre la acidificación oral después de un enjuague con azúcar en 24 individuos sin caries activas. Se tomaron sobrenadantes (capítulos 1 y 2) o muestras de saliva (capítulo 3) para mediciones de nitrato, nitrito, amonio, lactato y pH. Además, la composición bacteriana de la biopelícula in vitro y del pellet salivar se determinó usando secuenciación Illumina del rRNA 16S y/o qPCR del género nitratorreductor Rothia. Los datos demuestran que el nitrato estimula el crecimiento de los géneros beneficiosos Rothia y Neisseria en nuestro modelo in vitro, mientras que potencialmente disminuye las bacterias asociadas a la caries, la halitosis y la enfermedad periodontal. Además, los datos in vitro e in vivo presentados en esta tesis indican que el nitrato puede limitar o prevenir caídas de pH cuando los azúcares son fermentados por la microbiota oral, un mecanismo de resiliencia que podría ser estimulado por el consumo de extractos vegetales ricos en nitratos. Los principales mecanismos de amortiguación del pH por parte del nitrato son el uso de acido láctico durante la desnitrificación (observado tanto in vivo como in vitro) y durante la reducción de nitrito a amonio, así como la producción potencial de amoníaco (observado in vitro). En esta tesis, los efectos del nitrato se observaron después de períodos cortos, es decir, después de 5-9 h de incubación in vitro y 1-4 horas después de la ingesta del suplemento de nitrato in vivo. Los estudios futuros deberían centrarse en los efectos longitudinales de la ingesta diaria de nitratos. En el capítulo 2, se aislaron bacterias reductoras de nitrato pertenecientes a los géneros Rothia y Actinomyces. Una selección de aislados de Rothia aumentó el uso de lactato y la capacidad de reducción de nitratos de las comunidades bucales, lo que potencialmente beneficiaría la salud dental y la salud sistémica, respectivamente. Los datos in vitro e in vivo presentados en esta tesis sugieren que el nitrato puede modular la microbiota oral en aspectos que son beneficiosas para el huésped y, por lo tanto, podría considerarse una sustancia prebiótica para la microbiota oral. Además, los aislados reductores de nitratos pueden estimular los efectos beneficiosos del metabolismo del nitrato, sobre todo en personas con bajos niveles de estas bacterias. / [CA] S'ha estimat que obtenim més de les tres quartes parts del nitrat que ingerim de la fruita i la verdura. Els vegetals rics en nitrats inclouen verdures de fulla verda i uns certs tubercles (p. ex., remolatxes i raves). Les glàndules salivals concentren activament el nitrat plasmàtic, la qual cosa dona lloc a concentracions elevades de nitrat a la saliva (5 a 8 mm) després d'un menjar ric en nitrats. El nitrat és un factor ecològic que pot induir canvis ràpids en l'estructura i funció de les comunitats polimicrobianes. No obstant això, els efectes sobre la microbiota oral no s'han estudiat detalladament, mentre que un nombre limitat d'estudis previs a aquesta tesi indiquen que és probable que el nitrat siga beneficiós per a la salut bucal. L'objectiu d'aquesta tesi és, per tant, estudiar els canvis microbiològics induïts per nitrats i identificar possibles mecanismes d'homeòstasi generats per aquest compost, amb la finalitat de determinar si el nitrat pot considerar-se un prebiòtic per a la salut bucal. Un segon objectiu va ser aïllar soques reductores de nitrat i provar el seu potencial probiòtic in vitro. En el capítol 1, es va realitzar un estudi in vitro per a testar l'efecte del nitrat 6,5 mm en comunitats orals cultivades a partir de la saliva de 12 individus sans. En el capítol 2, es van obtindre 53 aïllats de bacteris reductors de nitrat i es va provar l'efecte de sis candidats a probiòtics en comunitats orals sanes cultivades a partir de saliva de diferents donants amb o sense nitrat 6,5 mm. En el capítol 3, es va estudiar l'efecte d'un extracte de remolatxa ric en nitrat sobre l'acidificació oral després d'un glopeig amb sucre en 24 individus sense càries actives. Es van prendre sobrenadants (capítols 1 i 2) o mostres de saliva (capítol 3) per a mesuraments de nitrat, nitrit, amoni, lactat i pH. A més, la composició bacteriana de la biopel·lícula in vitro i del pèl·let salivar es va determinar usant seqüenciació Illumina del RNAr 16S i/o qPCR del gènere nitratorreductor Rothia. Les dades demostren que el nitrat estimula el creixement dels gèneres beneficiosos Rothia i Neisseria en el nostre model in vitro, mentre que potencialment disminueix els bacteris associats a la càries, l'halitosi i la malaltia periodontal. A més a més, les dades in vitro i in vivo presentades en aquesta tesi indiquen que el nitrat pot limitar o previndre caigudes de pH quan els sucres són fermentats per la microbiota oral, un mecanisme de resiliència que podria ser estimulat pel consum d'extractes vegetals rics en nitrats. Els principals mecanismes d'amortiment del pH per part del nitrat són l'ús de àcid làctic durant la desnitrificació (observat tant in vivo com in vitro) i durant la reducció de nitrit a amoni, així com la producció potencial d'amoníac (observat in vitro). En aquesta tesi, els efectes del nitrat es van observar després de períodes curts, és a dir, després de 5-9 h d'incubació in vitro i 1-4 hores després de la ingesta del suplement de nitrat in vivo. Els estudis futurs haurien de centrar-se en els efectes longitudinals de la ingesta diària de nitrats. En aquesta tesi es van aïllar bacteris reductors de nitrat pertanyents als gèneres Rothia i Actinomyces. Una selecció d'aïllats de Rothia va augmentar l'ús de lactat i la capacitat de reducció de nitrats de les comunitats bucals, la qual cosa potencialment beneficiaria la salut dental i la salut sistèmica, respectivament. Les dades in vitro i in vivo presentats en aquesta tesi suggereixen que el nitrat pot modular la microbiota oral en aspectes que són beneficiosos per a l'hoste i, per tant, podria considerar-se una substància prebiòtica per a la microbiota oral. A més, els aïllats reductors de nitrats poden estimular els efectes beneficiosos del metabolisme del nitrat, sobretot en persones amb baixos nivells d'aquests bacteris. El nitrat i els bacteris reductors de nitrat són, per tant, components prometedors per a futurs productes de salut oral. / [EN] It has been estimated that we obtain over three quarters of dietary nitrate from vegetables and fruits. Nitrate-rich vegetable types include leafy greens and certain root vegetables (e.g., beetroots and radishes). The salivary glands actively concentrate plasma nitrate, leading to high salivary nitrate concentrations (5-8 mM) after a nitrate-rich meal. Nitrate is an ecological factor that can induce rapid changes in structure and function of polymicrobial communities. However, the effects on the oral microbiota have not been clarified, whilst a limited number of previous studies did indicate that nitrate is likely to be beneficial for oral health. The aim of this thesis was therefore to study nitrate-induced microbiome changes and identify potential mechanisms for nitrate-induced homeostasis, in order to determine if nitrate can be considered a prebiotic compound for oral health. A second aim was to isolate nitrate-reducing isolates and test their probiotic potential in vitro. In chapter 1, an in vitro study was set up testing the effect of 6.5 mM nitrate on oral communities grown from saliva of 12 healthy individuals. In chapter 2, fifty-three nitrate-reducing isolates were obtained and the effect of six probiotic candidates was tested on healthy oral communities grown from saliva of different donors with or without 6.5 mM nitrate. In chapter 3, the effects of nitrate-rich beetroot extracts on oral acidification after sugar rinsing was tested in 24 individuals without active caries. Supernatants (chapters 1 and 2) or saliva samples (chapter 3) were taken for nitrate, nitrite, ammonium, lactate and pH measurements. Additionally, the bacterial composition of in vitro biofilms and salivary pellets were determined using 16S rRNA gene Illumina sequencing and/or qPCR of the nitrate-reducing genus Rothia. We showed that nitrate stimulates the growth of the beneficial genera Rothia and Neisseria in our in vitro model, while potentially decreasing caries-, halitosis- and periodontal disease-associated bacteria. Additionally, the in vitro and in vivo data presented in this thesis indicate that nitrate can limit or prevent pH drops when sugars are fermented by the oral microbiota - a mechanism of resilience that could be stimulated by the consumption of nitrate-rich vegetable extracts. The main pH buffering mechanisms of nitrate were lactic acid usage during denitrification (observed both in vivo and in vitro) and during the reduction of nitrite to ammonium, as well as the potential production of ammonia (observed in vitro). In this thesis, the effects of nitrate were observed after short periods, i.e., after 5-9 h incubation in vitro and/or after 1-4 hours after nitrate supplement intake in vivo. Future studies should focus on the longitudinal effects of daily nitrate intake. In chapter 2, nitrate-reducing species belonging to the genera Rothia and Actinomyces were isolated. A selection of Rothia isolates increased lactate usage and nitrate reduction capacities of oral communities, potentially benefitting dental health and systemic health, respectively. The in vitro and in vivo data presented in the current thesis suggest that nitrate can modulate the oral microbiota in ways that are beneficial for the host and could thus be considered a prebiotic substance for the oral microbiota. Additionally, nitrate-reducing isolates can stimulate certain beneficial effects of nitrate metabolism. Nitrate and nitrate-reducing bacteria are thus promising components for future oral care products to prevent or treat oral diseases and this should be further investigated. / Rosier, BT. (2022). Nitrate as a Prebiotic and Nitrate-Reducing Bacteria as Probiotics for Oral Health [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181578 / Compendio

[ES] La tesis doctoral titulada «Nanomotores Janus platino-sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas» se centra en el desarrollo de una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor se basa en una nanopartícula Janus integrada por una nanopartícula de platino (Pt) y una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) y es capaz de propulsarse y liberar fármacos de forma controlada. La cara de Pt es responsable del movimiento mediante la catálisis de H2O2 en O2, mientras que, la cara de MSN es responsable de la entrega de la carga ante el reconocimiento de estímulos específicos. El objetivo del trabajo es emplear la fuerza motriz de los nanomotores para difundir a través de barreras biológicas (BB), favoreciendo la entrega de fármacos en localizaciones diana de difícil acceso. En concreto, la zona interna de las biopelículas bacterianas y los tumores sólidos, que en ambos casos está protegida por una matriz extracelular (ECM) prácticamente impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetiza de forma toposelectiva mediante la técnica de emulsión de Pickering. En primer lugar, se carga con una molécula modelo y se funcionaliza con una puerta molecular sensible a estímulos redox, unida a la superficie de la cara de MSN mediante enlaces disulfuro. Los resultados confirman la estructura del nanomotor (tipo «muñeco de nieve») y su doble funcionalidad: difusión incrementada en respuesta a H2O2 y salida selectiva de la carga en respuesta a una especie redox (glutatión). En segundo lugar, el nanomotor se carga con el antiséptico clorhexidina y sus poros se bloquean con una nanoválvula sensible al pH, formada por un complejo de inclusión establecido entre grupos benzimidazol y ¿-ciclodextrinas unidas a la proteasa ficina. La puerta molecular es capaz de hidrolizar los componentes de la ECM e inducir la liberación de la carga a pH ácido, rasgo característico de la zona interna de las biopelículas. Los experimentos realizados prueban que la triple funcionalidad sinérgica del nanomotor resulta en la eliminación de los microorganismos de las biopelículas endodónticas. A continuación, se propone un nanomotor propulsado por glucosa, ya que existe una urgente necesidad de emplear combustibles biocompatibles y biodisponibles para evitar efectos nocivos en los pacientes. Para ello, se une la enzima glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mediante enlaces amida. La enzima desempeña una doble función. Por una parte, constituye el primer elemento de la cascada que induce el movimiento, al catalizar la transformación enzimática de glucosa en H2O2. Finalmente, el H2O2 es descompuesto por la cara de Pt propulsando al nanomotor. Por otra parte, actúa como puerta molecular sensible a proteasas, induciendo la liberación del fármaco doxorrubicina en los lisosomas. Los resultados obtenidos evidencian la habilidad del nanomotor para eliminar las células cancerosas de los tumores sólidos. Las conclusiones de esta tesis doctoral se resumen en que se ha logrado materializar un nanomotor muy versátil con 2 ventajas prominentes: (i) amplia área catalítica capaz de inducir una difusión incrementada y (ii) amplia área susceptible de ser funcionalizada con puertas moleculares. Además, se ha demostrado la capacidad de los nanomotores para atravesar BB, logrando un efecto terapéutico en infecciones endodónticas y cáncer. También se ha probado que el efecto es mayor que el causado por los componentes de los nanomotores independientemente y por nanopartículas control privadas de alguno de sus elementos. Esperamos que estos datos contribuyan al desarrollo de nuevas estrategias o a la mejora de las ya existentes para solventar el reto de la entrega de agentes terapéuticos en áreas enfermas inaccesibles, un problema clínico sin solución en la actualidad. / [CA] La tesi doctoral titulada «Nanomotors Janus platí-sílice mesoporosa com a plataforma per a l'alliberament de fàrmacs en aplicacions biomèdiques» se centra en el desenvolupament d'una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor es basa en una nanopartícula Janus integrada per una nanopartícula de platí (Pt) i una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) i és capaç de propulsar-se i alliberar fàrmacs de manera controlada. La cara de Pt és responsable del moviment mitjançant la catàlisi de H2O2 a O2, mentre que la cara de MSN és responsable de l'alliberament de la càrrega davant el reconeixement d'estímuls específics. L'objectiu del treball és fer servir la força motriu dels nanomotors per difondre a través de barreres biològiques (BB), afavorint l'alliberament de fàrmacs en localitzacions diana de difícil accés. En concret, la zona interna de les biopel·lícules bacterianes i els tumors sòlids, que en tots dos casos està protegida per una matriu extracel·lular (ECM) pràcticament impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetitza de forma toposelectiva mitjançant la tècnica d'emulsió de Pickering. En primer lloc, es carrega amb una molècula model i es funcionalitza amb una porta molecular sensible a estímuls redox, unida a la superfície de la cara de MSN mitjançant enllaços disulfurs. Els resultats confirmen l'estructura del nanomotor (tipus ninot de neu) i la seva doble funcionalitat: difusió incrementada en resposta a H2O2 i sortida selectiva de la càrrega en resposta a una espècie redox (glutatió). En segon lloc, el nanomotor es carrega amb clorhexidina i els seus porus es bloquegen amb una nanovàlvula sensible al pH, formada per un complex d'inclusió establert entre grups benzimidazol i beta ciclodextrines unides a la proteasa ficina. La porta molecular és capaç d'hidrolitzar els components de l'ECM i induir l'alliberament de la càrrega a pH àcid, un tret característic de la zona interna de les biopel·lícules. Els experiments realitzats proven que la triple funcionalitat sinèrgica del nanomotor resulta en l'eliminació dels microorganismes de les biopel·lícules endodòntiques. A continuació, es proposa un nanomotor propulsat per glucosa, ja que hi ha una necessitat urgent d'emprar combustibles biocompatibles i biodisponibles, per a evitar efectes nocius als pacients. Per fer-ho, s'uneix l'enzim glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mitjançant enllaços amida. L'enzim exerceix una doble funció. D'una banda, constitueix el primer element de la cascada que indueix el moviment, en catalitzar la transformació enzimàtica de glucosa a H2O2. Finalment, l'H2O2 és descompost per la cara de Pt propulsant el nanomotor. D'altra banda, actua com a porta molecular sensible a proteases, induint l'alliberament del fàrmac doxorrubicina als lisosomes. Els resultats obtinguts evidencien l'habilitat del nanomotor per eliminar les cèl·lules canceroses dels tumors sòlids. Les conclusions d"aquesta tesi doctoral es resumen en que s"ha aconseguit materialitzar un nanomotor molt versàtil amb 2 avantatges prominents: (i) àmplia àrea catalítica capaç d"induir una difusió incrementada i (ii) àmplia àrea susceptible de ser funcionalitzada amb portes moleculars. A més, s'ha demostrat la capacitat dels nanomotors per travessar BB, aconseguint un efecte terapèutic en infeccions endodòntiques i càncer. També s'ha provat que l'efecte és més gran que el causat pels components dels nanomotors independentment i per nanopartícules control privades d'algun dels elements. Esperem que aquestes dades contribueixin al desenvolupament de noves estratègies o a la millora de les ja existents per resoldre el repte de l'alliberament d'agents terapèutics en àrees malaltes inaccessibles, un problema clínic sense solució actualment. / [EN] The PhD thesis entitled "Platinum-mesoporous silica Janus nanomotors as a platform for drug delivery in biomedical applications" focuses on the development of a multifunctional self-propelled nanoparticle (nanomotor). The nanomotor is based on a Janus nanoparticle composed of a platinum nanoparticle (Pt) and a mesoporous silica nanoparticle (MSN) and can propel itself and release drugs in a controlled manner. The Pt face is responsible for the movement by catalyzing H2O2 into O2, whereas the MSN face is responsible for the delivery of cargo upon recognition of specific stimuli. The objective is to employ the driving force of nanomotors to diffuse through biological barriers (BB), favoring drug delivery to hard-to-reach target sites, such as the inner zone of bacterial biofilms and solid tumors, which in both cases is protected by an extracellular matrix (ECM). The Janus Pt-MSN nanomotor is synthesized toposelectively using the Pickering emulsion technique. It is first loaded with a model molecule and functionalized with a redox-stimuli-sensitive molecular gate, attached to the MSN face surface via disulfide bonds. The results confirm the structure of the nanomotor ("snowman" type) and its dual functionality: increased diffusion in response to H2O2 and selective cargo delivery in response to glutathione. Second, the nanomotor is loaded with chlorhexidine and its pores are blocked by a pH-sensitive nanovalve formed by an inclusion complex established between benzimidazole and ¿-cyclodextrins bound to ficin protease. The molecular gate is able to hydrolyze ECM components and induce cargo release at acidic pH, a characteristic feature of the inner zone of biofilms. The experiments performed prove that the triple synergistic functionality of the nanomotor results in the elimination of microorganisms from endodontic biofilms. Next, a glucose-powered nanomotor is proposed, as there is an urgent need to employ biocompatible and bioavailable fuels. For this purpose, the enzyme glucose oxidase is attached to the mesoporous face of the nanomotor via amide bonds. The enzyme plays a dual role. On the one hand, it constitutes the first element of the movement-inducing cascade by catalyzing the enzymatic transformation of glucose into H2O2. Finally, H2O2 is decomposed by the Pt face propelling the nanomotor. Moreover, it acts as a protease-sensitive molecular gate, inducing the release of the drug doxorubicin into lysosomes. The results obtained evidence the ability of the nanomotor to kill cancer cells in solid tumors. The conclusions of this doctoral thesis are that a very versatile nanomotor has been materialized with 2 prominent advantages: (i) large catalytic area capable of inducing increased diffusion and (ii) large area susceptible to be functionalized with molecular gates. In addition, the ability of nanomotors to pass through BB has been demonstrated, achieving a therapeutic effect on endodontic infections and cancer. It has also been proven that the effect is greater than that caused by the components of the nanomotors independently and by control nanoparticles deprived of some of their elements. We hope that these data will contribute to the development of new strategies or the improvement of existing ones to solve the challenge of delivering therapeutic agents to inaccessible diseased areas, a clinical problem with no solution at present. / Escudero Noguera, A. (2024). Nanomotores Janus de platino y sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205396