Au cours du cycle cellulaire, de nombreux agents génotoxiques conduisent à la formation de cassures double brins (CDB) de d’ADN. Ces lésions extrêmement dangereuses doivent être réparées afin de ne pas altérer l’intégrité du génome et la survie cellulaire. Chez les mammifères, la plupart de ces CDB sont prise en charge par la voie de réparation NHEJ (pour Non Homologous End Joining, recombinaison non homologue en français). La première étape de cette voie, la reconnaissance des extrémités d’ADN, est assurée par l’hétérodimère Ku70-Ku80. Ce complexe protège les extrémités d’ADN des activités de résection et recrute les facteurs impliqués dans la poursuite de la voie de réparation (la DNA-PKcs, XLF et le complexe de ligation XRCC4-LigIV) ainsi que des facteurs accessoires (PAXX, WRN et APLF). De cette observation, une vision plus générale de la fonction de Ku a émergé, une fonction de coordination de la voie NHEJ. La manière dont Ku interagit avec tous les facteurs du NHEJ, pour la réparation de toutes les CDB (propres ou non, accidentelles ou programmées) reste une question ouverte. Notre équipe travaillait précédemment sur l’étude des facteurs XRCC4 et XLF, dont ils ont pu mettre en évidence l’association en filaments dans un cristal.Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les structures cristallines de complexes comprenant Ku70-Ku80, un ADN et des peptides portant un motif de liaison à Ku (KBM) issus des protéines APLF et XLF. Le motif KBM de APLF se fixe de manière très forte à Ku (avec une affinité de 33 nM) et interagit avec une surface conservée sur Ku80. Cette interaction se déroule loin du site de fixation de Ku à l’ADN, à la périphérie du complexe. La connaissance des détails moléculaires de cette interaction a permis de comprendre et de rationnaliser la présence de résidus très conservés à la surface de Ku80 et dans la séquence d’APLF.Le motif KBM présent chez XLF, présentent une affinité plus modérée (un Kd de quelques μM) malgré une similarité de séquence importante avec le KBM de APLF (une région basique suivi d’une région hydrophobe). La structure du complexe Ku70-Ku80-ADN et du KBM de XLF montre que ce peptide se fixe sur un site différent de celui d’APLF. En effet ce peptide induit un large changement de conformation de Ku80 et vient se loger dans le sillon ainsi découvert. Par la suite, j’ai caractérisé deux mutants du KBM de XLF (L297E et L297W) qui respectivement abroge et renforce l’interaction de ce motif KBM avec Ku.Ensemble ces résultats confortent notre idée que Ku joue le rôle de chef d’orchestre de la voie de réparation NHEJ chez l’humain. / During the cell life many endo or exogenous genotoxic agents lead to the formation of DNA double strand breaks (DSBs). These lesions are extremely toxic and must be repaired in order to maintain the integrity of the genome and the survival of the cell. In mammalian, most DSBs are repaired by the Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway. The recognition step of NHEJ is mediated by the ring-shape Ku70-Ku80 (Ku) heterodimer that protects the DNA extremities from resection and can recruit several core NHEJ factors (DNA-PKcs, ligase complex Ligase4-XRCC4 and ligation co-factor XLF) as well as several accessory NHEJ factors (PAXX, APLF and WRN). Beyond its DNA ends binding activity, Ku appears more and more as the central coordinator of the NHEJ pathway. How do all the NHEJ factors interact with Ku and are involved in the repair of all DNA ends (clean or dirty, accidental or programmed) are questions not well elucidated. Our laboratory is interested in the recruitment of XLF and XRCC4 by Ku, either as individual factors or as filaments as the one we described previously1,2.During my thesis, I characterized the crystal structures between Ku70/Ku80/DNA and peptides containing the Ku Binding Motif (KBM) of two NHEJ factors, XLF and APLF (the Aprataxin like-factor nuclease). The KBM of APLF binds to Ku with a tight affinity (Kd of 33nM) and it interacts within a conserved pocket of Ku80. The KBM of APLF is located in a position remote from the DNA binding site, at the periphery of the Ku ring. The crystal structure rationalizes the role of the conserved basic and hydrophobic parts of the APLF KBM motif. The KBM of XLF has a moderate affinity (Kd of 4 µM) and a sequence with a similar basic and hydrophobic parts. Interestingly, the crystal structure of a Ku70/Ku80/ADN complex with a XLF KBM shows that this motif occupies a different site from the KBM of APLF. The XLF motif induces a large conformational change of Ku80 and occupies a cleft that does not exist in the original Ku70/Ku80/DNA complex.I then characterized two mutants of XLF in the KBM motif, (L297E and L297W) that respectively disrupt the binding of the KBM with Ku or redirect the XLF KBM to the APLF site.All together those results help us to better understand the coordination of several NHEJ factors by Ku. This support our idea that Ku acts as a coordinator of the NHEJ pathway.

The heart arises from two sources of mesoderm progenitors, the first (FHF) and the second heart field (SHF) progenitors. Mesp1 has been proposed to mark the most primitive multipotent cardiac progenitors (MCPs) common for both heart fields. However, it remains unclear whether at the single cell level, Mesp1 progenitors represent a common progenitor for the FHF and SHF. Using mosaic tracing and inducible clonal analysis with a multicolor reporter strategy, we investigated the contribution of Mesp1 cardiovascular progenitors in a temporally controlled manner during the early gastrulation. Our data indicated that the myocardium derives from ~250 Mesp1 expressing cardiac progenitors born during gastrulation. Temporal analysis of clonally labeled Mesp1 cells revealed the existence of temporally distinct populations of Mesp1 progenitors that are restricted to either the FHF or the SHF. FHF progenitors were unipotent, while SHF progenitors, were either uni- or bipotent. Microarray and single cell RT-PCR analysis of Mesp1 progenitors revealed the existence of molecularly distinct populations of Mesp1 progenitors, consistent with their lineage and regional contribution. Moreover biophysical analysis of clonal data revealed that, despite arising at different time points and contributing to different heart regions, the temporally distinct cardiac progenitors present very similar clonal dynamics. Altogether, these results provide insights into the number of cardiac progenitors and their mode of growth. Moreover they provide evidence that heart development arises from distinct populations of unipotent and bipotent cardiac progenitors expressing Mesp1 independently at different time points during gastrulation. Our data reveal that the regional segregation and lineage restriction of cardiac progenitors occurs very early during embryonic development. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. par l'intermédiaire d'un récepteur distinctif - le RCT (Récepteur des Cellules T), qui est responsable de la reconnaissance spécifique de peptides étrangers dans le corps. Les interactions moléculaires entre le RCT et son ligand, présenté par des cellules spécialisées (CPA cellules présentatrices d'antigène) sont suivies par un processus d'adhésion et d'étalement cellulaire caractérisé par d'importantes réorganisations à l'échelle supramoléculaire et cellulaire. Le rôle des propriétés physiques des cellules à ces échelles est encore mal compris. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés aux événements suivant cette reconnaissance en mimant la CPA par des substrats artificiels contrôlés exploitant plusieurs techniques de microscopie avancé. Nous avons réalisé une étude systématique de la dynamique d'étalement ainsi que de la morphologie (en terme d'aire d'adhésion et d'organisation de l'actine) des lymphocytes T humains de la lignée Jurkat sur des substrats présentant des anti-CD3 (un ligand spécifique du RCT) mobiles ou non. L'étalement des LT est fortement réduit sur les ligands mobiles par rapport aux ligands fixes. De plus le blocage de la myosine-II ou l'inclusion d'ICAM (le ligand des intégrines LFA-1) sur les substrats permettent de compenser ces différences. Nous proposons un modèle, inspiré de ceux sur la migration ou la croissance du cône neuronal , qui lie la dynamique du front d'étalement des lymphocytes T à la friction générée au niveau de la surface en tirant ou en fixant les ligands. / T- cells play a central role in cell mediated adaptive immune response. They are a class of lymphocytes that carry distinctive receptors - the TCRs (T cell receptor), which are responsible for specific recognition of foreign peptides in the body. Molecular interactions between the TCR complex and its ligand is followed by cell adhesion and spreading accompanied by dramatic changes at molecular and cellular scale. In this thesis we focus on the events that immediately follow recognition. I report a systematic study of the spreading dynamics and morphology (in terms of adhesion area and actin organization) of T lymphocytes on substrates with mobile or immobilized anti-CD3 (a ligand targeting the TCR complex). The spreading behaviour is seen to be dramatically different on the two types of substrates. Interestingly, on blocking myosin-II or by inclusion of ICAM (ligand of LFA1 integrins) on the substrate, these differences tend to disappear. We propose a model, partially inspired by earlier models of neuronal growth cones and filopodia, that links the dynamics of the leading edge of the spreading T cell to the friction generated at the surface by dragging or pinning of the ligands. I also report studies on T cells interacting with substrates decorated with nano-scale islands of anti-CD3 in a sea of repulsive PEG or a supported lipid bilayer. Dramatic differences in adhesion, organization of actin, and receptor distribution are observed on different geometries. I report advances in multi channel RICM towards the reconstruction of not only the topography of the proximal membrane of the T cell with high level of confidence but also the distal surface of lamellipodia.

Pendant le développement d'un organisme, les tissus subissent, génèrent des changements morphologiques drastiques nécessaires à l'obtention d'une forme finale ou intermédiaire spécifique et fonctionnelle. On comprend cette acquisition de formes comme un phénomène émergent résultant de l'interaction mécanique entre toutes les cellules composant le tissu. On sait que les structures de protéines du cytosquelette sont capables aussi bien de générer des forces ou de changer les propriétés mécaniques des cellules i.e de changer la réaction de celles-ci à un stress mécanique. Ces phénomènes émergents font l'objet de nombreuses études et mesures aussi bien lors d'expériences in vitro (solution de protéines purifiées) que sur cellules de cultures. Le travail décrit dans cette thèse s'est attaché à mesurer quantitativement les forces et propriétés mécaniques in vivo durant le développement d'un organisme. À terme, ces mesures sont utiles à l'élaboration d'un modèle mécanique qui amènerait une meilleure compréhension des phénomènes morphogénétiques.Pour réaliser ces mesures, un banc de mesures optiques a été développé. Il permet de réaliser des mesures de microrhéologie passives et actives durant l'extension de la bandelette germinale de l'embryon de drosophile. Des mesures quantitatives de viscosité, de raideur et de force jonctionnelle ont été réalisées. / Pendant le développement d'un organisme, les tissus subissent, génèrent des changements morphologiques drastiques nécessaires à l'obtention d'une forme finale ou intermédiaire spécifique et fonctionnelle. On comprend cette acquisition de formes comme un phénomène émergent résultant de l'interaction mécanique entre toutes les cellules composant le tissu. On sait que les structures de protéines du cytosquelette sont capables aussi bien de générer des forces ou de changer les propriétés mécaniques des cellules i.e de changer la réaction de celles-ci à un stress mécanique. Ces phénomènes émergents font l'objet de nombreuses études et mesures aussi bien lors d'expériences in vitro (solution de protéines purifiées) que sur cellules de cultures. Le travail décrit dans cette thèse s'est attaché à mesurer quantitativement les forces et propriétés mécaniques in vivo durant le développement d'un organisme. À terme, ces mesures sont utiles à l'élaboration d'un modèle mécanique qui amènerait une meilleure compréhension des phénomènes morphogénétiques.Pour réaliser ces mesures, un banc de mesures optiques a été développé. Il permet de réaliser desmesures de microrhéologie passives et actives durant l'extension de la bandelette germinale de l'embryon de drosophile. Des mesures quantitatives de viscosité, de raideur et de force jonctionnelle ont été réalisées.

Os receptores nicotínicos de acetilcolina (colinérgicos) (nAChRs) neuronais são proteínas integrais de membrana e pertencem à família de canais iônicos controlados por ligante, compostos por subunidades α e β. Esses receptores desempenham um papel-chave na transmissão de sinal entre os neurônios nos sistemas nervoso central e periférico. O subtipo α3β4, por exemplo, é o nAChR neuronal mais expresso no sistema nervoso autônomo; nAChRs contendo a subunidade α3 estão presentes em alta densidade no gânglio cervical superior, glândulas pineal e adrenais. Também estão presentes na substancia nigra, striatum, hipocampo, locus ceruleus, tracto habênulo-interpeduncular e cerebelo. Os nAChRs são inibidos por uma variedade de substâncias químicas, incluindo toxinas naturais, anestésicos locais, drogas de abuso (por, exemplo, cocaína) e compostos clinicamente importantes (tranqüilizantes, por exemplo). O mecanismo de inibição desses receptores tem sido investigado intensivamente. Neste estudo, nós investigamos o mecanismo pelo qual a tacrina (9-1,2,3,4-tetraidroaminoacridina), um agente usado clinicamente no tratamento da doença de Alzheimer, inibe o nAChR α3β4 de rato recombinante expresso nas células KXα3β4R2, utilizando uma técnica de cinética química rápida. A constante de dissociação da nicotina do sítio que controla a ativação do receptor, Kd, é 23 µM e a constante de equilíbrio de abertura do canal, Φ-1, é 4. A tacrina inibe o receptor competitivamente, com um KI de 0,77 µM. / Neuronal nicotinic acetylcholine (cholinergic) receptors (nAChRs) are integral membrane proteins and belong to the family of ligand-gated cation channels composed by α and β subunits. These receptors play a key role in the signal transmission between neurons in the central and peripheral nervous system. The α3β4 subtype, for example, is the most expressed neuronal nAChR in autonomic ganglia; α3-containing nAChRs are present at particularly high density in the superior cervical ganglia, pineal, and adrenal glands. They are also present in the substancia nigra, striatum, hippocampus, locus ceruleus, habenulo-interpeduncular tract and cerebellum. The nAChRs are inhibited by a variety of chemical substances, including natural toxins, local anesthetics, abused drugs (e.g., cocaine) and clinically important compounds (e.g., tranquilizers). The mechanism of inhibition of these receptors has been intensively investigated. In this study, we investigated the mechanism by which tacrine (9-1,2,3,4-tetahydroaminoacridine), an agent used clinically to treat Alzheimers disease, inhibits the recombinant rat α3β4 nAChR expressed in KXα3β4R2 cells, using a rapid chemical kinetic technique. The nicotine dissociation constant for the site controlling receptor activation, Kd, is 23 µM and the channel-opening equilibrium constant, Φ-1, is 4. Tacrine inhibits the receptor competitively, with a KI of 0.77 µM.

Os receptores nicotínicos de acetilcolina (colinérgicos) (nAChRs) neuronais são proteínas integrais de membrana e pertencem à família de canais iônicos controlados por ligante, compostos por subunidades α e β. Esses receptores desempenham um papel-chave na transmissão de sinal entre os neurônios nos sistemas nervoso central e periférico. O subtipo α3β4, por exemplo, é o nAChR neuronal mais expresso no sistema nervoso autônomo; nAChRs contendo a subunidade α3 estão presentes em alta densidade no gânglio cervical superior, glândulas pineal e adrenais. Também estão presentes na substancia nigra, striatum, hipocampo, locus ceruleus, tracto habênulo-interpeduncular e cerebelo. Os nAChRs são inibidos por uma variedade de substâncias químicas, incluindo toxinas naturais, anestésicos locais, drogas de abuso (por, exemplo, cocaína) e compostos clinicamente importantes (tranqüilizantes, por exemplo). O mecanismo de inibição desses receptores tem sido investigado intensivamente. Neste estudo, nós investigamos o mecanismo pelo qual a tacrina (9-1,2,3,4-tetraidroaminoacridina), um agente usado clinicamente no tratamento da doença de Alzheimer, inibe o nAChR α3β4 de rato recombinante expresso nas células KXα3β4R2, utilizando uma técnica de cinética química rápida. A constante de dissociação da nicotina do sítio que controla a ativação do receptor, Kd, é 23 µM e a constante de equilíbrio de abertura do canal, Φ-1, é 4. A tacrina inibe o receptor competitivamente, com um KI de 0,77 µM. / Neuronal nicotinic acetylcholine (cholinergic) receptors (nAChRs) are integral membrane proteins and belong to the family of ligand-gated cation channels composed by α and β subunits. These receptors play a key role in the signal transmission between neurons in the central and peripheral nervous system. The α3β4 subtype, for example, is the most expressed neuronal nAChR in autonomic ganglia; α3-containing nAChRs are present at particularly high density in the superior cervical ganglia, pineal, and adrenal glands. They are also present in the substancia nigra, striatum, hippocampus, locus ceruleus, habenulo-interpeduncular tract and cerebellum. The nAChRs are inhibited by a variety of chemical substances, including natural toxins, local anesthetics, abused drugs (e.g., cocaine) and clinically important compounds (e.g., tranquilizers). The mechanism of inhibition of these receptors has been intensively investigated. In this study, we investigated the mechanism by which tacrine (9-1,2,3,4-tetahydroaminoacridine), an agent used clinically to treat Alzheimers disease, inhibits the recombinant rat α3β4 nAChR expressed in KXα3β4R2 cells, using a rapid chemical kinetic technique. The nicotine dissociation constant for the site controlling receptor activation, Kd, is 23 µM and the channel-opening equilibrium constant, Φ-1, is 4. Tacrine inhibits the receptor competitively, with a KI of 0.77 µM.