The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars is a promising approach for producing renewable fuels and chemicals. However, the cost of the fungal enzymes usually employed in this process remains a significant bottleneck for manufacturing low value-added products from biomass. A potential route to increase hydrolysis yield, and thereby to reduce hydrolysis cost, would be to supplement the fungal enzymes with their lacking enzymatic activities, such as Beta-glucosidase. To produce such enzymes at a low cost, the bacterium Escherichia coli is a strong contender, owing to its ability to grow rapidly on simple and inexpensive media, and to achieve high levels of productivity. Nevertheless, there is hardly any techno-economic analysis of low-value protein production using E. coli in the literature, and, more generally, there are very few techno-economic analyses of low-value protein production ever reported, with the exception of cellulase production by Trichoderma reesei. In particular, the biotechnological application of recombinant E. coli platforms equipped with toxin-antitoxin systems to ensure plasmid stability remains largely unexplored, and its economic impact, unknown. As such, this work presents a comprehensive techno-economic analysis of the industrial production of a low-cost enzyme (Beta-glucosidase) using both E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, a modified BL21(DE3) strain equipped with a toxin-antitoxin system for plasmid maintenance. Moreover, this study describes the actual cloning and expression of a Beta-glucosidase enzyme into E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, and the development of a novel inoculum production scheme that exploits the features of the SE1 strain, based on repeatedly recycling a fraction of the inoculum cells. The results of the techno-economic analysis project an enzyme production cost of 316 US$/kg in the baseline scenario, which is considerably higher than the values reported in the literature for the fungal cocktails. The facility-dependent cost, which is strongly associated with the cost of equipment, accounts for roughly half of the estimated cost, while the cost of raw materials, especially IPTG and glucose, and the cost of consumables are all quite significant. However, the simulation of multiple scenarios and optimization measures suggest that the enzyme cost can be substantially reduced on many fronts, such as: substituting the carbon source for cheaper alternatives; reducing the amount of IPTG used for induction; using an E. coli strain capable of extracellular production; or eliminating the steps of concentration and stabilization of the enzyme, in the case of on-site enzyme utilization. Developing E. coli strains capable of high rEnzyme volumetric productivities can also significantly reduce the cost of the enzyme, up to approximately 135 US$/kg in the scenario of highest productivity. In addition, based on the experimental results with the E. coli SE1 system, an inoculum recycle strategy that avoids the need of an extensive seed train was simulated, resulting in a significant reduction of the enzyme cost. Finally, the combination of multiple process improvements could lead to an enzyme cost near 20 US$/kg of protein, which comes close to the cost of fungal cellulases and demonstrates the great biotechnological potential of recombinant E. coli platforms. / A conversão enzimática de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis é uma via promissora para a produção de combustíveis e produtos químicos renováveis. No entanto, o custo das enzimas fúngicas usualmente empregadas nesse processo permanece um gargalo significativo para a fabricação de produtos de baixo valor agregado a partir de biomassa. Uma possível estratégia para aumentar o rendimento da hidrólise e, assim, reduzir seu custo, seria suplementar as enzimas fúngicas com suas atividades enzimáticas deficientes, tais como a enzima Beta-glicosidase. Para produzir tais enzimas a um baixo custo, a bactéria Escherichia coli é uma forte candidata, dada a sua capacidade de crescer rapidamente em meios simples e baratos e de alcançar altos níveis de produtividade. No entanto, na literatura quase não há análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado utilizando E. coli e, de forma mais geral, há muito poucas análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado publicadas, com exceção da produção de celulases por Trichoderma reesei. Em particular, a aplicação biotecnológica de plataformas recombinantes baseadas em E. coli dotadas de sistemas toxina-antitoxina para garantir a estabilidade plasmidial segue em larga medida inexplorada, e seu impacto econômico, desconhecido. Assim, este trabalho apresenta uma análise técnico-econômica abrangente da produção industrial de uma enzima de baixo custo (Beta-glicosidase) usando E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, uma cepa de BL21 (DE3) modificada que possui um sistema toxina-antitoxina para manutenção plasmidial. Além disso, este estudo descreve a clonagem e expressão de uma Beta-glicosidase em E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, assim como o desenvolvimento de um novo método de produção de inóculo que tira proveito das peculiaridades da linhagem SE1, baseado em reciclar repetidamente uma fração das células do inóculo. Os resultados da análise técnico-econômica apontam para um custo de produção da enzima de 316 US$/kg no cenário-base, valor consideravelmente superior àqueles relatados na literatura para os coquetéis fúngicos. Os custos de overhead da planta, que estão fortemente associados ao custo de aquisição dos equipamentos, são responsáveis por aproximadamente metade do custo total, enquanto o custo de matérias-primas, especialmente IPTG e glicose, e o custo de consumíveis são bastante significativos. Porém, a simulação de múltiplos cenários e medidas de otimização sugerem que o custo da enzima pode ser substancialmente reduzido em muitas frentes, tais como: a substituição da fonte de carbono por alternativas mais baratas; a redução da quantidade de IPTG usado para indução; a utilização de cepas capazes de produzir a enzima extracelularmente; ou a eliminação das etapas de concentração e estabilização da enzima, em caso de utilização da enzima in situ. O desenvolvimento de cepas de E. coli capazes de atingir altas produtividades volumétricas de rEnzima também pode reduzir significativamente o seu custo, chegando a US$ 135/kg no cenário de maior produtividade. Com base nos resultados experimentais com a linhagem E. coli SE1, uma estratégia de reciclagem de inóculo que evita a necessidade de um extenso trem de inoculação também foi simulada, gerando significativa diminuição do custo da enzima. Por fim, a combinação de múltiplas melhorias no processo poderia levar a um custo de enzima em torno de 20 US$/kg de proteína, valor que se aproxima do custo das celulases fúngicas e que demonstra o grande potencial biotecnológico de plataformas de expressão baseadas em E. coli recombinante.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-10-31T18:35:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2654230 bytes, checksum: 30540dc7d296445a37d1795022249b6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-31T18:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2654230 bytes, checksum: 30540dc7d296445a37d1795022249b6d (MD5) Previous issue date: 2003-07-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O atual paradigma da educação, baseado na aprendizagem cooperativa e colaborativa mediada pela Internet, impõe a necessidade da introdução de novas tecnologias de informação e comunicação no ensino de engenharia, tornando-o mais adequado às exigências profissionais. Diante desse contexto, o presente trabalho propõe o uso integrado do computador no ensino-aprendizagem da disciplina Cinética de Processos Bioquímicos – TAL 416, do curso de Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa – UFV. O material pedagógico de TAL 416 foi produzido e disponibilizado em um ambiente educativo na web, chamado de PVANet, desenvolvido para ser utilizado nesta e em outras disciplinas da UFV. O PVANet contém ferramentas para apresentação de informações e conteúdos – “Agenda de atividades”, “Notícias”, “Informações Gerais”, “Conteúdo”, “Biblioteca”, “P&R” e “Mural” – e para comunicação – “Fórum”, “Chat” e “Lista de e-mails”. Por meio de questionários e entrevistas, realizou-se a avaliação do PVANet como ambiente de mediação pedagógica. Os grupos de avaliadores, formados por professores da UFV, estudantes de pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos e alunos matriculados em TAL 416 no primeiro período letivo de 2003, demonstraram elevado nível de satisfação em relação aos critérios de qualidade analisados. Para o conjunto dos avaliadores, mais de 80,0% das respostas concentraram-se, em média, nos dois maiores escores possíveis. Dentre os benefícios da utilização do ambiente educativo, os mais citados foram: interação com o professor e com outros alunos, possibilidade de estudo autônomo e realização de atividades cooperativas e colaborativas. Possíveis obstáculos foram relacionados, principalmente, aos problemas técnicos e à falta de domínio no uso do computador e seus recursos. Em geral, os resultados indicaram disposição e entusiasmo do público-alvo para com a educação mediada por computador. Além das elevadas notas dos questionários, a contribuição dos avaliadores ao processo, contida nas sugestões de modificações em alguns recursos do software e no design do PVANet, reforça essa proposição. / Due to the current education model, based on cooperative and collaborative learning mediated by the Internet, and the need of introducing new information and communication technologies in Engineering teaching, this study proposes an integrated use of computer in the teaching-learning process of the course Biochemical Process Kinetics – TAL 416, of the Food Engineering Department of the Federal University of Viçosa – UFV. Pedagogic material of TAL 416 was produced and made available in an educational software on the web, called PVANet, which contains information, content and communication tools to be used in this and other courses at the UFV. The PVANet was evaluated by questionnaires and interviews. The assessment groups, formed by UFV professors, Food Science and Technology graduate students and students enrolled in TAL 416 (first semester of 2003), demonstrated a high satisfaction level. On average, more than 80,0% of the answers reached the two highest scores. The most cited PVANet benefits were: student-professor and student-student interaction, possibility of autonomous study and accomplishment of cooperative and collaborative activities. Possible obstacles were mainly related to technical problems and lack of computer technology knowledge. In general, the results indicated willingness and enthusiasm towards computer-mediated education. / Não foi localizado o cpf do autor.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The process modeling and simulation is a greatly important procedure for many chemical and biotechnological processes. The process simulation allows to predict elementary behavior of the state variables of the process, leading to many economical and process advantages, such as the avoidance of losses of time and materials for not knowing the process particularities, the safety guarantee, the product quality, and, mostly the process optimization, permitting to study and to reach the best conditions of a process, which shall yield in more products with quality produced with less effort and expenditures. In this work, the modeling and simulation of two biological processes enzymatic hydrolysis and solid state fermentation were performed in order to develop models and estimate parameters that enable an engineer to predict the process behavior and to make decisions about the process. The modeling procedure also involves the computing of differential equations, and algebraic-differential equations; in this manner, the engineer must be able to use different numerical integration methods. Mainly two parameters estimation procedures were used Particle-Swarm Optimization and Levenberg-Marquardt -, and two numerical integration methods were also resorted Runge-Kutta and Dormand-Prince. Experimental data from previous works were used to perform several tests in order to assure that the models were predicting correctly the state variables of the process and, in this manner, were reliable and useful. In the first paper, several mechanistic and empirical models are tested to fit the enzymatic hydrolysis experimental data; statistical tests were performed to verify which of those models would best describe the process, which was found to be and entirely empirical non-autonomous model. The following papers are about the modeling of the solid-state fermentation process. The model was found to be very accurate and adequate to be used for predictions, mainly for the bed temperature of the packed-bed bioreactor, since it could predict the temperature gradients along the time and height of the bed. Also, some numerical procedures such as parameters identifiability, to realize which were the most important parameters to be estimated, and model reparametrization, to reduce the total number of parameters to be estimated and avoid magnitude problems of the model, were successfully performed. This work has shown that the modeling and simulation of processes holds an enormous importance for industry, and different techniques can be applied with more or less effort and success. Further, hopefully, this work has contributed to the state of the art of modeling, in a general way, for biological processes. / A modelagem e a simulação de processos consistem em um recurso de grande importância para diversos processos químicos e biotecnológicos. A simulação de processos nos permite predizer o comportamento das variáveis de estado do processo, levando-nos a vantagens técnicas e econômicas, como, por exemplo, a prevenção de perdas de tempo e insumos por não conhecer particularidades do processo, a garantia de segurança, a qualidade do produto e, principalmente, a otimização do processo, permitindo estudar e alcançar as melhores condições para o referido processo, o que deve culminar em mais produto produzido com melhor qualidade e com menos esforços e custos. Neste trabalho, a modelagem e a simulação de dois processos biotecnológicos hidrólise enzimática e fermentação em estado sólido foram feitas com a validação dos modelos propostos com dados experimentais através da técnica de estimação de parâmetros para permitir ao engenheiro prever o comportamento do processo e tomar decisões. O procedimento de modelagem também envolve a avaliação de equações diferenciais e de equações algébricas, dessa forma, o engenheiro deve estar apto a usar diferentes métodos de integração numérica. Dois procedimentos principais de estimação de parâmetros foram utilizados Otimização por Enxame de Partículas e Levenberg-Marquardt -, e se lançou mão de dois métodos de integração numérica, Runge-Kutta e Dormand-Prince. Dados experimentais de trabalhos anteriores foram utilizados para realizar diversos testes para assegurar a precisão dos modelos em predizer as variáveis de estado do processo e, portanto, serem modelos confiáveis e úteis. No primeiro artigo apresentado, diversos modelos mecanicísticos e empíricos foram testados para se ajustarem aos dados experimentais da hidrólise enzimática; testes estatísticos foram realizados para verificar qual dos modelos melhor descreveria o processo, de forma que o melhor modelo se mostrou ser um modelo totalmente empírico não-autônomo. Os demais artigos tratam da modelagem de um processo de fermentação em estado sólido. Verificou-se que o modelo é bastante preciso e adequado para o uso em predições, principalmente para o perfil de temperatura no leito do biorreator, uma vez que o modelo prevê os gradientes de temperatura ao longo do tempo e da altura do leito. Também, procedimentos numéricos, tais como a análise de identifiabilidade dos parâmetros, para a percepção de quais são os parâmetros mais importantes para a estimação, e a reparametrização do modelo, para reduzir o número total de parâmetros a serem estimados e evitar problemas de magnitude no modelo, foram empregadas com sucesso. Este trabalho mostrou que a modelagem e a simulação de processos possuem enorme importância para a indústria, e diferentes técnicas podem ser aplicadas com maior ou menor esforço e sucesso. Além disso, espera-se que o trabalho tenha contribuído para o estado da arte em modelagem, de uma maneira geral, na área de bioprocessos.

Submitted by Raquel Vergara Gondran (raquelvergara38@yahoo.com.br) on 2016-04-11T17:52:57Z No. of bitstreams: 1 tese_daniele.pdf: 1693586 bytes, checksum: a89420a4bb70aea354ae5524f20ac563 (MD5) / Approved for entry into archive by cleuza maria medina dos santos (cleuzamai@yahoo.com.br) on 2016-05-04T20:39:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_daniele.pdf: 1693586 bytes, checksum: a89420a4bb70aea354ae5524f20ac563 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T20:39:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_daniele.pdf: 1693586 bytes, checksum: a89420a4bb70aea354ae5524f20ac563 (MD5) Previous issue date: 2009 / Ao contrário dos bioprocessos submersos, que são amplamente utilizados e estudados, bioprocessos em estado sólido (BES) ainda são carentes de estudos de modelagem e simulação, o que aponta para o grande potencial de otimização. A dificuldade no aperfeiçoamento de BES está associada a problemas com a dissipação do calor gerado pelas atividades metabólicas do microrganismo durante o crescimento. Esta dificuldade na transferência de calor dentro do biorreator pode levar a zonas de altas temperaturas, que afetam adversamente a produtividade. A modelagem matemática é uma ferramenta essencial para otimizar bioprocessos. Através de modelos matemáticos é possível otimizar as variáveis operacionais para controle do bioprocesso e também analisar o design do biorreator. A otimização geométrica, de acordo com a Teoria Constructal, visa melhorar o desempenho do biorreator através, por exemplo, de minimizar a temperatura no interior do leito a níveis ótimos para o cultivo. O presente trabalho apresenta projetos de biorreatores para BES, todos com geometria otimizada, obtidos a partir de experimentação numérica, através de um software de computational fluid dynamics (CFD). O modelo matemático utilizado era preditivo e significativo ao nível de confiança de 95%. A otimização geométrica foi apresentada em função das condições operacionais do cultivo. Para o biorreator de coluna e leito fixo com paredes isoladas, foram apresentadas as geometrias ótimas em função da velocidade, da vazão e da temperatura do ar de admissão. Para uma temperatura do ar de admissão de 29,5 ºC, as configurações ótimas ((D/L)opt) variaram entre 1,0 e 2,4 para uma faixa de velocidade de admissão do ar entre 0,003 e 0,006 m s-1 . Relacionando com vazão, as razões mostraram-se ótimas entre 2,2 ≤ (D/L) ≤ 2,6 quando operando sob 3,3 a 3,5 10-5 m3 s-1 . Outro biorreator estudado foi o biorreator modular, composto de módulos elementares com geometria otimizada, sendo adaptável a diferentes escalas de produção e de fácil montagem. As configurações ótimas dos módulos de geometria retangular e seção quadrada foram apresentadas para diferentes volumes de módulos, em função da temperatura e da velocidade do ar de admissão. Foi observado que o volume máximo do módulo sem resfriamento externo é 5 L, para uma velocidade do ar de admissão acima de 0,0045 m s-1 e temperatura inferior ou igual 29,0 ºC O último biorreator proposto foi o biorreator hollow, semelhante a um biorreator de coluna e leito fixo, porém com um duto oco inserido nele. O duto interno tem inúmeros furos perpendiculares às suas paredes, mas sua saída é isolada, permitindo que o ar penetre no meio poroso. A geometria otimizada do biorreator hollow foi apresentada em função da fração de volume do duto interno, da razão entre os diâmetros de entrada e saída do duto interno, da vazão e da temperatura do ar de admissão. Em comparação com o biorreator de coluna convencional de mesmas dimensões e sob mesmas condições operacionais, o biorreator hollow apresentou temperatura máxima mais baixa, demonstrando que o projeto é eficiente para resfriar o meio poroso. Concluiu-se, enfim, no presente trabalho, que a geometria é um parâmetro importante e a sua otimização pode beneficiar o desempenho do biorreator. / Unlike the submerged bioprocesses, that was wildly used and studied, solid state bioprocess (SSB) are still poorly studied with respect to modeling and simulation, what indicates a big potential for optimization. The difficulty in the BES improvement is associated to problems with the dissipation of heat generated by metabolic activities of microorganisms during growth. This difficulty in transferring heat from the bioreactor could lead to areas with high temperature, which usually affect the productivity adversely. The mathematical modeling is an essential tool for optimizing bioprocesses. Using mathematical models it is possible to optimize operational variables to control the bioprocess and also explore the design of the bioreactor. The geometric optimization, according Constructal Theory, aims to improve the performance of the bioreactor through, for example, minimizing the temperature inside the bed to optimum levels for the bioprocess. The present work presents designs of bioreactors to SSB, all with optimized geometry, obtained from numerical experiments, by computational fluid dynamics (CFD) software. The mathematical model used has been predictive and significant at .95 level of confidence. The geometric optimization was presented as function of operational conditions of the cultivation. For the column fixed bed bioreactor with isolated wall, the optimal configurations are shown as function of flow, velocity and temperature of inlet air. For a inlet air temperature of 29.5 ºC, the optimal configurations ((D/L)opt) varied between 1.0 e 2.4 to a range of inlet velocity between 0.003 e 0.006 m s-1 . Relating with the volumetric flow, the optimal ratios presented between 2.2 ≤ (D/L) ≤ 2.6 when operating under 3.3 a 3.5 10-5 m3 s-1 . Other studied bioreactor was the modular bioreactor, consisting of elementary modules with optimized geometry, being adaptable to different scales of production and easy assembly. The optimal configurations of the modules with rectangular geometry and square section were shown depending on the volume of modules and the temperature and velocity of inlet air. It was observed that the maximum volume of the module without external cooling was 5 L, for a inlet velocity upper 0.0045 m s-1 and temperature smaller or equal to 29.0 ºC. The last proposed bioreactor was the hollow bioreactor, similar to a column fixed bed bioreactor, but with an empty duct inserted on it. The internal duct has innumerable holes perpendicular to its wall (the inlet port), but its end is insulated, allowing the air penetrates into the porous medium. The optimized geometry of hollow bioreactor was presented in function of the volume fraction of internal duct, the ratio between the diameters of inlet and outlet of the internal duct, the flow rate and temperature of the inlet air. Comparing with the conventional column bioreactor with the same configuration and same operational conditions, the hollow bioreactor showed a lower maximum temperature. This demonstrates that the project is efficient at cooling the porous medium. Finally, it was concluded that the geometry is an important parameter and its optimization can benefit the performance of the bioreactor.

A microalga Spirulina platensis, que possui alto de teor de proteínas, vem sendo cultivada fotoautotroficamente para a produção de biomassa microbiana. Embora as fontes convencionais de nitrogênio utilizadas para a produção de Spirulina sejam os nitratos, há a possibilidade do emprego de fontes alternativas, como a uréia, utilizando o processo descontínuo alimentado, com diminuição do custo de produção. No entanto, o uso exclusivo de uréia, em função de sua hidrólise no meio de cultivo e conseqüente perda de amônia, pode levar as células a crescerem por determinados períodos sob carência da fonte de nitrogênio, uma vez que esta fonte não pode ser adicionada em grandes quantidades devido à toxicidade da amônia proveniente de sua hidrólise. Este trabalho teve como objetivo verificar se a adição de nitrato de potássio em cultivos realizados com uréia podem levar a processos com maior produtividade e/ou aumento na quantidade de biomassa produzida. Foram verificadas várias proporções entre as concentrações iniciais de nitrato de potássio e uréia, utilizando planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta. As variáveis dependentes foram concentração celular máxima (Xm), produtividade em células (Px) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N), bem como, os teores de clorofila, proteínas e lipídios na biomassa obtida. Os resultados obtidos permitiram concluir que a associação de nitrato de potássio e uréia aumentaram a concentração celular máxima. A condição ótima obtida pela análise de regressão multivariável para Xm foi 17,3 mM de KNO3 e 8,90 mM de uréia, nessas condições foram obtidos 6077 ±199 mg/L. / The cyanobacterium Spirulina platensis, that have high protein content, has been cultivated photoautrophically for microbial biomass production. However nitrates are the conventional nitrogen sources for Spirulina, there is the possibility of use alternative source, as urea by fed batch process, decreasing the costs of production. So, the exclusive use of urea, due to urea hydrolysis in culture medium and consequently loss of ammonia, can cause the cell to growing for specific moments without nitrogen source, because urea can not be added in huge quantity due to the ammonia toxicity provide by its hydrolysis. This work have as objectives verify if the potassium nitrate addition in the culture carried out with urea can lead a process with more productivity and/or increase in the biomass quantity. It was verified many proportion between initial concentration of potassium nitrate and urea, using experimental planning and surface response methodology. The dependent variables were maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px) and nitrogen-cell conversion factor (YX/N), as well as biomass contents of chlorophyll, protein and lipids. The results allowed us concluded that the association of KNO3 and urea was good and improved the maximum cell concentration. The optimal condition otained by statistic analysis for Xm was 17,3 mM of KNO3 and 8,90 mM of urea. In this condition the maximum cell concentration was 6077 ±199 mg L-1.

Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) é uma cianobactéria de grande potencial econômico para a produção de proteínas, principalmente. A utilização simultânea de duas fontes de nitrogênio no cultivo deste microrganismo pode aumentar a quantidade final de biomassa produzida e possibilitar resultados interessantes do ponto de vista de processo de produção. Esta pesquisa teve como principal objetivo verificar o efeito da adição de nitrato de potássio (KNO3) em cultivos de S. platensis realizados com cloreto de amônio (NH4Cl). Através da utilização de planejamento fatorial completo (22 mais configuração estrela), foram verificadas proporções de concentrações iniciais de KNO3 e totais de NH4Cl que variaram de 5,10 a 24,9 mmol · L-1. Foram realizados oito cultivos experimentais e seis cultivos de ponto central, com a utilização de processo descontínuo alimentado e vazões exponencialmente crescentes de adição do sal de amônio. As variáveis independentes (quantidade das fontes de nitrogênio) foram avaliadas simultaneamente através de metodologia de superfície de resposta (regressão multivariável) quanto a sua influência nas variáveis dependentes: concentração celular máxima (Xm), expressa em massa seca por litro de meio, produtividade em células (PX) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N). A otimização dos cultivos em relação à concentração celular resultou nos seguintes valores: KNO3 = 15,4 mmol · L-1 e NH4Cl = 14,1 mmol · L-1, com Xm esperado de 4450 mg · L-1. O maior valor de concentração celular obtido sob essas condições foi de 4327 mg · L-1, valor este equivalente ao obtido em cultivo de referência para KNO3 (KNO3 = 25,4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) e superior ao obtido em cultivo de referência para NH4Cl (NH4Cl = 21,5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). Concluiu-se que a adição de KNO3 em cultivos com NH4Cl contribuiu para que não houvesse deficiência de nitrogênio no decorrer dos cultivos, proporcionando maiores valores finais de biomassa, com maior conteúdo de clorofila, lipídios e proteínas. A utilização de NH4Cl permitiu a redução dos custos com o meio de cultura, tornando cultivos com associação de tais fontes de nitrogênio uma alternativa vantajosa para a produção desta cianobactéria. / Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) is a cyanobacterium which has a great economic potential to protein production, particularly. The simultaneous use of two nitrogen sources can increase the final amount of produced biomass and provide interesting results from the production process point of view. This research had as main goal to evaluate the effect of potassium nitrate (KNO3) addition to S. platensis cultures performed with ammonium chloride (NH4Cl). Through the use of full factorial design (22 plus star configuration), proportions of initial KNO3 and total NH4Cl concentrations, which varied from 5.10 to 24.9 mmol · L-1, were validated. Eight experimental cultures and six central point cultures were carried out using fed-batch process and exponentially-increasing ammonium salt feeding rates. The independent variables (nitrogen sources amount) were simultaneously assessed by response surface methodology (multivariable regression) as to their influence on dependent variables: maximum cell concentration (Xm), expressed in dry mass per liter of medium, cell productivity (PX) and conversion yield of nitrogen to biomass (YX/N). The cultures optimization regarding cell concentration resulted in the following values: KNO3 = 15.4 mmol · L-1 and NH4Cl = 14.1 mmol · L-1, with an expected Xm of 4450 mg · L-1. The highest cell concentration value obtained under these conditions was 4327 mg · L-1, which is comparable to the cell concentration obtained in KNO3 reference culture (KNO3 = 25.4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) and superior to the one obtained in NH4Cl reference culture (NH4Cl = 21.5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). It was drawn that the addition of KNO3 to NH4Cl cultures contributed to avoid nitrogen deficiency during cultivation, providing higher final biomass values with higher chlorophyll, lipid and protein contents. The utilization of NH4Cl allowed the reduction of culture medium costs, turning cultures developed with such nitrogen sources association into an advantageous alternative to the production of this cyanobacterium.

Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) é uma cianobactéria de grande potencial econômico para a produção de proteínas, principalmente. A utilização simultânea de duas fontes de nitrogênio no cultivo deste microrganismo pode aumentar a quantidade final de biomassa produzida e possibilitar resultados interessantes do ponto de vista de processo de produção. Esta pesquisa teve como principal objetivo verificar o efeito da adição de nitrato de potássio (KNO3) em cultivos de S. platensis realizados com cloreto de amônio (NH4Cl). Através da utilização de planejamento fatorial completo (22 mais configuração estrela), foram verificadas proporções de concentrações iniciais de KNO3 e totais de NH4Cl que variaram de 5,10 a 24,9 mmol · L-1. Foram realizados oito cultivos experimentais e seis cultivos de ponto central, com a utilização de processo descontínuo alimentado e vazões exponencialmente crescentes de adição do sal de amônio. As variáveis independentes (quantidade das fontes de nitrogênio) foram avaliadas simultaneamente através de metodologia de superfície de resposta (regressão multivariável) quanto a sua influência nas variáveis dependentes: concentração celular máxima (Xm), expressa em massa seca por litro de meio, produtividade em células (PX) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N). A otimização dos cultivos em relação à concentração celular resultou nos seguintes valores: KNO3 = 15,4 mmol · L-1 e NH4Cl = 14,1 mmol · L-1, com Xm esperado de 4450 mg · L-1. O maior valor de concentração celular obtido sob essas condições foi de 4327 mg · L-1, valor este equivalente ao obtido em cultivo de referência para KNO3 (KNO3 = 25,4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) e superior ao obtido em cultivo de referência para NH4Cl (NH4Cl = 21,5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). Concluiu-se que a adição de KNO3 em cultivos com NH4Cl contribuiu para que não houvesse deficiência de nitrogênio no decorrer dos cultivos, proporcionando maiores valores finais de biomassa, com maior conteúdo de clorofila, lipídios e proteínas. A utilização de NH4Cl permitiu a redução dos custos com o meio de cultura, tornando cultivos com associação de tais fontes de nitrogênio uma alternativa vantajosa para a produção desta cianobactéria. / Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) is a cyanobacterium which has a great economic potential to protein production, particularly. The simultaneous use of two nitrogen sources can increase the final amount of produced biomass and provide interesting results from the production process point of view. This research had as main goal to evaluate the effect of potassium nitrate (KNO3) addition to S. platensis cultures performed with ammonium chloride (NH4Cl). Through the use of full factorial design (22 plus star configuration), proportions of initial KNO3 and total NH4Cl concentrations, which varied from 5.10 to 24.9 mmol · L-1, were validated. Eight experimental cultures and six central point cultures were carried out using fed-batch process and exponentially-increasing ammonium salt feeding rates. The independent variables (nitrogen sources amount) were simultaneously assessed by response surface methodology (multivariable regression) as to their influence on dependent variables: maximum cell concentration (Xm), expressed in dry mass per liter of medium, cell productivity (PX) and conversion yield of nitrogen to biomass (YX/N). The cultures optimization regarding cell concentration resulted in the following values: KNO3 = 15.4 mmol · L-1 and NH4Cl = 14.1 mmol · L-1, with an expected Xm of 4450 mg · L-1. The highest cell concentration value obtained under these conditions was 4327 mg · L-1, which is comparable to the cell concentration obtained in KNO3 reference culture (KNO3 = 25.4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) and superior to the one obtained in NH4Cl reference culture (NH4Cl = 21.5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). It was drawn that the addition of KNO3 to NH4Cl cultures contributed to avoid nitrogen deficiency during cultivation, providing higher final biomass values with higher chlorophyll, lipid and protein contents. The utilization of NH4Cl allowed the reduction of culture medium costs, turning cultures developed with such nitrogen sources association into an advantageous alternative to the production of this cyanobacterium.

A microalga Spirulina platensis, que possui alto de teor de proteínas, vem sendo cultivada fotoautotroficamente para a produção de biomassa microbiana. Embora as fontes convencionais de nitrogênio utilizadas para a produção de Spirulina sejam os nitratos, há a possibilidade do emprego de fontes alternativas, como a uréia, utilizando o processo descontínuo alimentado, com diminuição do custo de produção. No entanto, o uso exclusivo de uréia, em função de sua hidrólise no meio de cultivo e conseqüente perda de amônia, pode levar as células a crescerem por determinados períodos sob carência da fonte de nitrogênio, uma vez que esta fonte não pode ser adicionada em grandes quantidades devido à toxicidade da amônia proveniente de sua hidrólise. Este trabalho teve como objetivo verificar se a adição de nitrato de potássio em cultivos realizados com uréia podem levar a processos com maior produtividade e/ou aumento na quantidade de biomassa produzida. Foram verificadas várias proporções entre as concentrações iniciais de nitrato de potássio e uréia, utilizando planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta. As variáveis dependentes foram concentração celular máxima (Xm), produtividade em células (Px) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N), bem como, os teores de clorofila, proteínas e lipídios na biomassa obtida. Os resultados obtidos permitiram concluir que a associação de nitrato de potássio e uréia aumentaram a concentração celular máxima. A condição ótima obtida pela análise de regressão multivariável para Xm foi 17,3 mM de KNO3 e 8,90 mM de uréia, nessas condições foram obtidos 6077 ±199 mg/L. / The cyanobacterium Spirulina platensis, that have high protein content, has been cultivated photoautrophically for microbial biomass production. However nitrates are the conventional nitrogen sources for Spirulina, there is the possibility of use alternative source, as urea by fed batch process, decreasing the costs of production. So, the exclusive use of urea, due to urea hydrolysis in culture medium and consequently loss of ammonia, can cause the cell to growing for specific moments without nitrogen source, because urea can not be added in huge quantity due to the ammonia toxicity provide by its hydrolysis. This work have as objectives verify if the potassium nitrate addition in the culture carried out with urea can lead a process with more productivity and/or increase in the biomass quantity. It was verified many proportion between initial concentration of potassium nitrate and urea, using experimental planning and surface response methodology. The dependent variables were maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px) and nitrogen-cell conversion factor (YX/N), as well as biomass contents of chlorophyll, protein and lipids. The results allowed us concluded that the association of KNO3 and urea was good and improved the maximum cell concentration. The optimal condition otained by statistic analysis for Xm was 17,3 mM of KNO3 and 8,90 mM of urea. In this condition the maximum cell concentration was 6077 ±199 mg L-1.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6615.pdf: 4694610 bytes, checksum: 288df2441cd04d5e5e4c36da49c66cb9 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Mesenchymal stromal cells (MSCs) are required by the scientific community in the development and enhancement of therapeutic techniques in different fields of medicine. The MSCs are present in small concentrations in tissues, which makes necessary the expansion in vitro for enable studies and therapeutic applicability. These are cells with high sensitivity to environmental conditions of cultivation. So, for increase productivity in vitro is used the technology of bioreactors in the development of processes in order to produce high cell densities in less time, with reduce use of resources and maintaining a safe operation. The new concepts of "disposable bioreactors", as the wave-induced motion bioreactor or Wave bioreactor, with possibility operating in a closed system, controlled and automated, reduced investment cost and operation, less risk of contamination, higher level biosecurity, added to the fact of being a underexplored technology and already approved by the FDA (Food and Drugs Administration) becomes a highly attractive alternative bioprocessing for cultivation of animal cells in large scale. In this context, the present work aims to develop a protocol for cultivation of MSCs in the Wave Bioreactor System 2/10. Experiments were performed to characterize the CEMs's culture behavior in the Wave bioreactor to obtain high cell productivity while maintaining the therapeutic potential of the CEMs. The experiments were carried out with 2 L Cellbag and Cultispher-S microcarrier with 300 ml of α-MEM medium culture supplemented with glucose, glutamine, and arginine and 15% v/v fetal bovine serum at 37 ° C and pH between 6,9-7,4. In the preliminary experiments it was verified that most of the inoculated cells did not adhere to the microcarriers. It was shown that such behavior is due to low relation between adhesion area (AMC = total projected area of the microcarriers) and wet surface area of Cellbag (ASMCellbag), which in the normal condition of operation results an adhesion between 25,7 and 61,7% of the inoculated cells. To solve the problem were performed experiments reducing ACellbag which enabled improvements in cell adhesion by up to 100%. It was also found low performance of the cell expansion phase, presumably linked to operational problems like: microcarriers segregation in certain regions of the bioreactor causing depletion of nutrients, formation of aggregates of MCs colonized with cells and adhesion of MCs to Cellbag. In addition, it was observed that reducing CEM/MC ratio at the start of the culture, the cell expansion factor could be increased to values equal to or greater than 10. These results show that the Wave bioreactor has good potential for expansion of MSCs and that the same can be improved. / As células estromais mesenquimais (CEMs) estão sendo visadas pela comunidade científica no desenvolvimento e aprimoramento de técnicas terapêuticas em diferentes ramos da medicina. As CEMs estão presentes em pequenas concentrações nos tecidos, o que torna necessário a sua expansão in vitro para viabilizar pesquisas e a aplicabilidade terapêutica. Tratam-se de células com elevada sensibilidade em relação às condições do ambiente de cult ivo. Assim, para o aumento da produtividade in vitro utiliza-se a tecnologia de biorreatores no desenvolvimento de processos com objetivo de produzir altas densidades celulares em curto tempo, de forma econômica e respeitando as normas impostas pelos órgãos reguladores. O novo conceito de biorreator descartável, como o do biorreator com movimento induzido em forma de ondas, ou biorreator Wave, apresenta possibilidade de operação em sistema fechado segundo as boas práticas de fabricação (BPF), controlado e automatizado. O custo de investimento e operação reduzido, com menor risco de contaminação, maior nível de biossegurança, somado ao fato de utilizar uma tecnologia pouco explorada e já aprovada pelo FDA (Food and Drugs Administration) se transforma numa alternativa de bioprocessamento altamente atrativa para cultivo de células animais em larga escala. Nesse contexto, o presente trabalho tem por meta avaliar o desempenho do biorreator Wave 2/10 na expansão das CEMs. Para tal, foram realizados experimentos visando caracterizar o comportamento do cultivo nesse biorreator a fim de obter alta produtividade celular mantendo a potencialidade terapêutica das CEMs. Os experimentos foram realizados com saco plástico (doravante Cellbag) de 2 L e microcarregador (MC) Cultispher-S com 300 mL me io de cultivo α-MEM suplementado com glicose, glutamina e arginina e 15% v/v de soro fetal bovino a 37°C e pH entre 6,9-7,4. Nos experimentos preliminares constatou-se que grande parte das células inoculadas não aderiam aos microcarregadores. Comprovou-se que tal comportamento se devia à baixa relação entre área de adesão (AMC = área total projetada dos microcarregadores) e área de superfície molhada da Cellbag (ASMCellbag) que na condição normal de operação resultava numa adesão entre 25,7 e 61,7% das células inoculadas. Para melhorar a adesão foram realizados experimentos reduzindo a ASMCellbag, o que possibilitou melhoria na adesão celular em até 100%. Na etapa de expansão celular verificou-se baixo desempenho, presumivelmente vinculado a problemas de operação como: segregação de microcarregadores em determinadas regiões do biorreator provocando o esgotamento de nutrientes, formação de agregados de MCs colonizados com células e adesão dos MCs à Cellbag. Em adição, notou-se que diminuindo a relação CEM/MC no início do cultivo a expansão celular podia ser aumentada para valores iguais ou maiores que 10. Ao todo, os resultados mostraram que o biorreator Wave possui bom potencial para a expansão de CEMs e que o mesmo ainda pode ser melhorado.