A contaminação de solos e águas subterrâneas com hidrocarbonetos de petróleo tem sido objeto de muita preocupação nas ultimas décadas. E embora as indústrias petrolíferas ocupem um grande espaço na mídia com os grandes vazamentos acidentais, os postos de combustíveis em situação irregular demonstram na maioria das vezes uma contaminação silenciosa e que quando descobertos já ocasionaram um dano ambiental de grande extensão. Essas condições somadas a banalização dos procedimentos operacionais em instalações e a implementação tardia de uma legislação ambiental específica, fazem com que os pequenos e contínuos vazamentos apresentem elevados potenciais poluidores, colocando os postos de combustíveis na lista dos responsáveis pelo maior número de áreas contaminadas. Desta forma, tornam-se necessárias alternativas para mitigar esses impactos ambientais, sociais e econômicos e as técnicas de biorremediação surgem como uma solução de baixo custo, eficiência e viabilidade. Estas técnicas se baseiam na utilização de micro-organismos com potencial de biodegradar compostos, sendo práticas ambientalmente corretas e sustentáveis. Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma formulação comercial utilizando micro-organismos isolados do solo contaminado com hidrocarbonetos e comparar a aplicação desta formulação aos tratamentos de atenuação natural e bioestimulação. Para isso, 34 micro-organismos foram isolados de solo contaminado removidos de postos de combustíveis. Para avaliar a capacidade de biodegradação destes isolados, os mesmos foram submetidos a um teste prévio com indicador redox TTC, onde 24 foram positivos e então identificados através do sequenciamento do 16 S rRNA. O sequenciamento identificou 12 P. aeruginosa (99% de similaridade), três P. mendocina (99% de similaridade), uma P. pseudoalcaligenes (99% de similaridade) uma P. putida (97% de similaridade), uma P. stutzeri (99% de similaridade), três B. cereus (99% de similaridade), dois B. subtilis (99% de similaridade) e uma A. calcoaceticus (99% de similaridade). Os isolados identificados como P. aeruginosa não foram utilizados devido a sua patogenicidade, os demais foram submetidos a produção de biossurfactantes através da avaliação do índice de emulsificação, onde ambos tiveram uma IE entre 20 e 30%. Após os testes iniciais, cinco micro-organismos foram selecionados para compor o primeiro consórcio a ser utilizado no experimento de bioaumentação (P. mendocina (BPB 1.6), B. cereus (BPB 1.15), A. calcoaceticus (BPB 1.22), B. subtilis (BPB 1.13) e B. cereus (BPB 1.26). Para os experimentos foram montados os tratamentos de atenuação natural, bioaumentação/bioestimulação e bioestimulação, utilizado 300 g de um solo contaminado removido de um posto de combustível, o qual apresentou uma contaminação inicial de 134,49 mg Kg-1 de solo. Ao final do experimento (60 dias), os tratamentos mostraram uma redução de 84% para o tratamento de atenuação natural, 90% para o tratamento de bioaumentação/bioestimulação e 91% para o tratamento de bioestimulação. Após estes resultados um novo experimento foi montado em grande escala, utilizando 300 Kg de solo contaminado, onde os tratamentos de atenuação natural, bioaumentação/bioestimulação e bioestimulação foram monitorados com e sem a injeção de ar. O consórcio utilizado foi produzido em escala industrial (100 L) e composto por quatro micro-organismos, P. mendocina (BPB 1.8), B. cereus (BPB 1.20), B. cereus (BPB 1.26), B. sphaericus (BPB 1.35). A degradação dos contaminantes foram analisadas nas diferentes frações: C8–C11, C11–C14, C14–C20 e C20–C40, por cromatografia gasosa. Os resultados mostraram que o tratamento de atenuação natural com aeração reduziu 98% dos contaminantes. Já o tratamento de bioestimulação não obteve redução, tanto com a aplicação de ar quanto sem, e o tratamento de bioaumentação/biestimualação sem ar obteve uma redução de 85%. Para estes tratamento também foram monitorados a produção de CO2, o qual não obteve diferenças significativas entre os tratamentos, assim como a eletroforese em gel de gradiente desnaturante. / Contamination of soil and groundwater with petroleum hydrocarbons has been the subject of much concern in recent decades. And although oil industries occupy a large space in the media with large accidental spills, gas stations illegally staying show in most cases a silent contamination and when discovered already caused environmental damage of large extent. These conditions added the trivialization of operational procedures in facilities and the late implementation of a specific environmental legislation, make small continuous leaks and show high potential polluters, putting the gas stations in the list of the highest number of contaminated sites. Thus become necessary alternatives to mitigate these environmental, social and economic impacts and bioremediation techniques emerge as a low-cost solution, efficiency and viability. These techniques based on the use of microorganisms with potential to biodegrade compounds, being environmentally friendly and sustainable practices. Therefore, the objective of this study was to develop a commercial formulation using isolated from soil microorganisms contaminated with hydrocarbons and compare the application of this formulation to natural attenuation and biostimulation treatments. For this, 34 microorganisms were isolated from contaminated soil removed from gas stations. To evaluate the biodegradability of these isolates, they were subjected to a pretest with TTC redox indicator, where positive and 24 were then identified through the sequencing of the 16 S rRNA. The sequencing identified 12 P. aeruginosa (99% similarity), three P. mendocina (99% similarity), one P. pseudoalcaligenes (99% similarity), one P. putida (97% similarity), one P. stutzeri (99% similarity) three B. cereus (99% similarity), two B. subtilis (99% similarity) and one A. calcoaceticus (99% similarity). The isolates identified as P. aeruginosa were not used because of their pathogenicity, others were submitted to biosurfactant production by assessing the emulsification index, which both had a IE between 20 and 30%. After initial testing, five micro-organisms were selected to compose the first consortium to be used in bioaugmentation experiment (P. mendocina (BPB 1.6), B. cereus (BPB 1.15), A. calcoaceticus (BPB 1:2) B. subtilis (BPB 1.13) and B. cereus (BPB 1.26). For the experiments were mounted the natural attenuation treatments, bioaugmentation / biostimulation and biostimulation, used 300 g of contaminated soil removed from a gas station, which presented an initial contamination of 134.49 mg kg-1 soil. At the end of the experiment (60 days), the treatments showed a 84% reduction for the treatment of natural attenuation, 90% for the biostimulation treatment, bioaugmentation/ and 91% for the biostimulation treatment. After these results a new experiment was conducted on a large scale, using 300 kg of contaminated soil, where treatments of natural attenuation, bioaugmentation / biostimulation and biostimulation were monitored with and without the injection of air. The consortium used was produced on an industrial scale (100 L) and consists of four micro-organisms, P. mendocina (BPB 1.8), B. cereus (BPB 1.20), B. cereus (BPB 1.26), B. sphaericus (BPB 1.35). The degradation of contaminants in different fractions was analyzed: C8–C11, C11–C14, C14–C20 and C20–C40, by gas chromatography. The results showed that treatment of natural attenuation with aeration reduced 98% of contaminants. Already the biostimulation treatment did not obtain reductions both with air and with no application, and treatment of bioaugmentation / biestimualação with no air obtained a reduction of 85%. For these treatment were also monitored the production of CO2, which did not have significant differences between treatments, as well as electrophoresis in denaturing gradient gel.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-11T14:02:42Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Sérgio Murilo.pdf: 835395 bytes, checksum: 250131a8bdf06c7030fd65a8287c5a37 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T14:02:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Sérgio Murilo.pdf: 835395 bytes, checksum: 250131a8bdf06c7030fd65a8287c5a37 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / FACEPE / A aplicação de agrotóxicos pela agricultura é uma importante fonte de contaminação do solo e representa perigo toxicológico para a população humana em geral. Os fungos estão entre os principais agentes de degradação dos produtos agroquímicos. O clorpirifós é um agrotóxico organofosforado. Linhagens de fungos foram isoladas de solos agricultáveis dos municípios de Bezerros e Caruaru, no Estado de Pernambuco, e selecionadas in vitro no Departamento de Micologia da UFPE. Dentre as espécies selecionadas, após identificação por taxonomia clássica, oito foram objeto de estudo, quatro provenientes de Bezerros e quatro de Caruaru. Dentre as espécies de Bezerros estavam o Aspergillus terreus, Penicillium Corylophilum, Fusarium oxysporum e Trichoderma harzianum. As espécies de Caruaru foram Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, Aspergillus tamarii e Aspergillus japonicus. Todas estas espécies foram expostas a cinco concentrações do agrotóxico cujo princípio ativo é o clorpirifós, além do grupo controle. Para isto, acresceram-se 0,1mL; 0,2mL; 0,3mL; 0,4mL e 0,5mL do agrotóxico, separadamente, a frascos de Erlenmeyer contendo 200 mL do meio de cultura extrato de malte-ágar, obtendo-se as concentrações em mL/L de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5, respectivamente. O controle foi o extrato de malte-ágar sem o agrotóxico. O experimento foi realizado em triplicata. O crescimento foi avaliado medição dos diâmetros das colônias no decorrer de sete dias. Os esporos foram contados na Câmara de Neubauer, além de ter sido realizado o teste da fenoloxidase. Todas as espécies mostraram-se tolerantes ao agrotóxico. O número de esporos apresentou-se variado frente ao agrotóxico. As espécies Trichoderma harzianum, Fusarium oxysporum e Aspergillus terreus foram positivas para o teste da fenoloxidase. Todos os fungos testados são biorremediadores de ambientes impactados pelo agrotóxico clorpirifós. Como perspectiva futura será realizado o teste líquido para quantificar o percentual de degradação deste agrotóxico por estes fungos.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T17:55:06Z No. of bitstreams: 2 dissertação_débora s.p.s._2012..pdf: 1757289 bytes, checksum: 2fa68e4212825dd64e254666069133bc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T17:55:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertação_débora s.p.s._2012..pdf: 1757289 bytes, checksum: 2fa68e4212825dd64e254666069133bc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-01-25 / FACEPE; FINEP; CNPQ. / Este trabalho objetiva o estudo da degradação de óleo diesel por micro-organismos isolados de amostras poluídas por petroderivados. As culturas foram selecionadas para formar um consórcio, e foram submetidas a ensaios em frascos de acordo com um planejamento fatorial completo 2³, a fim de determinar a temperatura (25, 30 ou 35°C), concentração de inóculo (1, 2 ou 3 blocos com 0,8 mm de diâmetro) e relação C:N (10:1, 50:1 ou 90:1) mais favoráveis à biodegradação, a serem utilizados no experimento conduzido em batelada em biorreator. Os micro-organismos com maior potencialidade para degradar óleo diesel e sem desenvolver atividade antagônica foram identificados como Staphylococcus saprophyticus UFPEDA 800, Serratia marcescens UFPEDA 839, Rhodotorula aurantiaca UFPEDA 845 e Candida ernobii UFPEDA 862, os quais formaram um consórcio microbiano misto, envolvendo bactérias e leveduras. Constatou-se, no planejamento fatorial, que o aumento da relação C:N favoreceu a biodegradação da fonte oleosa enquanto que o aumento da temperatura influenciou de forma desfavorável no referido processo, para uma significância estatística de 95%. Durante o processo em biorreator, foi verificado os seguintes resultados: aumento gradual de biomassa, redução (acima de 69 %) de todos os n-alcanos pertencentes à faixa de C9 a C21 , diminuição da tensão superficial (redução de 23,2%), e diminuição da toxicidade de sementes de hortaliças (germinação acima de 65%). Portanto, o consórcio microbiano misto selecionado apresenta potencialidade para degradar constituintes majoritários do óleo Diesel, podendo ser utilizado em processos de biorremediação de locais poluídos por esse combustível e a manutenção de condições apropriadas conduz a transformação dessa fonte oleosa em compostos menos tóxicos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9610_1.pdf: 1755785 bytes, checksum: db3a3dd74febc0b96e91a9d8d7728944 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Este trabalho objetiva o estudo da degradação de óleo diesel por micro-organismos isolados de amostras poluídas por petroderivados. As culturas foram selecionadas para formar um consórcio, e foram submetidas a ensaios em frascos de acordo com um planejamento fatorial completo 2³, a fim de determinar a temperatura (25, 30 ou 35°C), concentração de inóculo (1, 2 ou 3 blocos com 0,8 mm de diâmetro) e relação C:N (10:1, 50:1 ou 90:1) mais favoráveis à biodegradação, a serem utilizados no experimento conduzido em batelada em biorreator. Os micro-organismos com maior potencialidade para degradar óleo diesel e sem desenvolver atividade antagônica foram identificados como Staphylococcus saprophyticus UFPEDA 800, Serratia marcescens UFPEDA 839, Rhodotorula aurantiaca UFPEDA 845 e Candida ernobii UFPEDA 862, os quais formaram um consórcio microbiano misto, envolvendo bactérias e leveduras. Constatou-se, no planejamento fatorial, que o aumento da relação C:N favoreceu a biodegradação da fonte oleosa enquanto que o aumento da temperatura influenciou de forma desfavorável no referido processo, para uma significância estatística de 95%. Durante o processo em biorreator, foi verificado os seguintes resultados: aumento gradual de biomassa, redução (acima de 69 %) de todos os n-alcanos pertencentes à faixa de C9 a C21 , diminuição da tensão superficial (redução de 23,2%), e diminuição da toxicidade de sementes de hortaliças (germinação acima de 65%). Portanto, o consórcio microbiano misto selecionado apresenta potencialidade para degradar constituintes majoritários do óleo Diesel, podendo ser utilizado em processos de biorremediação de locais poluídos por esse combustível e a manutenção de condições apropriadas conduz a transformação dessa fonte oleosa em compostos menos tóxicos

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-06-30T19:06:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação com ficha catalografica.pdf: 611268 bytes, checksum: 466d9eb0160de7fc999ad4eb1c2e4696 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T19:06:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação com ficha catalografica.pdf: 611268 bytes, checksum: 466d9eb0160de7fc999ad4eb1c2e4696 (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / CNPQ / O petróleo é o recurso energético mais utilizado na sociedade atual, porém seu uso ocasiona grandes riscos de impactos ambientais. Portanto, a aplicação de técnicas como a biorremediação, que utiliza o metabolismo dos microrganismos, para eliminação ou redução de poluentes é aplicada em acidentes com petróleo e seus derivados. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a capacidade dos microrganismos em degradar petróleo e estabelecer as melhores condições para a biorremediação. Os microrganismos (18 bactérias e 14 fungos) utilizados pertencem as Coleções de Microrganismos da UFPE. Inicialmente foram selecionados 3 bactérias e 3 fungos com potencialidade para degradação do petróleo. Essas linhagens foram submetidas à aclimatação em concentrações crescentes do poluente. O consórcio foi definido através de delineamento experimental utilizando uma matriz de Plackett & Burman e o melhor consórcio foi submetido a um ensaio em reator. Dentre os fungos o Aspergillus oryzae apresentou a melhor taxa de degradação com 66,05% dos compostos alifáticos e a bactéria B15 apresentou percentual de 32,43%. O planejamento experimental mostrou o consórcio número 12 com degradação de 91,96% dos hidrocarbonetos alifáticos do petróleo. Em biorreator observa-se um perfil característico para um consórcio misto, com degradação dos hidrocarbonetos de 87,52%. Com base nos resultados, isoladamente o Aspergillus oryzae pode ser apontado como promissor na biorremediação e o consórcio selecionado também pode ser utilizado na degradação de hidrocarbonetos alifáticos de petróleo. / Oil is the most used energy resource in our society, but their use produces serious risks of environmental impacts. Therefore, the application of techniques such as bioremediation, which uses the metabolism of microorganisms for elimination or reduction of pollutants is applied in accidents petroderivados. The aim of this study was to evaluate the ability of microorganisms to degrade oil and establish the best conditions for bioremediation. The microorganisms (18 bacteria and 14 fungi) used belong Collections of Microorganisms, UFPE. Initially we selected three bacteria and three fungi with potential for oil degradation. These strains were subjected to acclimation at increasing concentrations of oil. The consortium was set by experimental design using a matrix of Plackett & Burman and best consortium submitted to a test reactor. Among the fungi Aspergillus oryzae showed the best degradation rate with 66.05% of aliphatic compounds and bacteria B15 presented a percentage of 32.43%. The planning consortium showed the number 12 with 91.96% of the degradation of aliphatic hydrocarbons from petroleum. In a bioreactor there is a characteristic profile for a mixed consortium, with degradation of the hydrocarbons of 87.52%. Based on results alone Aspergillus oryzae is reported as promising in bioremediation and the consortium can also be used in the degradation of aliphatic hydrocarbons from petroleum.

Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10705_77 - Esequiel Santos.pdf: 4699017 bytes, checksum: 5fc00aa9ef34cb4c3df7b834203d08c2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Diversos fatores podem interferir no desempenho da fitorremediação de herbicidas no solo, em particular a mineralogia e a atividade microbiana. Com o objetivo de realizar investigações em condições edáficas, utilizando as espécies Canavalia ensiformis e Crotalaria juncea, foi avaliado o efeito da mineralogia e da rizosfera na fitorremediação do herbicida sulfentrazone. Na primeira etapa, os tratamentos foram compostos pela combinação entre três tipos de solos, com texturas diferentes, variando quanto à mineralogia da fração argila dominada por um tipo de mineral (caulinita, hematita e gibbsita) e duas doses de sulfentrazone (0 e 400 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 3 x 2, em DBC, com três repetições. Para o bioensaio, foi semeada uma espécie bioindicadora de resíduo de sulfentrazone no solo, o milheto (Pennisetum glaucum). Os resultados demonstraram que a movimentação do herbicida foi maior no solo caulinítico e a retenção do herbicida foi maior no solo hematítico. A fitorremediação foi mais eficiente no pré-cultivo da C. ensiformis no solo gibbsítico, reduzindo em 28% a carga de sulfentrazone aplicada. Não houve resultado para o solo hematítico. No solo caulinítico, a C. ensiformis reduziu a massa total de sulfentrazone em aproximadamente 11% e a C. juncea em 19%. Na segunda etapa, avaliou-se também a contribuição microbiana rizosférica dessas mesmas espécies na fitorremediação do sulfentrazone. Os tratamentos foram compostos pela combinação de dois solos rizosféricos (feijão de porco e crotalária) e um não-rizosférico com quatro níveis de contaminação pelo herbicida sulfentrazone (0, 200, 400 e 800 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 4. Foram avaliados evolução de CO2, carbono da biomassa microbiana (CBM), quociente metabólico (qCO2), componentes biométricos e fitotoxidade no P. glaucum, em bioensaio e cromatografia líquida do solo. Os resultados indicaram que o cultivo das espécies fitorremediadoras promoveu incremento da atividade microbiana e foi verificado que os perfis genéticos bacterianos foram formados de acordo com a planta e a característica de solo (rizosférico e não rizosférico), ampliando os conhecimentos a respeito das associações entre as plantas e microrganismos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2410_1.pdf: 3630733 bytes, checksum: e4b1eea91bbba672bf8b2b12163d4f10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Acidentes com derrames de petróleo ou seus derivados em ambientes sensíveis, como os estuários, provocam um grande impacto ambiental. A limpeza dessas áreas contaminadas necessita de cuidados e de tecnologias que reduzam os efeitos do contaminante no meio ambiente. Nesse sentido, tecnologias biológicas de degradação dos hidrocarbonetos, em processos chamados de biorremediação, são apontadas como eficazes no tratamento de áreas degradadas. Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos no intuito de elucidar os processos degradativos dos hidrocarbonetos, aeróbios e anaeróbios, e as tecnologias de biorremediação. O presente trabalho avaliou dois tratamentos de biorremediação, atenuação natural e atenuação natural incentivada, em condições laboratoriais, de um sedimento estuarino contaminado com óleo diesel. Como forma de incentivo buscou-se uma maior biodisponibilidade do contaminante, com o uso de um biossurfatante. Foram monitorados parâmetros físico-químicos e biológicos durante 111 dias de tratamento. A avaliação da degradação foi realizada através do acompanhamento dos 16 hidrocarbonetos poliaromáticos (HPAs) considerados prioritário pela U.S. Environmental Protection Agency (U.S.EPA, 2009). A quantificação das bactérias heterotróficas totais indicou um possível período de adaptação da microbiota à contaminação. Dentre os 16 HPAs quantificados, o naftaleno apresentou uma maior percolação na coluna, uma vez que a contaminação foi realizada no topo da mesma. Isso pode ser atribuído a sua maior solubilidade em água, 31 mg/L. Os HPAs de menor peso molecular apresentaram uma maior oscilação de concentração nos primeiros 45 dias de tratamento, enquanto que os de maior peso molecular apresentaram comportamentos semelhantes, com processos de disponibilização mais tardia e significativas reduções do T62 para o T111. Foi possível observar indícios de remoção de 82% do composto pireno no tratamento de atenuação natural nos 111 dias estudados. No tratamento de atenuação natural incentivada observou-se uma redução gradual até o T62, porém no T111 ocorre uma nova disponibilização do contaminante, no entanto do T0 até o T111 ocorre uma remoção de 36% do pireno. De uma maneira geral, o somatório dos 16 HPAs, para ambos os tratamentos nas amostras de superfície, teve redução em sua concentração após o T62, período esse com um significativo crescimento no número de bactérias heterotróficas. Bons indícios de degradação anaeróbia foram observados nos tratamentos adotados, porém não foram verificadas diferenças entre os tratamentos, ou seja, o biossurfatante não solubilizou os HPAs a níveis significativos à biodegradação, como o esperado

A gasolina comercial no Brasil contém elevada concentração de etanol (20 a 25% em volume, v v-1) que tende a aumentar a solubilidade dos hidrocarbonetos, principalmente do benzeno, tolueno e xilenos (BTX), em água e pode ser preferencialmente degradado pelos micro-organismos no ambiente em relação aos outros compostos da gasolina. Além disso, os compostos da gasolina são considerados fontes de carbono hidrofóbicas que em contato com a microbiota do meio tendem a ser utilizados como substrato, podendo produzir biossurfactantes. Em caso de contaminação a fração BTX pode ser removida do ambiente pelo processo de biorremediação. Neste trabalho foram realizados três estudos de biorremediação que simularam contaminação de solo com 5% em massa (m m-1) de combustível (gasolina comercial, gasolina pura, etanol) e de meio líquido com 1% v v-1 de gasolina comercial em sistema denominado de fechado (frascos de vidro fechados) ou de aberto (tubos de PVC de 100 x 5 cm). O estudo 1 visou selecionar o solo proveniente de duas distintas localizações de um landfarming (com histórico de contaminação com borra oleosa) e neste solo foi adicionada a gasolina comercial (24% v v-1de etanol), de modo a isolar dele micro-organismos de maior potencial na degradação dos compostos do combustível. Os micro-orgnismos obtidos, na forma de isolados ou consórcios, foram avaliados em meio líquido com 1% v v-1 de gasolina comercial, em sistema fechado, visando selecionar os melhores micro-organismos degradadores dos compostos da gasolina comercial. No estudo 2 foram utilizados três processos de biorremediação: bioestimulação (com nutrientes) com e sem bioaumentação (com consórcio) e o de atenuação natural, conduzidos em istema fechado, contendo solo e 5% m v-1 de gasolina comercial. No estudo 3 foram empregados os processos de bioestimulação em solo (com 1% m m-1 de glicose) e atenuação natural, com 5% m v-1 de combustível (gasolina comercial, gasolina pura ou etanol) em sistema fechado na profundidade de 1 cm e no aberto em diferentes profundidades (1, 50 e 100 cm). No estudo 1, pelos consórcios formados com quatro isolados, dos sete selecionados, do landfarming, verificou-se redução dos compostos da gasolina comercial em aproximadamente 98%, em meio líquido em um período de 3 dias, em sistema fechado. No estudo 2, o processo de bioaumentação (adição de micro-organismos na forma de consórcio) com bioestimulação, não apresentou diferença significativa de biodegradação da gasolina comercial em relação aos demais processos, em sistema fechado. No estudo 3, os solos contaminados com os combustíveis gasolina comercial e etanol, apresentaram maior liberação de CO2 nos dois processos estudados, bioestimulação com 1% de glicose e atenuação natural. Os experimentos com gasolina comercial (24% v v-1de etanol) apresentam dados que indicam que a presença do etanol beneficiou a maior degradação dos hidrocarbonetos desta gasolina em sistema aberto. Os dados também mostram que os compostos BTX das gasolinas atingiram concentrações abaixo dos valores de interdição ambiental, em 1 cm de profundidade, nos dois sistemas e nas condições estudadas. Também, em sistema aberto estes compostos da gasolina comercial atingiram concentrações abaixo dos valores de interdição ambiental, nas três profundidades e nos dois processos estudados. Entretanto, esse comportamento não foi verificado nos compostos da gasolina pura nesses processos em sistema aberto, exceto em 1 cm de profundidade. / Brazilian commercial gasoline contains a high concentration of ethanol (20 to 25%) which tends to increase the solubility of hydrocarbons, mainly benzene, toluene and xylenes (BTX), in water and can be degraded by microorganisms preferably to other gasoline compounds. Furthermore, gasoline compounds are considered hydrophobic carbon sources which in contact with the environment microbiota tend to be used as substrate and might produce biosurfactants. In case of contamination by these compounds, they can be removed from the environment by bioremediation, namely, the removal of contaminants by the action of microorganisms. In the present work, three bioremediation studies have been carried out simulating soil contamination with 5% fuel (commercial gasoline, pure gasoline and ethanol) and liquid media with 1% commercial gasoline in closed (closed glass flasks) and open systems (plastic tubes, 100 cm x 5 cm). The study 1 aimed to select the soil from two distinct locations on a landfarming site with an historic of contamination by commercial gasoline, in order to isolate microorganisms with the higher degrading potential. The obtained microorganisms under the form of isolates or consortiums were evaluated in liquid medium with 1% commercial gasoline, in closed system with glass flasks, in order to select the best degrading microorganisms for the compounds of commercial gasoline (24% ethanol). In study 2 three processes of bioremediation have been employed: bioestimulation (with nutrients) with and without bioaugmentation (with consortium) and natural attenuation carried out in closed flasks containing soil and 5% commercial gasoline. In study 3, the processes of bioestimulation (with 1% glucose) and natural attenuation in soil with 5% fuel, commercial gasoline, pure gasoline or ethanol in closed flasks and in PVC tubes were carried out. In study 1, consortiums formed by the four isolates with the higher commercial gasoline compounds degrading potential, selected from the landfarming site, reduced the commercial gasoline compounds in approximately 98% in liquid medium within a period of 3 days. In study 2, closed system, the bioaugmentation process (addition of microorganisms in the form of consortiums) with bioestimulation, did not show a significant difference when compared to other processes in a closed system. In study 3 the soils contaminated with commercial gasoline and ethanol, presented higher CO2 liberation in both studied processes: bioestimulation with 1% glucose and natural attenuation. Experiments with commercial gasoline (24% ethanol) showed data indicating that the presence of ethanol benefited further degradation of gasoline hydrocarbons in this open system. The data also showed that BTX of gasoline reached concentrations below the environmental values of prohibition in 1 cm depth in both systems and conditions studied. Also, in an open system of commercial gasoline these compounds reached concentrations below the environmental values of interdiction in three depth sand in both cases studied. However, this be havior was not observed in the compounds of pure gasoline in these processes in open system, except in 1 cm depth.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Apêndice I. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-18T18:32:08Z No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T12:23:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DéboraFarageKnuppdosSantos_Parcial.pdf: 6708225 bytes, checksum: 0340ad0794bc4ae6a1b51344c09e8c3c (MD5) / A resistência antimicrobiana tem sido uma grande ameaça à saúde humana, dada a disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) em patógenos e micro-organismos clinicamente importantes, promovendo o aparecimento de cepas multirresistentes de difícil tratamento, complicado também pela queda na quantidade de novos antibióticos lançados no mercado. Assim, pesquisas por determinantes genéticos da resistência a antibióticos em isolados clínicos têm sido intensificadas desde os primeiros relatos de resistência antimicrobiana no começo do século XX. Neste contexto, a diversidade ambiental dos ARGs vem sendo subestimada, apesar do conhecimento de que a origem destes genes são os ambientes naturais, em particular o solo. Os micro-organismos presentes nesses ambientes são, em sua maioria, ainda não cultiváveis e consequentemente desconhecidos, o que os torna importantes fontes de novos genes e biomoléculas de interesse biotecnológico. Entretanto, analisar sua totalidade depende de técnicas independentes de cultivo. A metagenômica apresenta-se como uma ferramenta importante, já que acessa os micro-organismos de uma dada amostra ambiental pela extração do seu DNA total, permitindo identificar genes de interesse por abordagem de sequência ou funcional. Na pesquisa por novos ARGs, a metagenômica funcional é de grande valia para identificar novos mecanismos de resistência antimicrobiana e inferir a real diversidade de ARGs no meio ambiente, além de investigar os papéis ecológicos destes genes fora do ambiente clínico. Em trabalho anterior, observou-se a presença de três genes para putativas dioxigenases em dois clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de pequenos insertos (com insertos de 3-8 Kb) construída com DNA de amostras de solo de Cerrado. Nesta Tese, apresentam-se dois capítulos: o primeiro aborda a hipótese de que as dioxigenases putativas estão associadas ao fenótipo resistente observado. Dessa forma, três subclones foram construídos e denominados AMX3(2), AMX3(3) e CRB2(1), para posteriores análises fenotípicas e estruturais, onde CRB2(1) mostrou-se capaz de causar resistência à carbenicilina em Escherichia coli – adicionalmente, também mostrou-se capaz de resistir à ação do fenol. Em análises estruturais e enzimáticas, inferiu-se que o inserto é uma extradioldioxigenase com domínio bicupina, sendo uma provável gentisato 1,2-dioxigenase (GDO). Estas enzimas são importantes no metabolismo de compostos aromáticos, o que as torna potenciais em processos de biorremediação. No segundo capítulo está descrita a análise das sequências de seis clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de grandes insertos (com insertos de mediana de 35 Kb), também construída com amostras de DNA de micro-organismos de solo de Cerrado. A anotação gênica somou um conjunto de dados de aproximadamente 0,27 Mb, num total de 172 prováveis genes. Tais ORFs foram agrupadas em oito diferentes classes, de acordo com funções selecionadas. Dentre elas, 1,2% eram referentes a enzimas previamente relacionadas à resistência antimicrobiana e 5,8% a transportadores, que também são importantes protagonistas na resistência a xenobióticos. Apesar da grande diversidade de funções observadas, a maior parte das ORFs foi anotada como hipotéticas, sendo fontes para descrição de possíveis novos ARGs, assim como de genes de interesse biotecnológico. Essas observações indicam que a diversidade de ARGs em ambientes naturais difere daquela classicamente encontrada em isolados clínicos, o que evidencia a importância em acessar micro-organismos ambientais na tentativa de revelar novos mecanismos de resistência a antibióticos, que vem a enriquecer o conhecimento sobre seus papéis ecológicos e auxiliar pesquisas das indústrias biotecnológicas, como na prospecção de antimicrobianos e em processos de biorremediação. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial resistance poses a grave threat to human health given the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs) in pathogens and in clinically important microorganisms, promoting the rise of multiresistant strains of difficult treatment, also aggravated by the decreasing quantity of new antimicrobials launched onto the market. Hence, since the first reports of antimicrobial resistance in the beginning of the 20th century, the research for the genetic determinants of antimicrobial resistance have been intensified. In this context, the environmental diversity of ARGs was underestimated, despite the knowledge that such genes are environmental-born, especially on the soil. The majority of environmental microorganisms are not yet cultivable and remain unknown, being an important source for novel genes and biomolecules of biotechnological interest. However, analyzing them requires culture independent techniques. Metagenomics rise as a powerful tool, since it access the microorganisms from an environmental sample by the extraction of their total DNA, allowing for the identification of genes of interest by sequence and functional approaches. In the search for new ARGs, functional metagenomics is a valuable method to identify novel mechanisms for antibiotic resistance and infer the actual diversity of environmental ARGs, while exploring their ecological roles outside the clinical setting. In a former work, three putative dioxigenase genes were observed in two resistant clones isolated from a small-insert metagenomic library (insert size 3-8 Kb) constructed with DNA samples from Cerrado soil. In this Thesis, two chapters are provided: the former addresses the hypothesis in which putative dioxygenases are involved in the resistant phenotype observed. In this manner, three subclones were constructed and named AMX3(2), AMX3(3) and CRB2(1), for further phenotypical and structural analysis, where CRB2(1) proved resistant to carbenicillin in Escherichia coli – additionally, it was also able to resist the action of phenol. In the structural and enzymatic assays, the insert was presupposed as an extradioldioxygenase with a bicupin domain, most probably a gentisate 1,2-dioxygenase (GDO). These are important enzymes on aromatic metabolism and potential resources in the bioremediation industry. The latter chapter describes the sequence analysis of six resistant clones isolated from a large-insert metagenomic library (insert size around 35 Kb), also constructed with DNA samples from Cerrado soil. Gene annotation comprised a 0.27 Mb dataset, summing 172 probable genes. Such ORFs were grouped in eight different classes, according to preselected functions. Within these, 1.2% were related to enzymatic mechanisms of resistance and 5.8% were classified as transporters, that also play important roles on xenobiotic resistance. Although a great diversity of functions were observed, a greater number of ORFs was classified as hypothetical, being sources for the description of novel ARGs as well as of other genes of biotechnological relevance. These observations imply that the diversity of environmental ARGs differ from that classically observed in clinical isolates, which shows the importance in accessing environmental microorganisms in the attempt to reveal new mechanisms to antibiotic resistance, which may enrich the knowledge on their ecological roles and aid biotechnological researches, such as in antimicrobial bioprospection and in bioremediation processes.

O antraceno, o fenantreno e o pireno são hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) que podem ser carcinogênicos e que não são degradados pela maioria dos microrganismos do solo. A biorremediação é uma estratégia para eliminação dos HAPs, que pode demandar a inoculação de microrganismos degradadores e a modificação das condições químicas e físicas do solo. O objetivo do presente estudo foi isolar, identificar e caracterizar microrganismos degradadores e mineralizadores de antraceno, fenantreno e pireno em meio mineral e no solo, assim como avaliar a influência do pH e da disponibilidade de água, N, P, Fe e S na biorremediação de um solo contaminado com antraceno. Seis amostras de solo de landfarming foram inoculadas individualmente a um solo contaminado em laboratório com antraceno. Após 176 dias, o solo com maior produção de C-CO2 foi utilizado para o enriquecimento em meio mineral mais antraceno. Os microrganismos foram isolados e identificados pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A capacidade dos microrganismos em degradar os 3 HAPs no meio mineral e no solo foi avaliada por cromatografia gasosa. A mineralização de diferentes concentrações de antraceno, fenantreno e pireno no solo foi avaliada por respirometria, assim como o efeito de diferentes doses de N, P, S e Fe, de diferentes pH e umidades do solo na mineralização do antraceno. Isolou-se do solo de landfarming um consórcio microbiano composto por 6 bactérias, identificadas como Mycobacterium fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae bacterium e Naphthaleneutilizing bacterium, e um fungo, Fusarium oxysporum. O consórcio microbiano degradou respectivamente 48, 67 e 22% do antraceno, fenantreno e pireno do meio mineral. No solo o consórcio degradou, em média, mais de 92% e mineralizou mais de 78% das diferentes concentrações destes 3 HAPs em 70 dias. As maiores mineralizações do antraceno ocorreram nos solos com as maiores umidades gravimétricas (12,5%) e pH (7,5). A adição de 100 kg ha-1 ou mais de nitrogênio no solo e a conseqüente redução da relação C:N para valores inferiores a 67:1 diminuíram a mineralização do antraceno no solo. O aumento da disponibilidade do fósforo, do ferro e do enxofre e a presença de amplas relações C:P (1076:1 a 50:1) e C:N:P (1076:16:1 a 50:1,3:1) no solo não influenciaram a mineralização do antraceno. Conclui-se que a seleção e a inoculação ao solo de microrganismos degradadores de HAPs, associado a modificação das condições ambientais, pode conduzir a um eficiente processo de biorremediação, onde a grande maioria dos HAPs é mineralizada em curto período de tempo.