Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4336_1.pdf: 722665 bytes, checksum: c543b1ebd862fb84b7b994b8a1d49b3b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Blechnum brasiliense e Blechnum occidentale são pteridófitas de hábito terrestre, de distribuição geográfica tropical e subtropical. O presente estudo teve como objetivos monitorar populações de cada uma dessas espécies, durante 12 meses, determinar a distribuição espacial, além de correlacionar a produção de frondes e o desenvolvimento dos esporófitos com parâmetros climáticos (pluviosidade mensal, temperatura média, umidade relativa do ar). O estudo foi realizado na Mata da Reserva, no município de Bonito, Pernambuco Brasil. Ambas as populações apresentaram padrão de distribuição agregado. A população de Blechnum brasiliense apresentou um ritmo sazonal da produção, senescência e taxa de expansão foliar e apresentou correlação significativa apenas com a pluviosidade. Blechnum occidentale apresentou sazonalidade apenas na produção e liberação de esporos, demonstrou correlação inversa com a pluviosidade. As taxa de produção de frondes de Blechnum brasiliense e Blechnum occidentale correspondem às de outras espécies de porte similar. A produção de esporos das duas espécies se concentra na estação seca (setembro a maio). Em Blechnum occidentale há sincronia na produção e liberação de esporos. Há uma assincronia na liberação de esporos em Blechnum brasiliense, o que pode contribuir para o aproveitamento de um maior número de microhabitats recém expostos e evitar a perda total da produção, em período desfavorável. Os dados apresentados no presente estudo podem contribuir para estratégias de manejo e conservação da área

A epilepsia é uma das desordens mais frequente do sistema nervoso central com aproximidamente 2% de prevalência mundial e 30% de refratariedade. O uso das plantas medicinais é uma possibilidade de identificar novas moléculas com potencial terapêutico. Nesse estudo, utilizamos o modelo de convulsão induzida pelo ácido caínico em zebrafish adulto, para explorar o potencial terapêutico da samambaia Blechnum brasiliense Desv. Primeiramente, utilizando cromatografia liquida de ultra eficiência, foi validado método analítico para quantificação do ácido rosmarínio na fração acetato de etila, obtida por fracionamento do extrato bruto da planta. A fração apresentou teor de 0,0764 g% de ácido rosmarínico. A partir desta fração foi realizado isolamento em coluna preparativa para obtenção do composto para testes em peixe-zebra. Nos ensaios toxicológicos em embriões de zebrafish foram avaliados o extrato bruto e a fração acetato de etila de B. brasiliense, bem como ácido rosmarínico isolado, possibilitando o cálculo das doses letais médias (DL50). Os valores foram 363,3 μg/mL para o extrato, 196,3 μg/mL para a fração e 250,3 μM para o ácido rosmarínico. Os resultados demonstraram que as amostras apresentaram toxicidade aos embriões apenas nas maiores concentrações testadas. Nos ensaios realizados com zebrafish adultos, todas as amostras foram capazes de modular o perfil e a intensidade da convulsão causada pelo ácido caínico, bem como a latência para a primeira crise clônica. As doses ativas foram: 20 mg/kg para o extrato bruto, 5 e 10 mg/kg para a fração acetato de etila e 1 mg/kg para o ácido rosmarínico, sendo capazes de reduzir as crises e aumentar o tempo de latência no modelo de epilepsia em zebrafish. Assim, nosso estudo indica a espécie Blechnum brasiliense como fonte de substância com potencial terapêutico a ser explorada para o tratamento da epilepsia. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system with approximately 2% of world prevalence and 30% of refractoriness. The use of medicinal plants is a possibility to identify new molecules with therapeutic potential. In this study, we used the caynic acid-induced convulsion model in adult zebrafish to explore the therapeutic potential of the Blechnum brasiliense Desv fern. Firstly, using ultra-efficient liquid chromatography, we validated an analytical method for the quantification of rosmarinic acid in the ethyl acetate fraction, obtained by plant crude extract fractionation. The fraction presented a content of 0.0764 g% of rosmarinic acid. From this fraction was carried out the preparative column isolation of the compound for tests in zebrafish. In the toxicological tests using zebrafish embryos, were evaluated the crude extract and the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, as well as, the isolated rosmarinic acid, allowing the calculation of median lethal doses (LD50). The values were 363.3 μg/mL for the extract, 196.3 μg/mL for the fraction and 250.3 μM for the rosmarinic acid. The results showed that samples presented toxicity to the embryos only in the highest concentrations tested. In the trials with adult zebrafish, all samples were able to modulate the profile and intensity of the convulsion caused by kainic acid, as well as, the latency for the first clonic crisis. The active doses were 20 mg/kg for the crude extract, 5 and 10 mg/kg for the ethyl acetate fraction, and 1 mg/kg for rosmarinic acid, being able to reduce the crises and increase the latency time in the zebrafish model of epilepsy. Thus, our study indicates the species Blechnum brasiliense as a source of substance with therapeutic potential to be explored for the treatment of epilepsy.

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.

A epilepsia é uma das desordens mais frequente do sistema nervoso central com aproximidamente 2% de prevalência mundial e 30% de refratariedade. O uso das plantas medicinais é uma possibilidade de identificar novas moléculas com potencial terapêutico. Nesse estudo, utilizamos o modelo de convulsão induzida pelo ácido caínico em zebrafish adulto, para explorar o potencial terapêutico da samambaia Blechnum brasiliense Desv. Primeiramente, utilizando cromatografia liquida de ultra eficiência, foi validado método analítico para quantificação do ácido rosmarínio na fração acetato de etila, obtida por fracionamento do extrato bruto da planta. A fração apresentou teor de 0,0764 g% de ácido rosmarínico. A partir desta fração foi realizado isolamento em coluna preparativa para obtenção do composto para testes em peixe-zebra. Nos ensaios toxicológicos em embriões de zebrafish foram avaliados o extrato bruto e a fração acetato de etila de B. brasiliense, bem como ácido rosmarínico isolado, possibilitando o cálculo das doses letais médias (DL50). Os valores foram 363,3 μg/mL para o extrato, 196,3 μg/mL para a fração e 250,3 μM para o ácido rosmarínico. Os resultados demonstraram que as amostras apresentaram toxicidade aos embriões apenas nas maiores concentrações testadas. Nos ensaios realizados com zebrafish adultos, todas as amostras foram capazes de modular o perfil e a intensidade da convulsão causada pelo ácido caínico, bem como a latência para a primeira crise clônica. As doses ativas foram: 20 mg/kg para o extrato bruto, 5 e 10 mg/kg para a fração acetato de etila e 1 mg/kg para o ácido rosmarínico, sendo capazes de reduzir as crises e aumentar o tempo de latência no modelo de epilepsia em zebrafish. Assim, nosso estudo indica a espécie Blechnum brasiliense como fonte de substância com potencial terapêutico a ser explorada para o tratamento da epilepsia. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system with approximately 2% of world prevalence and 30% of refractoriness. The use of medicinal plants is a possibility to identify new molecules with therapeutic potential. In this study, we used the caynic acid-induced convulsion model in adult zebrafish to explore the therapeutic potential of the Blechnum brasiliense Desv fern. Firstly, using ultra-efficient liquid chromatography, we validated an analytical method for the quantification of rosmarinic acid in the ethyl acetate fraction, obtained by plant crude extract fractionation. The fraction presented a content of 0.0764 g% of rosmarinic acid. From this fraction was carried out the preparative column isolation of the compound for tests in zebrafish. In the toxicological tests using zebrafish embryos, were evaluated the crude extract and the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, as well as, the isolated rosmarinic acid, allowing the calculation of median lethal doses (LD50). The values were 363.3 μg/mL for the extract, 196.3 μg/mL for the fraction and 250.3 μM for the rosmarinic acid. The results showed that samples presented toxicity to the embryos only in the highest concentrations tested. In the trials with adult zebrafish, all samples were able to modulate the profile and intensity of the convulsion caused by kainic acid, as well as, the latency for the first clonic crisis. The active doses were 20 mg/kg for the crude extract, 5 and 10 mg/kg for the ethyl acetate fraction, and 1 mg/kg for rosmarinic acid, being able to reduce the crises and increase the latency time in the zebrafish model of epilepsy. Thus, our study indicates the species Blechnum brasiliense as a source of substance with therapeutic potential to be explored for the treatment of epilepsy.

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.

A epilepsia é uma das desordens mais frequente do sistema nervoso central com aproximidamente 2% de prevalência mundial e 30% de refratariedade. O uso das plantas medicinais é uma possibilidade de identificar novas moléculas com potencial terapêutico. Nesse estudo, utilizamos o modelo de convulsão induzida pelo ácido caínico em zebrafish adulto, para explorar o potencial terapêutico da samambaia Blechnum brasiliense Desv. Primeiramente, utilizando cromatografia liquida de ultra eficiência, foi validado método analítico para quantificação do ácido rosmarínio na fração acetato de etila, obtida por fracionamento do extrato bruto da planta. A fração apresentou teor de 0,0764 g% de ácido rosmarínico. A partir desta fração foi realizado isolamento em coluna preparativa para obtenção do composto para testes em peixe-zebra. Nos ensaios toxicológicos em embriões de zebrafish foram avaliados o extrato bruto e a fração acetato de etila de B. brasiliense, bem como ácido rosmarínico isolado, possibilitando o cálculo das doses letais médias (DL50). Os valores foram 363,3 μg/mL para o extrato, 196,3 μg/mL para a fração e 250,3 μM para o ácido rosmarínico. Os resultados demonstraram que as amostras apresentaram toxicidade aos embriões apenas nas maiores concentrações testadas. Nos ensaios realizados com zebrafish adultos, todas as amostras foram capazes de modular o perfil e a intensidade da convulsão causada pelo ácido caínico, bem como a latência para a primeira crise clônica. As doses ativas foram: 20 mg/kg para o extrato bruto, 5 e 10 mg/kg para a fração acetato de etila e 1 mg/kg para o ácido rosmarínico, sendo capazes de reduzir as crises e aumentar o tempo de latência no modelo de epilepsia em zebrafish. Assim, nosso estudo indica a espécie Blechnum brasiliense como fonte de substância com potencial terapêutico a ser explorada para o tratamento da epilepsia. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system with approximately 2% of world prevalence and 30% of refractoriness. The use of medicinal plants is a possibility to identify new molecules with therapeutic potential. In this study, we used the caynic acid-induced convulsion model in adult zebrafish to explore the therapeutic potential of the Blechnum brasiliense Desv fern. Firstly, using ultra-efficient liquid chromatography, we validated an analytical method for the quantification of rosmarinic acid in the ethyl acetate fraction, obtained by plant crude extract fractionation. The fraction presented a content of 0.0764 g% of rosmarinic acid. From this fraction was carried out the preparative column isolation of the compound for tests in zebrafish. In the toxicological tests using zebrafish embryos, were evaluated the crude extract and the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, as well as, the isolated rosmarinic acid, allowing the calculation of median lethal doses (LD50). The values were 363.3 μg/mL for the extract, 196.3 μg/mL for the fraction and 250.3 μM for the rosmarinic acid. The results showed that samples presented toxicity to the embryos only in the highest concentrations tested. In the trials with adult zebrafish, all samples were able to modulate the profile and intensity of the convulsion caused by kainic acid, as well as, the latency for the first clonic crisis. The active doses were 20 mg/kg for the crude extract, 5 and 10 mg/kg for the ethyl acetate fraction, and 1 mg/kg for rosmarinic acid, being able to reduce the crises and increase the latency time in the zebrafish model of epilepsy. Thus, our study indicates the species Blechnum brasiliense as a source of substance with therapeutic potential to be explored for the treatment of epilepsy.

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.