Orientador: Antonio Nader Filho / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Resumo: Estudou-se 94 estirpes de Staphylococcus aureus obtidas do leite de vacas com mastite subclínica em duas propriedades rurais no estado de São Paulo. Essas estirpes foram caracterizadas fenotipicamente quanto a produção de biofilmes pelos testes do agar vermelho congo e pelo teste de aderência em microplacas e também foram genotipicamente identificadas pela presença dos genes icaA e icaD responsáveis pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Além disso, todas as estirpes foram também submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Os resultados obtidos revelaram que 85% das estirpes produziram biofilmes "in vitro" para o teste do agar vermelho congo. No teste de aderência em placas foi verificado que 98,9% das estirpes produziram biofilme, devido a forte aderência nas placas de polietileno. A presença dos genes icaA e icaD foi encontrada em 95,7% das estirpes de S. aureus. No antibiograma foi observado que sete estirpes foram resistentes aos seguintes antimicrobianos: cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, gentamicina, oxacilina e penicilinaG, sendo que as maiores resistências ocorreram frente a gentamicina (2,2%) e a penicilina G (6,6%). Na avaliação dos testes fenotípicos com os genotípicos o teste de aderência em microplacas foi o mais sensível (100%), sendo indicado para identificar estirpes produtoras de biofilmes. Todos os testes, com exceção do antibiograma, foram estatisticamente significativos (p<0,05). / Abstract: 94 Staphylococcus aureus strains obtained from milk samples of cows suffering from subclinical mastitis in dairy herd, in two properties, in the state of São Paulo were evaluated. These strains were characterized by the in vitro slime production on the Congo red agar, biofilm formation and by the presence of icaA and icaD genes which are responsible for the intercellular adhesion. All strains were too subjected to in vitro susceptibility to 12 different antibiotics. The results revealed that 85% of isolates tested produced slime on the Congo red agar and 98,9% of the isolates produced biofilm in vitro by the adherence in sterile 96-well "U" bottom polystyrene tissue culture plates. 95,7% of isolates possessed the icaA and icaD genes. The results of in vitro antibiotic susceptibility assay to 12 different antibiotics revealed that seven isolates were resistance to follow antibiotics: clorphenicol, clindamicin, erythromycin, gentamicin, oxacillin and penicillin, the higher resistance occurred to penicillin (6,6%) and gentamicin (2,2%). In the study of phenotypic tests compared with genotypic test, the 96-well polystyrene tissue culture plates assay was the most sensitivity (100%) and is recommended with genotypic test for the investigation biofilm formation in S. aureus. All the tests, exception of antibiotic susceptibility assay were statistically significant (p<005). / Mestre

Resumo: O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana in vitro dos extratos de algumas plantas endêmicas do Cerrado, tais como Baccharis dracunculifolia, Cochlospermum regium, Croton antisyphiliticus, Eugenia dysenterica e Lippia sidoides, frente a estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de leite de vacas com mastite e de fontes de contaminação envolvidas na epidemiologia da mastite bovina. Os extratos foram preparados a partir das partes aéreas e sistema radicular das plantas, utilizando os solventes metanol, hexano e clorofórmio, por processo de maceração estática. Para avaliação da atividade antimicrobiana foram aplicadas as técnicas de difusão em disco, microdiluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (MBC). Dentre os extratos que apresentaram atividade bacteriostática, o extrato hexânico de Baccharis dracunculifolia destacou-se com CIM de 10 mg/mL sobre 45% das estirpes. Enquanto o extrato clorofórmico de Croton antisyphiliticus, com atividade bactericida, inibiu a multiplicação de 100% das estirpes de Staphylococcus aureus, com CIM variando entre 1,03mg/mL e 4,15 mg/mL. O estudo demonstra ainda, que tais extratos vegetais apresentaram resultados superiores aos obtidos com a gentamicina, princípio ativo muito utilizado no combate à mastite bovina, reforçando a importância das plantas medicinais como recurso terapêutico. / Abstract: The purpose of this study was to assess the potential of in vitro antimicrobial activity of the extracts of certain endemic plants in the Brazilian Cerrado, such as Baccharis dracunculifolia, Cochlospermum regium, Croton antisyphiliticus, Eugenia dysenterica and Lippia sidoides, against strains of Staphylococcus aureus isolated from the milk of cows with mastitis and sources of contamination involved in the epidemiology of bovine mastitis. The extracts were prepared by using aerial parts and radicular systems of the plants, using methanol, hexane and chloroform as solvents, extracted with static maceration. Techniques of disc diffusion, broth microdillution for the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) were used for the assessment of antimicrobial activity. Among the extracts with bacteriostatic activity, the hexanic extract of Baccharis dracunculifolia had a 10 mg/mL MIC against 45% of the strains, whereas the chloroformic extract of Croton antisyphiliticus, with bactericidal activity, inhibited the multiplication of 100% of the Staphylococcus aureus strains, whose MIC varied between 1.03mg/mL and 4.15 mg/mL. The study also demonstrated that the results of these plant extracts are superior to the results obtained with gentamicin, an active principle commonly used against bovine mastitis, reinforcing the importance of medicinal plants as a therapeutic resource. / Orientador:Luiz Augusto do Amaral / Coorientadora: Ana Maria Soares Pereira / Banca: Bianca Waléria Bertoni / Banca: Oswaldo Durival Rossi Junior / Mestre

Resumo: Entre os diferentes tipos de patógenos que podem ser transmitidos pelo leite e produtos lácteos, Staphylococcus aureus é um dos mais importantes. Então, torna-se fundamental sua pesquisa em produtos lácteos destinados ao consumo humano. A presente tese investigou 100 amostras de leite do tanque de expansão de 50 fazendas leiteiras no Oeste de Santa Catarina, usando o método de cultivo em Baird-Parker, obtendo 42% de amostras positivas para a presença do agente. A análise das condições de manejo de ordenha não apresentou correlação com a presença do agente nas amostras de leite. A metodologia de referência para detecção de S. aureus recomenda a utilização do ágar Baird-Parker (BP). No entanto, outros meios de cultura podem produzir resultados em um tempo mais curto, como Petrifilm® Staph Express Count System (PSE) e da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Assim, este estudo também teve como objetivo comparar a eficiência desta metodologia para a detecção de S. aureus no leite dos tanques. Os resultados mostraram que a PCR - utilizando os primers Sa442- 1 e Sa442-2 - não apresenta limiares de Sensibilidade (53,8), Especificidade (36,5) VPP (23), VPN (69,2), Acurácia (41,0) e Coeficiente de Kappa (-0,067) que justifiquem a sua utilização como método de detecção de S. aureus em amostras de leite de tanque, quando comparado ao cultivo microbiológico em BP. Resultado semelhante foi obtido com o uso do método PSE (100; 14,9; 29,2; 100; 37; 0,083 respectivamente), cuja baixa Especificidade sugeriu incluir também outros estafilococos coagulase-positivos não S. aureus. Investigou-se também a presença de resíduos de antibióticos com Delvotest®. No entanto, não pôde ser estabelecida a correlação entre os resultados dos exames microbiológicos e PCR com os resultados de resíduos de antimicrobianos, devido à ausência desses resíduos nas amostras de leite avaliadas / Abstract: Among the different types of pathogens that can be transmitted by milk and dairy products, Staphylococcus aureus is one of the most important. Then, it becomes fundamental its research in dairy products for human consumption. The present thesis investigated 100 samples of bulk tank milk from 50 dairy farms in the western parto of Santa Catarina, by using the method of cultivation in Baird- Parker, obtaining 42% positive samples to the presence of the agent. The analysis of the management conditions of milking doesn't showed correlaction with the presence of S. aureus in the milk samples. The reference methodology for Staphylococcus aureus detection recommends the use of the Baird-Parker agar (BP). However, others culture media may produce results in a more shorter time, as Petrifilm® Staph Express Count System (PSE) and the Polymerase Chain Reaction (PCR). So, this study also aimed to compare the efficiency of the fore cited methodology for the detection of Staphylococcus aureus in bulk tank milk. The findings showed that PCR - using the primers Sa442-1 e Sa442-2 - doesn't show thresholds of sensitivity (53,8), specificity (36,5), PVP (23), PVN (69,2), Accuracy (41,0) and Kappa Coefficient (-0,067) that justify their use as a method of detection of S. aureus in bulk tank milk samples, when compared to microbiological cultivation in BP. Similar results were obtained with the use of PSE method (100; 14,9; 29,2; 100; 37; 0,083 respectivelly), whose low threshold of Specificity (14,9) suggested include also other staphylococci coagulase-positive other than S. aureus. In addition, antibiotic residues were investigated with Delvotest®. However, could not be established the correlation between the results of microbiological tests and PCR with the results of antimicrobial residues, due to the absence of these residues in the milk samples evaluated / Orientador: Paulo Francisco Domingues / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Hélio Langoni / Banca: Jose Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Adll Knackfuse Vaz / Banca: Nilson Roberti Benites / Doutor

Resumo: Entre agosto de 2005 e dezembro de 2006, foram obtidas 245 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de vacas com mastite, de óstios papilares da glândula mamária e de insufladores da ordenhadeira, procedentes de um rebanho bovino produtor de leite tipo B. Com a finalidade de monitorar as estirpes de S. aureus envolvidas em casos de mastite bovina por meio da verificação da relação epidemiológica existente entre as estirpes isoladas, especialmente com vistas aos sítios de localização e vias de transmissão, as estirpes foram submetidas à Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), à amplificação das seqüências codificadoras (sea, seb, sec, sed e tst), por intermédio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e suas sensibilidades in vitro a 12 antimicrobianos foram determinadas. Os resultados obtidos revelaram 51 diferentes perfis, sendo que a resistência à penicilina foi a predominante entre as 179 (73,1%) estirpes de S. aureus, quando considerada de forma particular (54,8%) ou em conjunto (29,4%). As 66 (26,9%) estirpes restantes foram sensíveis aos 12 antimicrobianos testados e a vancomicina foi o único princípio ativo que se mostrou eficiente a 100% das estirpes testadas. A PFGE revelou 39 pulsotipos distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Dentre estas, 92 (67,1%) estirpes apresentaram resistência a um ou mais antimicrobianos e foram agrupadas em 22 (88,0%) pulsotipos distintos. Foi observado, também, por meio da PFGE, que nenhum pulsotipo foi isolado por mais de três colheitas consecutivas e que somente o pulsotipo 29 foi identificado em 5 (31,2%) colheitas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two hundred and forty five Staphylococcus aureus strains were isolated between August of 2005 and December of 2006 from samples collected from a type-B milk-producing herd. Samples encompassed milk collected directly from mastitic cows, papillas osteuns of mammary glands, and milking machine cups. Samples were subjected to Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) to monitor for the strains of S. aureus and to determine epidemiologic relationships between the isolated strains, taking into account the different precedence of strains. PFGE was used to monitor the presence of specific coding sequences (i.e., sea, seb, sec, sed, and tst) in the milk samples using polymerase chain reaction (PCR) amplification. Moreover, sensitivity of strains to 12 different antibiotics was determined in vitro. Results revealed the presence of 51 different PFGE profiles of S. aureus in the samples, and highlighted 179 (73.1%) penicillin resistant strains. Nonetheless, the 66 (26.9%) other strains were sensitive to all 12 antibiotics tested, and vancomycin was the only antibiotic effective against all tested strains. PFGE also revealed 39 distinct peaks with 25 of them (64.1%) being present in 137 (55.9%) strains obtained from milk. Of these strains, 92 (67.1%) were resistant to one or more antibiotics, and were further grouped in 22 (88.0%) distinct peaks. Additionally, PFGE revealed the presence of no distinct peaks in samples from three consecutive collection times, and that peak 29 was the only one identified in 5 collection times (31.2%). Importantly, PGFE also indicated that in the periods A and H, which corresponded to 12.5% of the total time points, the isolated strains from one collection day (samples from all 3 sources) all had the peaks 2 and 12, respectively...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Carlos Augusto Fernande de Oliveira / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Doutor