Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Flavia Lombardi Lopes / Coorientador: Daniel Robert Arnold / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Luiz Sérgio de Almeida Camargo / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Naiara Zoccal Saraiva / Resumo: Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Roberto Sartori Filho / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Margot Alves Nunes Dode / Resumo: Objetivou-se com o presente estudo avaliar a criotorerância de mórulas e blastocistos produzidos in vivo de doadoras da raça Sindi e Nelore (Bos indicus) e Holandês Preto e Branco (HPB - Bos taurus). No Experimento 1, 24 fêmeas lactantes e não lactantes da raça Sindi foram superovuladas com 100 mg de FSH suíno com protocolos em que as duas últimas aplicações de FSH foram substituídas ou não por 300 UI de eCG. Sete dias após a indução da ovulação, os embriões foram colhidos e avaliados quanto ao estágio de desenvolvimento embrionário e grau de qualidade. Dois terços dos embriões foram destinados à criopreservação, dos quais metade foi congelada pelo método convencional, com curva de resfriamento de -0,5ºC/min e a outra metade foi vitrificada pela técnica de Cryotop. Em seguida, foram descongelados e transferidos para receptoras sincronizadas, de maneira contemporânea aos embriões frescos. No Experimento 2, 31 fêmeas da raça Nelore foram superovuladas com 133 mg de FSH suíno e os dois terços dos embriões colhidos foram criopreservados e transferidos semelhantemente ao Experimento 1. No Experimento 3, 67 vacas lactantes e novilhas da raça HPB foram superovuladas com 500 e 300 UI de FSH suíno, respectivamente, e após a colheita dos embriões foram adotados os mesmos procedimentos realizados nos Experimentos 1 e 2. Os resultados foram analisados por modelos lineares generalizados e estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Nos Experimentos 1 e 2, os embriões transferidos a fresco apresentaram maior taxa de concepção aos 30 dias do que os vitrificados e congelados (54,8±7,4a, 17,7±7,3b e 19,5±6,6%b; respectivamente; P 0,0013) na raça Sindi (n=231 embriões) e (46,0±6,1a; 31,2±5,4b e 28,1±5,3%b; respectivamente, P 0,04) na raça Nelore (n=297 embriões). O estágio de desenvolvimento embrionário parece não... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the cryotolerance of morulae and blastocysts produced in vivo in Sindhi and Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) donnors. In Experiment 1, 24 lactating and non-lactating Sindhi donnors were superovulated with 100 mg porcine FSH with protocols in which the last two FSH treatments were replaced or not by 300 IU eCG. Embryos were collected 7 days after ovulation induction and embryo development and quality degree were accessed. Two thirds of the embryos were cryopreserved, by the conventional freezing or Cryotop method. After that, embryos were thawed and transferred to synchronized recipients, simultaneously to fresh embryos. In Experiment 2, 31 Nelore cows were superovulated with 133 mg porcine FSH and two thirds of the embryos were cryopreserved and transferred similarly to Experiment 1. In Experiment 3, 67 Holstein lactating dairy cows and heifers were superovulated with 500 and 300 IU pFSH, respectively, and the same procedures were performed as in Experiments 1 and 2. Results were analyzed using generalized linear models and are presented as least squares means ± standard error. In Experiments 1 and 2, fresh embryos had a higher conception rate at Day 30 than those vitrified and frozen (54.8±7.4a, 17.7±7.3b and 19.5±6.6%b; respectively; P 0.0013) in Sindhi donnors (n=231 embryos) and (46.0±6.1a; 31.2±5.4b and 28.1±5.3%b; respectively; P 0.04) in Nelore donors (n = 297 embryos). Embryo developmental stage seems to have not influenced conception rates of Zebu embryos, especially cryopreserved ones. Finnaly, in Experiment 3, conception rates of fresh and cryopreserved embryos were similar (37.4±12.3, 24.5±11.3 and 21.0±9.5%; respectively, P>0.15) and also no difference was detected for the cryotolerance of morulae versus blastocysts (P>0.10) / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Naiara Zoccal Saraiva / Banca: Maria Emilia Franco Oliveira / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Clara Slade Oliveira / Banca: Fabio Morato Monteiro / Resumo: Embriões produzidos in vitro (PIV) apresentam baixa sobrevivência aos métodos convencionais de criopreservação. Na tentativa de melhorar a produção e taxa de sobrevivência embrionária após a vitrificação foram utilizados reguladores metabólicos L-carnitina (CA), Forskolina (FO) e Ácido linoleico conjugado trans-10; cis-12 (CLA), separadamente ou em associação em diferentes doses, à partir do quarto (D4) ou sexto (D6) dia do cultivo de desenvolvimento embrionário. No experimento 1 o uso de 2,5 mM de CA influenciou positivamente na produção (62,0±12,5%, P=0,02), expansão (60,7%, P=0,009) e eclosão (41,1%, P=0,04). No experimento 2, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação com FO (P=0,2), entretanto, a dose de 15,0μM afetou positivamente a expansão (53,2%, P=0,001) e eclosão (46,8%, P0,001). No experimento 3, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação do meio de cultivo com CLA (P=0,4), no entanto a dose de 150,0 μM afetou positivamente a expansão (85,5%, P=0,001) e eclosão (70,9%, P=0,001) dos embriões reaquecidos e cultivados por 48 horas. No experimento 4, a associação dos reguladores de metabolismo lipídico utilizados não influenciou a produção de embriões (P=0,16), entretanto o melhor resultado de produção observado foi no tratamento com 15,0 μM de FO individualmente. As taxas de expansão e eclosão foram influenciadas pela suplementação com reguladores de metabolismo adicionados individualmente ou em associação (P=0,001). A melhor taxa de expansão foi observada na suplementação associando CA+FO+CLA, com 90,05%, que não diferiu (P>0,05) da suplementação com CLA (86,4) e da associação CA+CLA (87,9%). Entretanto, a melhor taxa de eclosão foi obtida com CLA (71,8%, P=0,01), superior aos demais tratamentos. Foi concluído que o uso dos... / Abstract: Embryos produced in vitro (IVP) have low survival to conventional cryopreservation methods. In attempt to improve the production and the rate of embryo survival to the cryopreservation process, was used the metabolic regulators, L-carnitine (CA), forskolina (FO) and the conjugated linoleic acid isomers trans-10, cis-12 (CLA), separately or in combination in different doses, starting the fourth (D4) or sixth (D6) days of the embryo culture development in vitro. In experiment 1, the best results of production (62,0 ± 12,5%, P = 0,02), expansion (60,7%, P = 0,009), and hatching (41,1 % P = 0,04) was obtained using 2,5 mM of CA. In experiment 2, the production of embryos was not influenced by supplementation with FO (P=0,2), however, the dose of 15,0μM was the best result of expansion (53,2%) and hatching (46,8%) (P=0,001). In experiment 3, the production of embryos was not influenced by supplementation with CLA (P=0,4), however, the dose of 150,0 μM resulted in higher rates of expansion (85,5%, P=0,001) and hatching (70,9%, P=0,001). In the experiment 4, the embryo production was not influenced by the supplementations (P=0,16), however the best result of the production was using 15,0μM of FO individually. The expansion and hatching rates was influenced by supplementation with the metabolism regulators added individually or in a combination (P=0,001). The best expansion rate was observed with the association CA+FO+CLA (90,05%), that was not different (P>0,05) of the CLA (86,4%) or CA+CLA (87,9%) groups. However, the best hatching rate was obtained with CLA (71,8%), which was higher to the other treatments (P=0.01). In conclusion, the use of the metabolic regulators CA, FO and CLA from the fourth day of the embryo culture in vitro increase ... / Doutor

Orientador: César Roberto Esper / Banca: marcelo Emilio Beletti / Banca: Pietro Sampaio Baruselli / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Humberto Tonhati / Resumo: Este estudo teve como objetivo acompanhar o processo de desenvolvimento testicular desde a fase indiferenciada até sua completa formação. Embriões e fetos de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus) foram obtidos em frigoríficos. Imediatamente após o abate das fêmeas, o útero era aberto e os embriões e fetos coletados. As gônadas e os embriões menores foram fixados em Bouin e processados para microscópica óptica convencional. Foi realizada a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) dos embriões cujo sexo não pode ser identificado macroscopicamente. A crista gonádica foi observada, primeiramente, em um embrião de 1,0 cm de comprimento. Em embriões com 2,5 cm de comprimento, a presença da albugínea permitiu a identificação do sexo. A espessura média da albugínea variou de 29,1 a 558,5 mm. O mediastino encontra-se localizado centralmente. Houve uma diminuição no espaço ocupado pelos cordões testiculares de 63,7 para 42,0% do volume total dos testículos. O seu diâmetro variou de 31,7 a 48,8 mm. O diâmetro das células germinativas (e dos seus núcleos) foi de 12,3 (6,6) a 16,9 (14,2) mm. A quantidade de células germinativas, por corte transversal de cordão, diminuiu de um máximo de 2,8 para 0,8. O número total de células germinativas aumentou de 16, no princípio da colonização da gônada, para 18,3 x 106 no final do estudo. O número de células de Sertoli, por corte transversal de cordão, variou de 10,0 a 16,2. Os resultados obtidos mostram que a origem e a formação dos testículos nos embriões e fetos de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus), ocorrem de forma muito semelhante à descrita para Bos taurus taurus. / Abstract: The aim of this study was to accompany the process of testicular development from the indifferentiable phase to its complete formation. Embryos and fetuses of Nelore breed cows (Bos taurus indicus) were obtained in slaughterhouses near the Uberlandia city, Minas Gerais. As soon as the females were slaughtered, the uterus was opened and the embryos and fetuses gathered. The gonads and the smaller embryos were fixed in Bouin's fixative and afterwards processed for conventional optical microscopy. It was carried out the PCR (Polymerase Chain Reaction) from parts of embryos whose sex could not be identified macroscopically. The gonadal ridge was observed firstly in a 1.0 cm long embryo. In 2.5 cm long embryos the presence of the albuginea allowed the sex identification. The mean thickness of the albuginea ranged from 29.1 to 558.5 mm. Gradually increase of vascularization of the albuginea and parenchyma was observed. The mediastinum was located centrally. There was a decrease in the space occupied by the testicular cords, from 63.7 to 42.0 % of the total testes volume. Its diameter ranged from 31.7 to 48.8 mm. The diameter of germinal cells (and their nuclei) ranged from 12.3 (6.6) to 16.9 914.2) mm. The quantity of germinal cells by cross section of cord decreased from a maximum of 2.8 to 0.86. The total number of germinal cells was from 16 at the beginning of colonization of the gonad to 18.3 x 106 at the end of the study. The number of Sertoli's cells by cross section of cord ranged from 10.0 to 16.2. The results showed that the origin and formation of testes in embryos and fetuses from Nelore breed cows (Bos taurus indicus) does occur in a very similar way to what is described for Bos taurus taurus. / Doutor

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Fábio Morato Monteiro / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Ricarda Maria dos Santos / Resumo: As suplementações de bovinos com fontes de ácidos graxos poliisaturados (AGPs) são formas de aumentar o nível energético das dietas, além de possuir efeito na reprodução dos ruminantes. Tendo em vista o exposto idealizouse o presente trabalho com o objetivo de avaliar as condições reprodutivas do pósparto, número de folículos, quantidade de oócitos totais, de viáveis e a PIVE de doadoras primíparas da raça Nelore (Experimento 1) e multíparas da raça Holandesa (Experimento 2) suplementadas com dieta rica em AGPs protegido (Megalac-E®, principalmente de n-6) e não protegido (Linhaça, principalmente de n- 3) durante o pré e pós-parto. No experimeto 1 as doadoras Nelore foram divididas aleatoriamente em 3 grupos, sendo que o grupo controle apresentou 7 fêmeas, o segundo grupo, com 8 animais que foram suplementados com uma fonte de gordura protegida contendo 100g/doadora/dia de Megalac-E® e o terceiro grupo com 7 fêmeas suplementadas com uma fonte de gordura não protegida contendo 1kg/doadora/dia de torta de linhaça. As dietas foram fornecidas por 30 dias pré-parto e 75 dias pós-parto. Estes animais foram submetidos à OPU nos dias 30, 45, 60 e 75 pós-parto. No experimento 2 as doadoras Holandesa foram divididas aleatoriamente em 3 grupos, sendo que o grupo controle apresentava 6 fêmeas, o segundo grupo, com 5 animais que foram suplementados com uma fonte de gordura protegida contendo 100g/doadora/dia de Megalac-E® no pré-parto e 300g/doadora/dia no pós-parto e o terceiro grupo com 5 fêmeas suplementadas com uma fonte de gordura não protegida contendo 1kg/doadora/dia de torta de linhaça no pré-parto e 1,5kg/doadora/dia no pós-parto. As dietas foram fornecidas por 30 dias pré-parto e 60 dias pós-parto. Estes animais foram submetidos à OPU nos dias 30, 45 e 60 pós-parto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The supplementation of cattle with sources of polyunsaturated fatty acids (PUFA) are ways to increase the energy level of the diet, in addition to having effect on reproduction. The aim of this study were to evaluate the reproductive conditions of the postpartum, number of follicles, aspirates oocytes, amount of viable oocytes and the IVPE of the Nelore primiparous donors (Experiment 1) and Holstein multiparous donors (Experiment 2) supplemented with rich diet in protected PUFA (Megalac-E®) and non-protected (Linseed) during pre and postpartum. In experiment 1 Nelore donors were divided into three groups, the control group with 7 animals, the second group, with 8 animals were supplemented with a source of protected fat contains 100g/donor/day of Megalac-E® and the third group with 7 animals supplemented with a source of unprotected fat contains 1kg/donor/day linseed. The diets were fed for antepartum thirty days and postpartum seventy-five days. These animals were submitted to OPU on days 30, 45, 60 and 75 postpartum. In Experiment 2 Holstein donors were divided into three groups, the control group with 6 animals the second group, with 5 animals were supplemented with a source of protected fat contains 100g/donor/day of Megalac-E® in pre-partum and 300g/donor/day in postpartum and the third group with 5 animals supplemented with a source of fat unprotected contains 1kg/donor/day linseed pre-partum and 1.5 kg/donor/day in postpartum. The diets were fed for antepartum thirty days and postpartum sixty days. These animals were submitted to OPU on days 30, 45 and 60 postpartum. The recovered oocytes from both experiments were selected and the viable oocytes were submitted to procedures of the IVPE. The data from both experiments were analyzed by the method of least squares using variance analysis... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Aline Costa de Lucio Prado / Banca: Lúcia Galvão de Albuquerque / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Doses de sêmen enriquecidas com espermatozoides portadores do cromossomo X são utilizadas na inseminação artificial (IA) e na produção in vitro de embriões (PIVE). Todavia ensaios de campo, utilizando este tipo de sêmen, demonstraram redução na taxa de prenhez, que pode ser justificada pelas injúrias espermáticas durante o processo de sexagem, além de alterações no DNA, interferindo na expressão de genes paternos, afetando o desenvolvimento embrionário e acarretando perda gestacional após 90 dias. Assim, os objetivos desse trabalho foram: comparar a taxa de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro utilizando sêmen convencional e sêmen com espermatozoides sexados por citometria de fluxo e verificar a existência de diferenças na expressão de genes relacionados ao reconhecimento da gestação (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α) em embriões produzidos in vitro utilizando os dois tipos de sêmen. Os embriões bovinos foram produzidos por fecundação in vitro, quarenta e oito horas após a fecundação foi avaliada a taxa de clivagem, e no sétimo dia após a fecundação foi avaliada a taxa de blastocisto. Posteriormente esses blastocistos foram submetidos à extração de RNA para a avaliação da expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) para as taxas de clivagem e blastocisto entre os grupos experimentais. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo não alterou os níveis de transcritos dos genes AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α sugerindo que embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação. Porém o gene mPGES-1 foi 4,54 vezes menos expresso nos embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo, sugerindo a possibilidade de ocorrência de perda gestacional, pois estudos ... / Abstract: Doses of semen enriched with carriers of X chromosome sperm are used in artificial insemination (AI) and in embryos produced in vitro (PIVE). However, field studies using this type of semen demonstrated a reduction in pregnancy rate, which can be justified by injuries during sperm sexing and alterations in DNA, interfering with the expression of paternal genes affecting embryonic development and resulting in pregnancy loss after 90 days. The aims of this study were to compare the cleavage and blastocyst rates produced in vitro using conventional semen and sexed semen by flow cytometry, and check differences in the expression of genes related to pregnancy recognition (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α ) in embryos produced in vitro using the two types of semen. Bovine embryos were produced by in vitro fertilization, forty eight hours after fertilization the cleavage rate was evaluated, and on the seventh day after fertilization the blastocyst rate was performed. Subsequently, these blastocysts were subjected to RNA extraction for evaluation of gene expression. No significant differences (P>0.05) for cleavage and blastocyst rates between the experimental groups were observed. Related to the expression pattern, the flow cytometry did not alter the transcript levels of AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α genes, suggesting that embryos produced with sexed semen by flow cytometry do not have detrimental changes in genes involved in pregnancy recognition. However the mPGES-1 gene was expressed 4,54 times less in embryo produced with sexed semen by flow cytometry, suggesting the possibility of pregnancy loss, since studies suggest that are required levels of expression of mPGES for maintenance and recognition of pregnancy / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cesar Roberto Esper / Banca: Marcos Brandão Dias Ferreira / Resumo: As biotecnologias da reprodução são utilizadas como uma alternativa para melhorar a eficiência reprodutiva e acelerar a produção de animais de alto valor zootécnico. Este estudo teve por objetivo avaliar a taxa de concepção de novilhas e vacas mestiças inseminadas com sêmen sexado e convencional (Experimento 1) e a taxa de concepção de novilhas e vacas mestiças submetidas a transferência de embriões produzidos in vivo (TE) e in vitro (PIVE) com sêmen sexado (Experimento 2). No experimento 1, sêmen sexado e convencional foram utilizados na inseminação de vacas (n=50) e novilhas (n=50) após 18-24 horas de observação de cio; no experimento 2 embriões produzidos in vitro (n=50) e in vivo (n=40) foram transferidos para vacas (n=45) e novilhas (n=45). Animais inseminados com sêmen sexado apresentaram taxa de concepção de 44% (11/25) para vacas e 52% (13/25) para novilhas e com sêmen convencional, a taxa de concepção foi de 72% (18/25) para vacas e 68% (17/25) para novilhas. A taxa de concepção obtida pela técnica de produção in vitro de embriões foi de 24% (6/25) para vacas e 28% (7/25) para novilhas e para os embriões produzidos in vivo foi de 45% (9/20) tanto para vacas como para novilhas. A técnica de IA com sêmen sexado apresentou diferença estatística (p<0,05) quando comparada com sêmen convencional, porém a categoria animal não teve diferença estatística (p>0,05) (Experimento 1). Não foi observada diferença estatística (p>0,05) entre a as técnicas de produção in vivo e in vitro de embriões nem entre a categoria animal. Os resultados indicam que o intervalo entre a observação de cio e inseminação de 18-24 horas mostrou-se eficaz na concepção tanto de vacas como de novilhas utilizando sêmen sexado ou convencional, no entanto para se aproximar aos resultados obtidos pelo sêmen convencional há necessidade de mais pesquisas para melhorar a taxa de concepção com sêmen sexado ... / Abstract: The reproduction biotechnologies are used as an alternative to improve reproductive efficiency and accelerate the production of animals of high performance zootechnical. This study aimed to evaluate the conception rate of heifers and cows crossbred inseminated with sexed semen and conventional (Experiment 1) and conception rate of heifers and cows crossbred receiving the transfer of embryos produced in vivo (TE) and in vitro (PIVE) with sexed semen (Experiment 2). In experiment 1, sexed and conventional semen were used for the insemination of cows (n = 50) and heifers (n = 50) after 18-24 hours of estrous observation; in experiment 2 embryos produced in vivo (n = 40) and in vitro (n = 50) were transferred to cows (n = 45) and heifers (n = 45). Animals inseminated with sexed semen showed conception rate from 44% (11/25) for cows and 52% (13/25) for heifers and with conventional semen, the conception rate was 72% (18/25) for cows and 68% (17/25) for heifers. The conception rate obtained by the technique of in vitro production of embryos was 24% (6/25) for cows and 28% (7/25) for heifers and for embryos produced in vivo was 45% (9/20) both for cows as for heifers. The technique of AI with sexed semen presented statistical difference (p <0.05) when compared with conventional semen, but animal category was not statistically different (p> 0.05) (Experiment 1). No statistical difference (p> 0.05) between the production techniques in vivo and in vitro embryo or between animal category was observed. The results indicate that the interval between estrous observation and insemination 18-24 hours was effective on conception of both cows and heifers using conventional and sexed sêmen, however to approximate of the results obtained by the conventional semen is no need to most research to improve conception rates with sexed semen (Experiment 1). Conception rates with embryos PIVE in heifers and cows recipients were lower than those produced in ... / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Flávia Lombardi Lopes / Coorientador: Naiara Zoccal Saraiva / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Felipe Perecin / Resumo: O excessivo acúmulo lipídico que acontece ao longo da produção in vitro de embriões (PIVE) tem sido apontado como prejudicial à criopreservação. Como o soro fetal bovino (SFB) é um dos fatores que provoca maior impacto neste acúmulo, e pelo mesmo ser de composição indefinida, procura-se substituí-lo nos meios de cultivo. Entre os possíveis substitutos, está o composto semi-definido, livre de ácidos graxos, a albumina sérica bovina (BSA). O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da BSA e/ou SFB na MIV sobre o acúmulo lipídico nos oócitos e embriões bovinos, e para isso, cinco experimentos foram realizados. No primeiro experimento, demostrou-se que o meio contendo SFB possui dezoito vezes mais lipídeos que o meio contendo apenas BSA como fonte proteica. No segundo experimento, confirmou-se que, ao contrário da maturação in vivo, a maturação in vitro (MIV) provoca acúmulo lipídico, sendo este acúmulo mais acentuado no grupo suplementado exclusivamente com SFB, comparado ao grupo suplementado com BSA, sem observar-se diferença nos tamanhos das gotas oocitárias entre os grupos. Oócitos maturados na presença do SFB apresentaram melhores taxas de maturação nuclear e citoplasmática, porém, mostraram diferenças com relação à quantidade e migração de lipídeos e mitocôndrias em comparação àqueles obtidos após maturação in vivo. Nos experimentos III e IV, observou-se que, além de não levar a uma esperada diminuição da quantidade de lipídeos nos blastocistos produzidos, a BSA na MIV levou a menores taxas de desenvolvimento embrionário. Sobre o tamanho das gotas embrionárias, constatou-se que a MIV suplementada com SFB provoca maior porcentagem de gotas entre 2 a 6 μm de diâmetro comparada a MIV suplementada por ambas as substancias. Além do mais, percebeu-se um aumento do tamanho das gotas ao longo da PIVE independente da suplementação ... / Abstract: The excessive lipid accumulation that occurs during in vitro production of embryos (IVPE) has been described as harmful to cryopreservation. Because fetal bovine serum (FBS) is one of the factors that cause the greatest impact in this accumulation, and because it is an undefined medium supplement, current research is aimed at replacing this supplement in culture media. Among the possible substitutes, there is a semi defined compound, fatty acid free bovine serum albumin (BSA). The present study aimed to evaluate the influence of BSA and/or FBS during IVM on lipid accumulation in oocytes and embryos, and for that, five experiments were performed. The first experiment demonstrated that the medium containing FBS has eighteen times more lipids than the medium containing only BSA as a protein source. In the second experiment, it was confirmed that, unlike in vivo maturation, in vitro maturation (IVM) causes a lipid accumulation, which is more pronounced in the group supplemented only with FBS, compared with BSA group, without showing difference in oocytes droplets sizes between groups. Oocytes matured in the presence of FBS showed better rates of nuclear and cytoplasmic maturation, however, they also showed differences relative to the amount and migration of lipids and mitochondrias in comparison to those obtained after in vivo maturation. In the experiments III and IV, it was observed that the expected decrease in the amount of lipids produced in blastocysts, supplemented solely with BSA, did not take place, and the use of BSA alone in IVM led to lower rates of embryo development. Furthermore, for embryos lipid droplets sizes, a higher percentage of droplets between 2-6μm was observed in IVM supplemented with FBS compared to supplemented with both substances.The last experiment determined the expression of genes involved in lipid synthesis, DGAT2 and PLIN2. Increased expression of PLIN2 and ... / Mestre

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address) / Doutor