Chez les mammifères, le passage d’une génération à une autre nécessite la reprogrammation du génome. Cette reprogrammation nécessite la déméthylation de l’ADN parternel et maternel ainsi que celle des lysines des histones suite à la fécondation. Des familles d’enzymes ont récemment été associées à ces processus : les déaminases, notamment Aicda (activation-induced cytosine deaminase), et les Tet (Ten-eleven translocation) désoxygénase, Tet1, Tet2 et Tet3. Plusieurs déméthylases des lysines des histones (KDM) ont été identifiées au cours des dernières années mais très peu d’informations sont disponibles à leur sujet, particulièrement en ce qui a trait à l’embryon bovin. Notre étude s’est attardée à dresser un profil d’expression spatiotemporel de ces familles d’enzymes lors des différents stades embryonnaires précoces chez la vache. Nous suggérons que Tet3 participe activement à la déméthylation de l’ADN, possiblement assisté par Tet2, mais sans Tet1 ni Aicda. Nous montrons également que KDM3A, KDM4A, KDM4C et KDM5B sont présents à des stades et à des endroits précis de l’embryon suggérant ainsi un rôle dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces informations ouvrent la voie à de nouvelles recherches afin de comprendre les modifications de l’épigénome et de réduire les anomalies épigénétiques rencontrées chez les animaux issus de certains protocoles de reproduction assistée. / In mammals, the transition from one generation to the next requires genomic reprogramming. Such epigenetic change is mediated by paternal and maternal DNA demethylation as well as histone lysines demethylation after fertilization, which is a poorly understood process. Some family of enzymes have recently been associated to those process: the deaminases, like Aicda (activation-induced cytosine deaminase), and Tet (Ten-eleven translocation) dioxygenases, Tet1, Tet2 and Tet3. Many lysine specific histone demethylases (KDM) have been identified in the past few years but little is known about their roles in mammalian embryo. The objective of this study was to develop of a spatiotemporal expression profile of those proteins at different preimplantation stage of bovine embryo. We suggest an active participation of Tet3 in DNA methylation, possibly supported by Tet2 but without Tet1 or Aicda. We also demonstrate the presence and specific localization of KDM3A, KDM4A, KDM4C and KDM5B which may suggest a role during the different embryonic stages. This information opens up the possibilities for further research in order to reduce epigenetic abnormalities associated to assisted reproduction technologies.

En utilisant une méthode à haut rendement, les micropuces, nous avons pu établir le profil d'expression génétique d'embryons produits in vivo et in vitro. Suite à l'établissement de ces profils génétiques, nous les avons comparés pour déterminer le traitement in vitro qui fournit le profil embryonnaire le plus proche de ceux in vivo. En général, tous les traitements contenant du sérum en maturation et/ou en développement ont obtenu un profil similaire à celui des in vivo, tandis que ceux qui évoluaient en co-culture, en milieu semi-défini et défini ont un profil qui dévie largement par rapport à celui des in vivo. Les résultats obtenus suggèrent, entre autre, que le sérum a un impact plutôt positif sur l'expression génétique embryonnaire et que l'utilisation de milieux complètement définis est très nocif pour l'embryon de même qu'un ajout de sérum en fin de développement.

Introduction: Le développement pré-implantatoire et particulièrement la formation d'un blastocyste de qualité constitue l'un des événements les plus importants pour l'implantation et l'induction de la grossesse. In vitro, 30% à 40% seulement des ovocytes aboutissent à la formation de blastocystes et juste une faible proportion de ces derniers, supposés morphologiquement être "en bonne santé" sont capables de réussir le développement post-implantation. Cette limitation pose un grand problème pour les technologies de fécondation in Vitro (FIV) ce qui nécessite le développement d'une bonne approche permettant de se prononcer sur la compétence embryonnaire. La notion de compétence demeure difficile à définir sur des bases morphologiques et cinétiques. Considérant que la sélection d'un blastocyste de qualité est l'un des objectifs majeurs de la FIV chez l'humain et que le bovin représente un très bon modèle pour telle une étude, nous nous sommes fixés comme objectif d'analyser le profil d'expression génique du blastocyste bovin à trois stades de développement (début cavité, en expansion et éclos). Cette étude nous renseignera non seulement sur la régulation moléculaire de l'expansion et l'éclosion du blastocyste mais nous permettra également de définir des marqueurs potentiels de la compétence au développement et d'avoir un outil utile pour caractériser les différentes étapes de ces changements morphologiques (classification) Méthodes: Les blastocystes sont produits in vitro et collectés au stade début cavité (apparition d'une petite cavité), en expansion (diamètre supérieur à une zone pellucide normale) et éclos (sans zone pellucide). Pour procéder à notre étude transcriptomique, l'ARN est extrait, amplifié, marqué puis hybride en "loop design experiment" (biopuce maison ADNc, BlueChip). Pour valider les résultats des biopuces, certains gènes candidats ont été sélectionnés et confirmés par Q-RT-PCR. Résultats: À l'issue de l'analyse des données de biopuces, différents gènes impliqués par exemple dans l'implantation, l'adhésion cellulaire et la digestion de la matrice extracellulaire ont été trouvés comme sur-exprimés au stade éclos. Les blastocystes au stade début cavité, ont été en contre partie plutôt enrichis en gènes dont les produits sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, la traduction et la transcription. Les résultats de la Q-RT-PCR ont positivement validé les résultats de biopuce à un taux de 87,5% (7/8). Certains de ces gènes candidats confirmés par Q-RT-PCR (IFNT, PLAC8, SSLP1, AKR1B1, HNRNPA2B1, ARGFX, NANOS et CCNB1) s'avèrent particulièrement intéressants comme marqueurs potentiels de la compétence embryonnaire surtout qu'on a détecté leur expression aussi tôt que le stade blastocyste. Conclusions: Notre étude procure de nouvelles connaissances sur la régulation moléculaire de la formation du blastocyste. D'autres part, la liste des gènes différentiellement exprimés pourra faciliter dans lefutur, le choix et l'étude de marqueurs éventuels de la compétence ainsi que la classification des blastocystes lorsqu'il s'agirait d'investiguer l'effet du traitement sur le développement embryonnaire.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Les histones et leurs modifications épigénétiques remodèlent la chromatine et influencent la régulation génique en modifiant les interactions entre la machinerie transcriptionnelle et l'ADN. Cependant on ignore l'exacte implication de ces facteurs dans les pouvoirs de totipotence et de reprogrammation associés à l'ovocyte ou encore dans l'activation du génome embryonnaire. Malgré plusieurs études détaillées sur les modifications post-traductionnelles des histones dans l'ovocyte et dans le jeune embryon, les enzymes potentiellement aptes à les catalyser n'ont pas fait l'objet d'exploration aussi approfondie. Dans cet ouvrage, nous avons investigué le profil d'expression de 24 régulateurs clés principalement impliqués dans l'acétylation et la méthylation des histones pendant la période comprise entre l'ovocyte immature et le blastocyste bovin. Ces analyses nous ont permis d'associer certains événements épigénétiques avec la présence de divers candidats étudiés. Une histone acétyltransferase, MYST4, a été sélectionnée pour une caractérisation plus exhaustive. Nous avons retrouvé MYST4 à l'intérieure de cellules spécialisées impliquées dans la gamétogénèse. De plus, des événements spécifiques d'acétylation peuvent être associés avec sa présence pendant cette période. L'histone Hl spécifique à l'ovocyte (H1FOO) a aussi été examinée plus en profondeur. En plus d'avoir suivi l'expression de l'ARNm et de la protéique H1FOO dans l'ovocyte et pendant le dévelopement embryonnaire, nous avons mis en place une stratégie afin de déterminer si H1FOO a le potentiel de contrôler la transcription de certains gènes. Nos observations préliminaires suggèrent que l'histone H1FOO ne peut réguler l'expression génique par elle même, mais qu'elle est quand même impliquée dans la modulation de la structure de la chromatine. À un certain point, la régulation de l'expression génique de l'ovocyte et du jeune embryon doit nécessairement faire appel à un remodelage de la chromatine, cependant les acteurs impliqués dans ce processus fondamental demeurent élusifs. Nos études de MYST4 et H1FOO associent ces gènes avec divers événements spécifiques se déroulant sur la chromatine des gamètes et embryons. De plus nos analyses de profils d'expression apportent des indices sur l'implication de plusieurs autres gènes pendant cette période de développement. Les résultats présentés dans cette thèse contribuent à éclaircir la représentation globale de la modulation de la chromatine par les facteurs épigénétiques. / Histones and their post-translational modifications remodel the chromatin and influence gene regulation by altering the interactions between the transcriptional machinery and DNA. During oocyte and embryo development, important transcriptional events occur, but the exact contribution of histones and epigenetic modifications in oocyte totipotency and reprogramming capabilities or in the activation of the embryonic genome are still enigmatic. Despite numerous detailed studies on post-translational histone modifications in oocytes and early embryos, the enzymes potentially involved have been somewhat neglected. In this work, we have investigated the expression profile of 24 key regulators primarily linked with histone acetylation and methylation in the period between immature bovine oocyte and blastocyst. The profiles obtained for the different candidates were associated with different epigenetic events occurring during this time period. One particular histone acetyltransferase, MYST4, has caught our attention and was selected for further characterization. In this study MYST4 was associated with specialized cells during gametogenesis. Furthermore, specific acetylation events are linked to the presence of MYST4 during this period. The oocyte-specific histone Hl subtype (H1FOO) was also further characterized. Although different hypotheses have been formulated about its implication in chromatin modulation and gene regulation, little information based on facts is actually available. After investigating the presence of H1FOO mRNA and protein in oocytes and early embryos, we established a strategy to discover if H1FOO had the potential to control the transcription of different genes. Our preliminary observations suggest that H1FOO, by itself, does not regulate gene expression but is involved in the modulation of the chromatin structure. It is thought that the regulation of gene expression in the oocyte and early embryo must at some point involve chromatin remodeling. However, the genes implicated in this fundamental process during this period are still elusive. Our MYST4 and H1FOO studies associate these genes with specific events that occur on the chromatin of oocytes and embryos. Moreover, our expression profile analysis indicates that many other genes are implicated during this important developmental period. The results presented in this thesis contribute to enlighten the global representation of chromatin modulation by epigenetic factors.

La production d'embryons in vitro permet d'augmenter rapidement le potentiel génétique des troupeaux laitiers et/ou bovins du Québec. Malheureusement, cette technique n'est pas efficace à 100%. En effet, seulement 30 à 40% des ovocytes immatures atteignent le stade de blastocystes in vitro [1]. Ces rendements sont largement inférieurs à ceux obtenus in vivo. Le développement embryonnaire est une période critique à l'intérieur de laquelle plusieurs étapes doivent être surmontées afin d'assurer la viabilité et la santé de l'embryon. La moindre petite faille peut mener à la mort de l'ovocyte ou de l'embryon. Plusieurs différences morphologiques, biochimiques et métaboliques ont été observées entre les embryons produits in vivo versus ceux produits in vitro. Plusieurs études suggèrent que ces différences sont expliquées par les variations géniques induites par l'origine de l'ovocyte et/ou les milieux de culture in vitro [2-4]. Dans le cadre du présent projet de recherche, nous avons effectué une analyse comparative du profil des ARN messagers (ARNm) lors du développement embryonnaire bovin in vivo versus in vitro afin d'identifier des marqueurs de compétence embryonnaire. Nous avons utilisé le modèle in vivo comme référence puisque les embryons issus de ce milieu proviennent d'un environnement optimum. Dans un premier temps, nous avons comparé l'abondance des ARNm présents dans F embryons produit in vivo versus in vitro à différents stades de développement (2 cellules, 8 cellules et blastocystes). Dans un deuxième temps, nous avons comparé les profils des ARNm présents lors des premiers stades embryonnaires in vivo versus in vitro afin d'identifier les variations géniques induites par ces deux systèmes de production. Nous avons utilisé la technique des biopuces pour réaliser les deux volets de ce projet de recherche. Les informations obtenues dans le cadre de ce projet permettront éventuellement d'améliorer les conditions de culture embryonnaire in vitro afin de produire plus d'embryons viables et en santé. De plus, les recommandations émises suite aux problématiques rencontrées lors de la réalisation du deuxième volet du projet de recherche permettront également d'améliorer la productivité et l'efficacité de différentes techniques de laboratoire.

Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l'expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d'intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives. / This work explores the identity, the function, and the regulation of maternal mRNA molecules that drive developmental competence shortly after fertilization in cattle. First of all, by using the model of the time of first zygotic cleavage and assessing the transcriptome of 2-cell embryos, it was possible to determine the molecular fingerprint of extreme levels of developmental competence and select candidate molecules for further monitoring. Data implied that early embryos of variable developmental capacity differ in functions including DNA repair, RNA processing, protein synthesis, and gene expression that are dictated by oocyte-synthesized mRNA. To obtain a functional confirmation, a pair of maternal transcripts (one detected in our previous survey and other related molecule) were knocked-down in oocytes that were further cultured. The effects of ablating these transcription factors were evident before blastocyst formation due to a decrease in cleavage capacity, as well as progression past the 8-cell stage. The molecular analysis of surviving knocked-down embryos suggested that one of these transcription factors is a pivotal orchestrator of the activation of the embryonic genome, a critical developmental window in early embryogenesis. In the last survey, we asked whether the transcription factors of interest are modulated at the translational level. Reporter mRNAs containing either short or long versions of the 3’-UTR sequences of both molecules were injected in zygotes to look at their translational dynamics. Results showed that cis-acting elements located in the 3’-UTRs govern their timely translation and suggested an association between developmental competence and protein synthesis capacity. This led to the notion that these crucial transcription factors are also controlled at the translational level in early embryos. The acquired knowledge was instrumental to define the possible control operated by maternal molecules on embryos at the onset of their development, as well as some of the challenges and potential use of this information in the field of reproductive technologies.

Chez une multitude de métazoaires étudiés, une période de quiescence transcriptionnelle est observée chez le jeune embryon suite à la fécondation de l'ovocyte. La durée de cette période est spécifique à chaque espèce et chez le bovin, l'embryon n'active son propre génome qu'aux stades 8- à 16-cellules. Précédemment à cette activation de la transcription, l'embryon subsiste grâce à l'utilisation des ARNm et des protéines fournies par l'ovocyte. C'est également à partir de ces réserves que l'embryon doit puiser les différents facteurs impliqués dans l'activation de son génome au moment requis. Les expériences présentées dans cette thèse étaient destinées à améliorer nos connaissances de l'activation du génome embryonnaire chez le bovin. Dans un premier temps, la caractérisation de l'expression de plusieurs facteurs de transcription chez l'embryon a été effectuée et le rôle envisageable de ces facteurs dans l'activation du génome a aussi été démontré. Par la suite, nous avons établi une liste exhaustive de plus de 300 transcrits embryonnaires exprimés très tôt dès l'activation du génome. Cette étude du transcriptome a permis l'identification d'une multitude de gènes associés à la transcription et au maintient de la pluripotence que l'on retrouve chez les cellules embryonnaires. Afin de définir la fonction ou le rôle des différents joueurs identifiés lors de nos études, nous avons mis au point un procédé qui cible spécifiquement un transcrit donné et induit sa dégradation dans les ovocytes bovins sans toutefois induire des effets collatéraux dommageables sur la compétence au développement de ces ovocytes. Cette méthode utilise l'interférence ARN qui réduit à des niveaux très faibles la présence d'un transcrit ciblé, ce qui permet d'étudier les effets de sa perte de fonction. Cette méthode a permis d'établir le rôle crucial dans l'embryon d'un gène issu de nos premières études : MATRIN 3. La dégradation de l'ARN de MATRIN 3, une composante architecturale de la matrice nucléaire qui agit aussi au niveau de la transcription, s'est avérée avoir des effet néfastes sur la survie embryonnaire. Les informations fournies par la combinaison des études présentées dans cette thèse contribuent à dresser un portrait mieux défini de l'activation du génome chez le bovin.