Dans ce travail de recherche doctorale, l'IRM des poumons à temps d'écho courts dite UTE (Ultra-short EchoTime) a été utilisée pour détecter le signal RMN du tissu pulmonaire afin de caractériser et étudier des modèlesexpérimentaux de maladies pulmonaires chez les rongeurs (rats et souris). En particulier, la technique radialeUTE a été appliquée pour détecter des biomarqueurs dans des modèles de broncho-pneumopathie chroniqueobstructive (BPCO) induite expérimentalement chez les rongeurs. La détection du signal RMN en provenancedu parenchyme pulmonaire a fourni de précieux indicateurs de la maladie associés à l'élargissement des alvéolespulmonaires et aux processus inflammatoires. De plus, la simplicité de mise en oeuvre de cette technique(absence de synchronisation cardiaque et pulmonaire) permet de réduire les temps d'acquisition et apparait bienadaptée aux études longitudinales. La mesure répétée du centre de l'espace-k à chaque temps de répétition de laséquence a été utilisée pour développer une méthode de post-synchronisation reposant sur la détection desmouvements cardio-respiratoires, et permettant de produire des images sans artefacts de mouvement.

Le monoxyde d'azote (NO) est une molécule produite par l'ensemble des cellules des voies aériennes. Sa synthèse à partir de la L-arginine fait appel à un groupe d'enzymes : les NO synthases (NOS). Il existe trois isoformes de NOS exprimées par des cellules ayant des fonctions diverses conférant ainsi au NO produit une spécificité d'action dépendante de la cellule et de la " situation " ayant entraîné sa synthèse. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse explorent des rôles différents (bronchoréactivité, immunitaires) du NO produit par les voies aériennes ainsi que la mesure du NO dans le contexte de l'anesthésie - réanimation. L'objectif du premier travail était de " revisiter " la fonction régulatrice du tonus bronchique dans le cadre d'une pathologie respiratoire, l'objectif du second travail était méthodologique (étude des sources anatomiques du NO expiré chez le patient sous ventilation mécanique), et l'objectif du troisième travail était d'utiliser la mesure validée dans le second travail pour évaluer les fonctions immunes du NO en réanimation.Premier travail. La compétition entre les NO synthases et les arginases pour leur substrat commun, la L-arginine, pourrait être impliquée dans régulation de la réactivité et du remodelage bronchique chez le patient atteint de BPCO. Le but du premier travail était d'évaluer la relation entre expression de cette balance enzymatique, et les effets pharmacologiques de l'inhibition des NOS et des arginases sur la réactivité bronchique ex vivo à l'acétylcholine de patients sans et avec une BPCO peu sévère. Pour cela, nous avons étudié les bronches de 22 patients. Des études immunohistochimiques nous ont permis de mettre en évidence une expression bronchique NOS-2 plus importante chez les patients BPCO comparée aux patients non BPCO. De plus, les études pharmacologiques réalisées en cuve à organe ont permis de mettre en évidence une tension bronchique de base plus importante chez les BPCO, corrélée à l'expression de la NOS-2 et au degré d'obstruction bronchique (VEMS). L'utilisation d'inhibiteur des NOS diminuait cette tension de base. Nous avons démontré ainsi qu'une augmentation de l'expression NOS-2 chez le BPCO était impliquée dans l'augmentation du tonus bronchique de base et dans l'obstruction bronchique.Second travail. Les variations de NO expiré après chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle (CEC) demeurent controversées. Le but de ce deuxième travail était de déterminer quelle source de NO expiré (bronchique ou alvéolaire) était modifiée après CEC, et d'étudier les effets de la ventilation mécanique pendant la CEC sur ces variations. Nous avons étudié ainsi 32 patients ventilés ou non durant une chirurgie cardiaque avec CEC. Nous avons observé une diminution significative du NO expiré d'origine bronchique après la CEC. Cette diminution n'était pas observée lors du maintien durant la CEC d'une ventilation avec pression expiratoire positive (PEEP). Ce travaille permettait de conclure que la diminution du NO bronchique après la CEC pouvait être liée à une occlusion des petites voies aériennes. Cette atteinte de petites voies aériennes était prévenue par la PEEP.Troisième travail. Enfin, dans ce troisième travail, nous avons émis l'hypothèse que la mesure du NO produit par les voies aériennes (NO expiré et nasal) pouvait constituer un marqueur prédictif de survenue d'infection nosocomiale (fonctions immunitaires du NO). Dans une étude observationnelle chez 45 patients de réanimation ventilés (15 patients ont développé une infection nosocomiale), le NO nasal était le seul marqueur significativement plus bas chez les patients développant une infection nosocomiale (le NO expiré, les dosages d'IL6 et d'IL10 ainsi que le score SOFA n'étaient pas différents entre les deux groupes). Un NO nasal inférieur à 148 ppb 72 heures après l'admission du patient, permettait de prédire la survenue d'une infection nosocomiale avec une sensibilité et une spécificité de 80% et de 70% respectivement et un odds ratio de 2.7. Le développement de ce bio marqueur simple à mesurer permettrait de mettre en place des stratégies préventives (immunonutrition avec de la L-arginine).

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie caractérisée par une réaction inflammatoire intense avec une destruction du parenchyme pulmonaire et une perte d'élasticité du poumon conduisant à une obstruction quasi-irréversible des voies aériennes. L'utilisation du tabac est le principal facteur de risque de cette maladie. La fumée de cigarette active les cellules épithéliales et les macrophages résidents en libérant des protéases et des chimiokines. Ces phénomènes sont responsables de l'infiltration de cellules inflammatoires dans le poumon, telles que les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes. Ces cellules libèrent des enzymes protéolytiques capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces protéases, l'élastase du neutrophile (NE) semble stimuler la sécrétion de cytokines, participant ainsi à une inflammation chronique. De fortes évidences montrent que des infections bactériennes récurrentes contribuent à ce processus inflammatoire et par conséquent à l'aggravation de la BPCO. A partir de ces observations, nous nous sommes intéressés aux événements précoces du développement de la BPCO associés à une infection bactérienne récurrente. Dans un premier temps, nous avons montré que l'association d'un extrait de fumée de cigarette à de faibles doses de LPS est capable d'augmenter de façon synergique la libération des chimiokines par les cellules épithéliales alvéolaires. Ce phénomène implique l'activation des voies de signalisation MAP kinase ERK1/2 et JAK/STAT. Nous avons mis en évidence que l'inhibiteur de la phosphodiestérase 4, le roflumilast N-oxide, empêche la sécrétion de ces cytokines inactivant ainsi les voies JAK/STAT et ERK1/2. Dans un deuxième temps, nous avons démontré que la NE peut conduire à la libération de chimiokines par des cellules épithéliales alvéolaires en activant la voie de signalisation p38 et que le roflumilast N-oxide diminue le taux de ces chimiokines. Une approche in vitro sur un modèle de cellules épithéliales alvéolaires a permis de démontrer l'effet synergique du CSE associé au LPS sur la libération de cytokines et sur l'activation des voies de signalisation. Cet effet pourrait être responsable de la progression et de l'exacerbation de la BPCO. Notre étude montre aussi les effets du roflumilast sur la libération de cytokines induites par la NE ou par le CSE/LPS. Ces résultats mettent en lumière d'autres mécanismes par lesquels le roflumilast N-oxide exerce son effet anti-inflammatoire dans la BPCO.

Le maintien ou le renforcement de la masse et de la fonction musculaire, altérées chez les patients BPCO, est un objectif primordial pour préserver, voire améliorer leur tolérance à l'effort, leur qualité de vie et leur survie. Afin d'optimiser la prise en charge de cette dysfonction musculaire, la réhabilitation est complétée par des interventions nutritionnelles, encore appelées réhabilitations nutritionnelles. Dans ce contexte, l'apport d'acides gras polyinsaturés de la série n-3, et plus particulièrement d'acide docosahexaénoïque (DHA), pourrait s'avérer intéressant en raison de leurs effets bénéfiques démontrés dans plusieurs pathologies chroniques. L'objectif de ce travail était donc de caractériser les effets d'une supplémentation en DHA sur la tolérance à l'effort et sur le métabolisme énergétique des muscles squelettiques de rats adultes exposés à une hypoxie comme modèle de muscle de patient BPCO au stade de l'insuffisance respiratoire chronique. La tolérance à l'effort est améliorée par le DHA, que les rats soient conditionnés en normoxie ou en hypoxie. En normoxie, les mécanismes impliqués seraient liés à un effet du DHA mimétique de celui d'un exercice d'endurance, avec une activation de l'AMPK et une amélioration de la fonction mitochondriale étudiée sur fibres musculaires perméabilisées. En hypoxie, le DHA agirait différemment, réduisant les effets de l'hypoxie sur le muscle, sans que les mécanismes mimétiques de l'exercice d'endurance ne soient clairement retrouvés. La prise de DHA chez des rats entrainés et conditionnés en hypoxie permet également un gain d'endurance mais les mécanismes à l'origine de cet effet ne sont pas élucidés et nécessitent des travaux complémentaires. Au vu des résultats sur le muscle, la supplémentation en DHA pourrait donc être bénéfique dans la prise en charge de la dysfonction musculaire dans les maladies chroniques telles que la BPCO. / The maintenance and reinforcement of skeletal muscle mass and function, impaired in COPD patients, is a crucial aim to preserve, and even improve, their exercise tolerance, quality of life and survival. In order to optimize the management of such a muscular dysfunction, rehabilitation could be completed by nutritional interventions, also called nutritional rehabilitation. In this context, the intake of polyunsaturated fatty acids of the n-3 class, and particularly of docosahexaenoic acid (DHA), could be interesting, due to their benefic effects demonstrated in many chronic pathologies. Therefore, the aim of our work was to characterize the effects of DHA supplementation on exercise tolerance and skeletal muscle metabolism in rats exposed to hypoxia as a model of muscle dysfunction as seen in COPD patients suffering chronic respiratory failure. Results showed that exercise tolerance was improved by DHA in both normoxia and hypoxia conditions. In normoxia, the involved mechanisms may rely on an endurance exercise mimetic effect of DHA, including AMPK activation and improved mitochondrial function studied on permeabilized muscular fibers. In hypoxia, DHA acts differently, probably by minimizing hypoxia effects on muscle. However, the endurance exercise mimetic mechanisms were not clearly found. In hypoxia exposed-endurance trained-rats, DHA improved endurance exercise capacity but the involved mechanisms were not fully characterized and need further work. In conclusion, our results on muscle suggest that DHA supplementation could be beneficial in management of muscular dysfunction induced by chronic diseases such as COPD.

Dans ce travail de recherche doctorale, l’IRM des poumons à temps d'écho courts dite UTE (Ultra-short EchoTime) a été utilisée pour détecter le signal RMN du tissu pulmonaire afin de caractériser et étudier des modèlesexpérimentaux de maladies pulmonaires chez les rongeurs (rats et souris). En particulier, la technique radialeUTE a été appliquée pour détecter des biomarqueurs dans des modèles de broncho-pneumopathie chroniqueobstructive (BPCO) induite expérimentalement chez les rongeurs. La détection du signal RMN en provenancedu parenchyme pulmonaire a fourni de précieux indicateurs de la maladie associés à l'élargissement des alvéolespulmonaires et aux processus inflammatoires. De plus, la simplicité de mise en oeuvre de cette technique(absence de synchronisation cardiaque et pulmonaire) permet de réduire les temps d’acquisition et apparait bienadaptée aux études longitudinales. La mesure répétée du centre de l’espace-k à chaque temps de répétition de laséquence a été utilisée pour développer une méthode de post-synchronisation reposant sur la détection desmouvements cardio-respiratoires, et permettant de produire des images sans artefacts de mouvement. / In this work, ultra-short echo time (UTE) MR imaging of the lungs is presented as a way of detecting pulmonaryMRI signal, thus providing an opportunity to develop new imaging tools for the investigation of experimentalmodels of lung diseases in rodents. The UTE imaging technique (TE=450 μs) was implemented on a 4.7 Tscanner and applied to detect indicators of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) inducedexperimentally in rodents. The improved signal detection from the lung parenchyma provided valuable markersof disease associated with airspace enlargement and inflammation. When used to investigate of inflammationspecificity, this technique had advantages when delineating regions of early cellular infiltration into the site ofinflammation. In the case of edematous signal quantification, the UTE technique was explored to improve thereliability of the volumetric measurements. This technique was demonstrated to be of use when easy protocolimplementation (relatively high throughput and low-cost experiments) and longitudinal studies (limitedinterference with physiopathology) are of concern. The repetitive probing of the k-space center with a temporalresolution of the sequence's repetition time achieved with this technique was used to develop a self-gatingmethod which relies on the tracking of cardio-respiratory motions, yielding images free from motion artifacts.

Les maladies pulmonaires, responsables de 3,1 millions de décès de part le monde représentent un problème majeur de santé publique. En particulier, la fibrose pulmonaire et la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) conduisent à la perte de la fonction pulmonaire. Aucun traitement efficace n’a été identifié à ce jour pour lutter contre ces maladies, la seule alternative étant la transplantation. Au cours de ma thèse, j’ai exploré les mécanismes du développement de ces maladies en utilisant différents modèles chez la souris, soit par l’instillation de nanoparticules de métaux ou de bléomycine, conduisant à l’inflammation et/ou à la fibrose pulmonaire, soit par exposition à la fumée de cigarette provoquant une inflammation. Nous avons montré le rôle de la voie de signalisation IL-33/ST2 dans les réponses inflammatoires induites par les nanoparticules ou la bléomycine et identifié de nouveaux mécanismes de régulation de l’IL-33 au sein des macrophages, différents de ceux décrits pour les cellules épithéliales. Nos résultats indiquent que l’expression intracellulaire de l’IL-33 et de son récepteur ST2, joue un rôle important dans l’inflammation, ainsi que la translocation nucléaire de l’IL-33. D’autre part, mes travaux de thèse ont permis d’identifier le rôle clef du senseur intracytosolique NLRP6 dans l’inflammation provoquée par l’exposition à la fumée de cigarette. Nos résultats indiquent que NLRP6, aux fonctions pulmonaires inexplorées, contrôle l’activation des cellules épithéliales et le recrutement des neutrophiles de façon indépendante de la formation d’un inflammasome mais dépendante de la signalisation par les récepteurs des interférons de type I et III. / Pulmonary diseases are a major health problem with 3.1 million deaths in the worldwide. Among them pulmonary fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), which occur after repeated lung epithelium injury, are characterized by impaired lung functions. To date, no effective therapy against pulmonary fibrosis and COPD were developed, lung transplantation being the only alternative. During my thesis, I studied the mechanisms leading to disease development using different experimental models in mice in particular by metal dioxide nanoparticles or bleomycin instillation leading to inflammation and/or pulmonary fibrosis, or by cigarette smoke exposure promoting pulmonary inflammation which may lead to emphysema. We show the crucial role of IL-33/ST2 signaling pathway in response to nanoparticles or bleomycine and identify new mechanisms for IL-33 regulation in macrophages which are different from those described in epithelial cells. Our results indicate that intracellular expression of IL-33 and of its receptor ST2, together with nuclear IL-33 translocation, play an important role in inflammatory response to nanoparticles instillation. On the other hand, my thesis work allowed identifying that the cytosolic sensor NLRP6 as a key player in pulmonary inflammation developed upon mouse cigarette smoke exposure. Interestingly, our results show that the receptor NLRP6, whose pulmonary functions are still unexplored, controls epithelial cells activation leading to neutrophils recruitment in the airways, in an inflammasome-independent manner but dependently of type I and III interferon receptors signaling.

Dans le cadre d’un programme de réhabilitation respiratoire (PRR) chez les patients atteints de BPCO, les sociétés savantes recommandent d’inclure un entrainement des muscles inspiratoires (EMI) chez les patients présentant une diminution objective de la force des muscles inspiratoires. Cette recommandation fait suite à une méta-analyse qui suggère qu’un EMI serait bénéfique lorsque la pression inspiratoire (PI) maximale est inferieure a 60 cm H2O.L’entraînement des muscles améliore la force et l’endurance des muscles inspiratoires, la capacité d’exercice et la dyspnée. Dans la dernière méta-analyse, les auteurs précisent que, dans le cadre d’un PRR, il n’est pas certain que l’EMI améliore davantage la dyspnée par rapport à un PRR seul.La question de départ est la suivante : est-ce que l’EMI au cours d’un PRR permet de diminuer davantage la dyspnée qu’un PRR seul ?Dans la première étude contrôlée randomisée, nous montrons que dans le cadre d’un PRR, l’EMI n’améliore pas davantage la dyspnée, chez des patients avec une force des muscles inspiratoires normale. Cependant, une analyse en sous-groupe tend à montrer que chez les patients plus sévèrement atteints (VEMS<50% théorique), l’EMI permettrait une amélioration plus importante de la dyspnée.La deuxième étude est le plus important essai contrôle randomise à propos de l’effet de l’EMI sur la dyspnée dans le cadre d’un PRR. Dans cette étude trois outils différents sont utilisés afin d’évaluer la dyspnée des patients, dont le questionnaire multidimensionnel MDP. Nous montrons que l’EMI ajoute a un PRR n’apporte pas une amélioration significativement plus importante de la dyspnée en comparaison a un PRR seul. Ainsi l’intérêt clinique de l’EMI dans le cadre d’un PRR semble remis en cause. / During a pulmonary rehabilitation program (PRP) in COPD patients, French and international respiratory societies recommend to include inspiratory muscles training (IMT) in patients with an objective inspiratory muscles weakness. This recommendation follows upon a meta-analysis which suggests that IMT would be beneficial when the maximal Inspiratory pressure (PImax) is lower than 60 cm H2O. IMT improves the strength and the endurance of the inspiratory muscles, the exercise capacity and the dyspnea. In the last meta-analysis, the authors specifies that, when IMT is associated to a PRP, it is not certain that IMT improves more the dyspnea compared with a PRP alone.The initial question of this work is: does IMT during a PRP allow decreasing more the dyspnea than a PRP alone?In the first randomized controlled trial, we show that during a PRP, IMT in COPD patients with normal inspiratory muscles strength does not improve more the dyspnea, compared to a PRP alone. However, an analysis in sub-groups tends to show that in severe or very severe COPD patients (VEMS < 50 % of predictive value), IMT would allow a higher improvement of the dyspnea.The second study is the most important randomized controlled trial about the effect of IMT on the dyspnea during pulmonary rehabilitation. In this study we used three different tools to estimate the dyspnea of the patients, of which the multidimensional Dyspnea Profile questionnaire (MDP). We show that IMT added to a PRP does not improve significantly more dyspnea compared to a PRP alone. So the clinical interest of IMT during a PRP seems questionnable.

Les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire (PA-PSM) peuvent contribuer à la pathogenèse de l'hypertension pulmonaire (PH) en produisant des facteurs sécrétés.Objectif: explorer le rôle de PH de protéines de la matrice extracellulaire libéré par Les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire sénescentes (PA-PSM)Méthodes et résultats:L'analyse Microarray de l'ADN de PA-CML humaine subir à la sénescence réplicative révélé une régulation positive de l'ostéopontine, qui médie l'effet stimulateur ,du médium et de la matrice de l'AP-SMC de sénescentes, sur la croissance et de la migration des cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire. Osteopontin était régulé à la hausse dans les poumons de patients atteints de BPCO et de patients hypertension artérielle pulmonaire idiopathique (HAPi). Prominent ostéopontine immunocoloration a été noté dans le PA-SMC qui a également colorée pour p16 dans les sites de l'hypertrophie vasculaireet les niveaux de l'ostéopontine pulmonaire étalaient étroitement corrélée avec l'âge. Comparativement aux jeunes souris avec des souris ont 1 an affiche des niveaux plus élevés d'ostéopontine du poumon, et la pression systolique ventriculaire droite (de RVSP), et la muscularisation vasculaires pulmonaires, et le nombre de PA-CML colorée pour p16 ou p21 et aussi pour l'ostéopontine.Aucun de ces changements avec l'âge étaient observée dans les souris ostéopontine - / -, qui a développé atténués PH pendant l'hypoxie.Comparé de culture PA-CML, les PA-CML de souris ont 1 ans qui proliféraient plus rapide que PA-CML de jeunes souris. Avec un taux de croissance rapide a été observée avec PA-CML de jeunes souris stimulées par matrice ou médium issu de les PA-CML de souris âgées. Différences entre les anciens jeune souris / PA-SMC taux de croissance étaient supprimée par des anticorps anti-ostéopontine.culture de la PA-CML de souris ostéopontine - / - a augmenté de plus lente que fait chez PA-SMC de souris sauvage et ces cellules ont été stimulés par le medium et la matrice de PA-CML de type sauvage et cet effet était plus fort avec PA-CML de souris âgés par apport de souris jeunes.Conclusion: Osteopontin est un médiateur clé libéré par PA-SMC sénescente et contribuer à la progression de la HTAP. / Rationale: Senescent pulmonary artery smooth muscle cells (PA-SMCs) may contribute tothe pathogenesis of pulmonary hypertension (PH) by producing secreted factors.Objective: To explore the role in PH of extracellular matrix proteins released by senescentPA-SMCsMethods and results: Microarray analysis of human PA-SMCs undergoing replicativesenescence revealed osteopontin upregulation, which mediated the stimulatory effect ofsenescent PA-SMC media and matrix on PA-SMC growth and migration. Osteopontin wasupregulated in lungs from patients with COPD or idiopathic pulmonary arterial hypertension(PAH). Prominent osteopontin immunostaining was noted in PA-SMCs that also stained forp16 at sites of vascular hypertrophy, and lung osteopontin levels correlated closely with age.Compared to younger mice, 1-year-old mice displayed higher lung osteopontin levels, rightventricular systolic pressure (RVSP), pulmonary vessel muscularization, and numbers ofPA-SMCs stained for p16 or p21 and also for osteopontin. No such changes with age wereobserved in osteopontin-/- mice, which developed attenuated PH during hypoxia. Comparedto cultured PA-SMCs from young mice, PA-SMCs from 1-year-old mice grew faster; asimilar fast growth rate was seen with PA-SMCs from young mice stimulated by matrix ormedia from old mice. Differences between old/young mouse PA-SMC growth rates weresuppressed by anti-osteopontin antibodies. PA-SMCs from osteopontin-/- mice grew moreslowly than did wild-type PA-SMCs; they were stimulated by wild-type PA-SMCs mediaand matrix, and this effect was stronger with PA-SMCs from older vs. younger mice.Conclusion: Osteopontin is a key mediator released by senescent PA-SMCs andcontributing to PH progression.

La protéine CCSP (« Club Cell Secretory Protein »), produite par les cellules Club au niveau de l’épithélium respiratoire, se retrouve déficiente chez les patients atteints de Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO). Le but de ce travail était de comprendre la régulation et les différents rôles de la protéine CCSP afin d’en évaluer son potentiel intérêt thérapeutique. Nous avons dans un premier temps observé les effets du polymorphisme connu de CCSP au niveau de sa région promotrice, la mutation G38A, sur la transcription même du gène. Nous avons constaté in vivo dans une étude clinique prospective sur 1 an comprenant 66 patients souffrant de BPCO, et confirmé in vitro dans un modèle de cellules BEAS-2B transfectées, que la fumée de cigarette était un répresseur de la transcription de CCSP et que ce phénomène était amplifié par la présence de la mutation G38A. De plus, in vitro, certains facteurs de transcription tels que p53 et Nkx2.1, ainsi que les lipopolysaccharides, affectaient l'efficacité du promoteur de CCSP.Ensuite, nous avons caractérisé les cellules qui sécrètent cette protéine dans un modèle ex vivo de culture en interface air-liquide de cellules primaires épithéliales bronchiques. Nous avons observé par microscopie électronique à balayage des cellules en dôme, forme caractéristique des cellules Club, et par microscopie électronique à transmission des cellules contenant des granules de sécrétion contenant la protéine CCSP. Nous avons constaté par immunofluorescence que les cellules marquées CCSP+ étaient également MUC5AC+ (marqueur de cellules à mucus), P63+ (marqueur de cellules basales) ou encore KI-67+ (marqueur de prolifération). Nous suggérons donc que les cellules Club sont des cellules progénitrices, permettant ainsi la régénération de l’épithélium bronchique. Par ailleurs, nous avons évalué l’implication de la protéine CCSP dans le recrutement des neutrophiles, cellules inflammatoires prépondérantes dans la BPCO. Une étude pharmacologique a d’abord permis d’évaluer les effets de CCSP sur des neutrophiles de sujets témoins. Le déplacement des neutrophiles, stimulé par l’IL8 ou le fMLP (tous deux puissants agents chemoattractants), était inhibé par CCSP. Puis, par une étude in vitro, nous avons déterminé la modulation du sécrétome de l’épithélium bronchique par CCSP. Lorsque les sécrétions d’épithélia reconstitués ex vivo à partir de biopsies de fumeur et de BPCO étaient mis en présence de neutrophiles, un chimiotactisme exagéré des neutrophiles étaient constaté. Lorsque les épithélia étaient traités avec la protéine CCSP, à l’état de base ou stimulés par de la fumée de cigarette, ce chimiotactisme exagéré était alors diminué.Enfin, dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à la régulation de la protéine, dans un modèle de culture cellulaire NCI-H292, lignée de cellules bronchiques cultivées en monocouche. Nous avons supplémenté ces cellules en CCSP exogène afin d’analyser les variations du profil protéomique des secrétions engendrées (méthode LC-MS/MS). De façon générale, il s’avérait que la supplémentation en CCSP permettrait une restauration de la « machinerie » du protéasome avec une augmentation des protéines de la famille des tubulines.Ce travail de thèse a démontré que la protéine CCSP était un acteur potentiel de la physiopathologie de la BPCO. L’étude de sa régulation a montré que la synthèse de CCSP était effectivement diminuée dans la BPCO. Ainsi, une supplémentation en CCSP pourrait être une piste thérapeutique. / A defective in Club Cell Secretory Protein (CCSP) produced by nonciliated Club cells was observed in COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) airways. Our aim was to understand CCSP biological mechanisms of action and its dysregulation in COPD and whether it might be a therapeutic axis in COPD.First, the influence of the CCSP G38A polymorphism on CCSP transcription levels and its regulatory mechanisms were analyzed. Our in vivo study conducted in a 1 year prospective cohort consisting of 66 COPD patients confirmed that circulating CCSP levels were associated with smoking. Moreover, the CCSP G38A polymorphism and the smoking status significantly repressed CCSP serum levels. Our in vitro study conducted in BEAS-2B transfected cells supported those findings as CSE repressed the CCSP transcription of the A carrying transfected cells more intensely than the wild type cells. Noteworthy, LPS, Nkx2.1 and p53 transcription factors also modulated the CCSP promoter efficiency in vitro. Furthermore, CCSP producing cells were characterized in an air-liquid interface (ALI) culture model of bronchial epithelial cells. Transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and confocal microscopy confirmed the pseudostratified organization of the reconstituted epithelium. Evidences of full differentiation were identified and labeled with MUC5AC (goblet cells), tubulinIV (ciliated cells), P63 (basal cells) and CCSP (club cells). Moreover, the ex vivo reconstituted COPD epithelium released higher levels of IL8 and MUC5AC. Ki-67 and collocating antibodies with CCSP argued for an accessory stem cell and a transitory differentiating roles for CCSP+ cells.Then, we aimed to investigate whether exaggerated airway neutrophilia was driven by the CCSP-defective COPD airway epithelium. CCSP action on healthy neutrophil chemotaxis was evaluated in a pharmacological study demonstrating that CCSP directly inhibited neutrophil chemotaxis induced by fMLP and IL8. Then, in an in vitro study, ALI-reconstituted COPD airway epithelium in a clean environment promoted an exaggerated neutrophilic chemotaxis compared to smokers and controls at steady state. Treating the airway epithelium with exogenous CCSP prevented baseline and CSE-induced neutrophil chemotaxis.Finally, CCSP regulation was studied in NCI-H292 cells, a human pulmonary cell line. The cells were supplemented with CCSP. Proteomic profile (LC-MS/MS method) of the bronchial epithelium in response to CCSP treatment demonstrated that the proteasome machinery and the tubulin family members were upregulated.This work supported the potential implication of CCSP in the pathophysiology of COPD. CCSP was confirmatively defective in COPD patients, therefore, restoring physiological concentrations of CCSP by exogenous supplementation may be a therapeutic perspective.

Le recrutement des neutrophiles qui caractérise l’inflammation observée lors de différentes pathologies pulmonaires conduit à la libération dans le milieu extracellulaire de protéases à sérine qui sont en partie responsables de la dégradation du tissu pulmonaire et/ou de la chronicité de l’inflammation. L’objectif initial de cette thèse était de développer une méthode de quantification de ces protéases, à partir des condensats d’air exhalé. En dépit de la sensibilité de la technique nous n’avons pas été en mesure de détecter des quantités significatives de protéases actives dans ces condensats. Ces résultats négatifs ont néanmoins permis de confirmer des hypothèses sur la distribution des protéases dans le milieu extracellulaire. La deuxième partie des travaux a été consacrée à la validation du modèle souris exposée à la fumée de cigarette comme modèle animal de bronchopneumopathie chronique obstructive. Nous avons purifié les trois protéases à sérine du neutrophile murin et avons construit des nouveaux substrats sensibles et spécifiques à partir des informations fournies par des études de modélisation moléculaire. Ces nouveaux outils permettent de valider l’utilisation du modèle souris pour comprendre le rôle des protéases à sérine dans la génération de peptides chimiotactiques au cours de la BPCO. / Neutrophils recruitment is a hallmark of the inflammation associated with different lung diseases. This recruitment leads to the release in the extracellular matrix of serine proteases that are responsible at least in part, of the degradation of the pulmonary tissue and/or of the chronicity of inflammation. The initial objective of this thesis was to develop a method of quantification of these proteases, based on the analysis of exhaled air condensate. But in spite of the sensitivity of the methods, we have not been able to detect any significant activity of neutrophil serine proteases in these condensates. This negative result however gave support a hypothesis we formulated on the extracellular biodistribution of proteases in lung secretions. The second part of this thesis was devoted to the validation of an animal model of chronic obstructive pulmonary disease, i.e. the mouse exposed to cigarette smoke. We have purified three murine serine neutrophil proteases and developed new sensitive and specific FRET substrates which were designed starting from molecular modeling studies. These new tools that validate the use of the mouse model of human COPD, will be of great help to understand the role of serine proteases for generating chemotactic peptides during this chronic disease.