Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-14Bitstream added on 2014-06-13T18:44:27Z : No. of bitstreams: 1 pereira_rm_dr_jabo.pdf: 415712 bytes, checksum: 3a2847df5213880b53630ad700a376be (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diversos estudos com bactérias fixadoras de nitrogênio buscam identificar genes responsáveis pela fixação de nitrogênio, nodulação e simbiose, assim como conhecer seu genoma e compreender melhor o metabolismo delas. No entanto ainda há poucos trabalhos sobre o genoma de Bradyrhizobium elkanii, bactéria importante no contexto da produção de alimentos e de utilização comercial. Esse é o primeiro estudo a comparar 2654 genes de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, com as bactérias Bradyrhizobium japonicum LGM 6138, Azorhizobium caulinodans LGM 6465, Mesorhizobium huakuii LGM 14107, Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii LGM 8820 e Sinorhizobium meliloti LGM 6133 através da comparação de genomas por hibridização (CGH) usando Microarray. Portanto o objetivo deste trabalho foi realizar uma taxonomia molecular através da comparação de genomas por hibridização DNA-DNA, utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA (CGH Microarray), para buscar novos genes que possam ser úteis na classificação filogenética de rizóbios. A técnica de CGH Microarray permitiu encontrar sessenta e cinco genes comuns entre todas as bactérias analisadas, após realizar comparação e classificação de todos genes encontrados em comum entre elas. Os resultados obtidos ao se comparar três árvores filogenéticas baseadas em diferentes genes, confirmaram que alterar a quantidade e as sequências nas análises, causa variação nas árvores filogenéticas como já observado em outros microrganismos... / Diverse studies with fixing nitrogen bacteria search to identify responsible genes for the nitrogen fix, nodulation and symbiosis, as well as knowing its genome and understanding the metabolism of them better. However still has few works about genome of Bradyrhizobium elkanii, important bacterium in the context of the production of foods and commercial use. This is the first study to compare 2654 genes of Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, with the bacteria Bradyrhizobium japonicum LGM 6138, Azorhizobium caulinodans LGM 6465, Mesorhizobium huakuii LGM 14107, Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii LGM 8820 and Sinorhizobium meliloti LGM 6133 through the CGH Microarray. Therefore aim of this work was to carry a molecular taxonomy through the comparison of genomes for hybridization DNA-DNA, being used the technology of microarrangements of DNA (CGH Microarray), to search new genes that can be useful in the phylogenetic classification of rhizobia. The technique of CGH Microarray allowed to find sixty and five orthologs genes between all the analyzed bacteria, after to carry through comparison and classification of all genes in common between them. The results gotten to if comparing three established phylogenetic trees in different genes, had confirmed that to modify the amount and the sequences in the analyses, cause variation in the phylogenetic trees as already observed in other microorganisms. The results suggest that how much bigger will be the number of used ortholog genes in the phylogeny, more trustworthy will be the gotten phylogenetic trees ...(Complete abstract, click electronic access below)

Rizóbios são bactérias aeróbias, Gram-negativas, que fixam nitrogênio atmosférico quando associadas a leguminosas. O gênero Bradyrhizobium é de grande importância na agricultura, pois essas bactérias fixam nitrogênio em simbiose com soja [Glycine max (L.) Merrill]. A caracterização dos rizóbios é fundamental para estudos relacionados à diversidade e à distribuição ecológica desses microrganismos. Três estudos foram conduzidos nesse trabalho: i) uma estratégia baseada em amplificação por PCR para diferenciar Bradyrhizobium japonicum de B. elkanii, utilizando-se seqüências 16S rDNA; ii) a caracterização da variabilidade genética de uma população de bradirrizóbios isolada de um campo experimental, trinta anos após a inoculação de estirpes padrão; iii) a avaliação da variabilidade genética de bradirrizóbios isolados de cinco regiões produtoras de soja no Estado do Rio Grande do Sul (RS) e dos possíveis fatores ambientais que poderiam ser os responsáveis por tal diversidade. Técnicas de biologia molecular foram utilizadas na identificação, ocorrência, distribuição e estudo populacional dos rizóbios, especialmente a amplificação do gene 16S rRNA por PCR, rep-PCR e AFLP.Essas duas últimas técnicas quando combinadas permitiram uma análise mais precisa da variabilidade genética das populações estudadas. O índice de diversidade de Shannon foi utilizado para comparar o grau de diversidade observado nas diferentes populações. Também foi observada uma correlação direta entre o grau de diversidade e o pH do solo. Os resultados obtidos permitiram concluir que as populações de bradirrizóbios que nodulam as lavouras de soja do RS são altamente variáveis, podem persistir nos solos, mesmo na ausência da planta hospedeira, e sofrem influência de fatores bióticos e abióticos. / Rhizobia are Gram-negative aerobic bacteria that fix atmospheric nitrogen in symbiosis with leguminous plants. Bacteria belonging to the Bradyrhizobium genus are very important because they are able to nodulate and fix nitrogen in symbiosis with soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Characterization of rhizobia is fundamental in studies concerning the diversity and ecological distribution of these microorganisms. Three studies have been conducted in this work: i) a strategy based on amplification by PCR to differentiate Bradyrhizobium japonicum and B. elkanii using 16S rDNA sequences; ii) the genetic variability assessment of a bradyrhizobial population isolated from an experimental field thirty years after the inoculation with reference strains; iii) the genetic variability characterization of bradyrhizobia isolated from five soybean fields in different regions in Rio Grande do Sul (RS) State and the environmental factors that can influence such diversity. Molecular biology techniques were used for the identification, occurrence, distribution, and studies of rhizobia population, specially the 16S rRNA gene amplification by PCR, rep-PCR and AFLP. When combined, these last two techniques provided an accurate analysis of the genetic diversity of the analyzed populations. Shannon diversity index was used to compare the diversity among different populations.A direct correlation was observed between diversity degree and soil pH. The results obtained have shown that bradyrhizobia nodulating soybean in RS are highly variable and were able to persist in soil even when the host legume was lacking. Besides they have shown to be influenced by abiotic and biotic parameters.

Embora o ferro seja um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre, somente uma pequena fração está disponível para ser utilizada pelos organismos vivos. A solubilidade do ferro em solos com pH neutro é muito baixa, aproximadamente 10-18 M. Em condições de baixa disponibilidade de ferro, diversos microrganismos podem produzir e excretar sideróforos, quelantes orgânicos de baixo peso molecular envolvidos na solubilização e seqüestro de Fe3+. A captação de ferro é fator limitante para a fixação biológica do nitrogênio, uma vez que esse elemento está diretamente envolvido em moléculas como a nitrogenase, leg-hemoglobina, ferredoxina e citocromos. Enquanto microrganismos de vida-livre, os rizóbios devem ser capazes de solubilizar ferro e competir por ele no solo. As bactérias pertencentes ao gênero Bradyrhizobium são de grande relevância agronômica devido à capacidade de fixar nitrogênio em simbiose com diversas leguminosas, especialmente a soja [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii são duas espécies capazes de nodular soja e quatro estirpes são comumente utilizadas como inoculantes no Brasil: B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019 e B. japonicum SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Os genes fegA e fhuA, relacionados à síntese de proteínas de membrana transportadoras do complexo Fe3+ - sideróforo já foram identificados em B. japonicum 61A152 e Rhizobium leguminosarum, respectivamente. Ao contrário de B. japonicum, nada se conhece sobre esses genes na espécie B. elkanii. No presente trabalho foram analisadas a habilidade em produzir sideróforos e a presença de genes relacionados à síntese de proteínas receptoras do complexo Fe3+ - sideróforo entre diferentes estirpes de Bradyrhizobium. Uma porção do gene fhuA de B. elkanii foi isolada e apresentou um elevado grau de conservação com outros genes relacionados à captação de sideróforos em diferentes bactérias. Experimentos de Southern-blot demonstraram que existe apenas uma cópia do gene fhuA, e nenhuma do gene fegA, no genoma da estirpe SEMIA 587 de B. elkanii. Através do tradicional método CAS, a capacidade de produzir e captar sideróforos in vitro foi confirmada entre as estirpes de B. elkanii utilizadas como inoculantes comerciais no Brasil. As linhagens de B. japonicum, entretanto, mesmo possuindo receptores de membrana específicos para sideróforos, não são capazes de se multiplicar em meio de cultura deficiente em ferro. Tais resultados indicam a possibilidade de diferenças significativas quanto ao sistema de captação de ferro entre tais estirpes. Estudos que confirmem a função do gene fhuA estão sendo conduzidos para verificação da viabilidade fenotípica de B. elkanii mutante para esse gene. / Although iron is one of the most abundant elements in Earth, only one small fraction is available to be used by living organisms. The solubility of iron in soils with neutral pH is very low, approximately 10-18 M. During iron deficiency, many microorganisms can produce and excrete low molecular weight organic chelators termed siderophores involved in the solubilization and sequestration of Fe3+. The iron uptake is a limiting factor for the biological nitrogen fixation as iron is directly involved in many molecules that are essential to this process, like nitrogenase, leg-hemoglobin, ferredoxin and cytochrome. While free-living microorganism, rhizobia should be able to solubilize iron and compete for it in soil. Bacteria belonging to the genus Bradyrhizobium are of enormous agricultural value since they are able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with several leguminous plants, especially soybean [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii strains are two species capable of nodulate soybean, in which four strains are commonly used as inoculant in Brazil: B. elkanii SEMIA 587 and SEMIA 5019 and B. japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In B. japonicum 61A152 and Rhizobium leguminosarum fegA and fhuA genes, which are involved in the synthesis of membrane Fe3+-siderophore uptake proteins were already identified, respectively. In the opposite, almost nothing is known about these genes in B. elkanii species. In this work the siderophore production ability and the presence of genes related to the membrane Fe3+- siderophore uptake were analyzed in several Bradyrhizobium strains. A B. elkanii fhuA DNA region was isolated and it presented a high level of homology with others siderophore uptake related genes from different bacterial species. Southern blot experiments shown that there is a single fhuA gene copy in the B. elkanii SEMIA 587 genome, and no fegA gene was identified in this genome. Through the traditional CAS methodology, the siderophore production and uptake in vitro activities were demonstrated in the B. elkanii strains used as inoculant in Brazil. B. japonicum strains, however, although having siderophores specific membrane receptors, were not able to growth in a medium lacking iron. Such results indicated that significant differences concerning iron uptake system might exist between these two bacterial species. Studies to confirm fhuA gene function are under way aiming to verify the phenotypic viability of B. elkanii fhuA mutants.

Rizóbios são bactérias aeróbias, Gram-negativas, que fixam nitrogênio atmosférico quando associadas a leguminosas. O gênero Bradyrhizobium é de grande importância na agricultura, pois essas bactérias fixam nitrogênio em simbiose com soja [Glycine max (L.) Merrill]. A caracterização dos rizóbios é fundamental para estudos relacionados à diversidade e à distribuição ecológica desses microrganismos. Três estudos foram conduzidos nesse trabalho: i) uma estratégia baseada em amplificação por PCR para diferenciar Bradyrhizobium japonicum de B. elkanii, utilizando-se seqüências 16S rDNA; ii) a caracterização da variabilidade genética de uma população de bradirrizóbios isolada de um campo experimental, trinta anos após a inoculação de estirpes padrão; iii) a avaliação da variabilidade genética de bradirrizóbios isolados de cinco regiões produtoras de soja no Estado do Rio Grande do Sul (RS) e dos possíveis fatores ambientais que poderiam ser os responsáveis por tal diversidade. Técnicas de biologia molecular foram utilizadas na identificação, ocorrência, distribuição e estudo populacional dos rizóbios, especialmente a amplificação do gene 16S rRNA por PCR, rep-PCR e AFLP.Essas duas últimas técnicas quando combinadas permitiram uma análise mais precisa da variabilidade genética das populações estudadas. O índice de diversidade de Shannon foi utilizado para comparar o grau de diversidade observado nas diferentes populações. Também foi observada uma correlação direta entre o grau de diversidade e o pH do solo. Os resultados obtidos permitiram concluir que as populações de bradirrizóbios que nodulam as lavouras de soja do RS são altamente variáveis, podem persistir nos solos, mesmo na ausência da planta hospedeira, e sofrem influência de fatores bióticos e abióticos. / Rhizobia are Gram-negative aerobic bacteria that fix atmospheric nitrogen in symbiosis with leguminous plants. Bacteria belonging to the Bradyrhizobium genus are very important because they are able to nodulate and fix nitrogen in symbiosis with soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Characterization of rhizobia is fundamental in studies concerning the diversity and ecological distribution of these microorganisms. Three studies have been conducted in this work: i) a strategy based on amplification by PCR to differentiate Bradyrhizobium japonicum and B. elkanii using 16S rDNA sequences; ii) the genetic variability assessment of a bradyrhizobial population isolated from an experimental field thirty years after the inoculation with reference strains; iii) the genetic variability characterization of bradyrhizobia isolated from five soybean fields in different regions in Rio Grande do Sul (RS) State and the environmental factors that can influence such diversity. Molecular biology techniques were used for the identification, occurrence, distribution, and studies of rhizobia population, specially the 16S rRNA gene amplification by PCR, rep-PCR and AFLP. When combined, these last two techniques provided an accurate analysis of the genetic diversity of the analyzed populations. Shannon diversity index was used to compare the diversity among different populations.A direct correlation was observed between diversity degree and soil pH. The results obtained have shown that bradyrhizobia nodulating soybean in RS are highly variable and were able to persist in soil even when the host legume was lacking. Besides they have shown to be influenced by abiotic and biotic parameters.

Embora o ferro seja um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre, somente uma pequena fração está disponível para ser utilizada pelos organismos vivos. A solubilidade do ferro em solos com pH neutro é muito baixa, aproximadamente 10-18 M. Em condições de baixa disponibilidade de ferro, diversos microrganismos podem produzir e excretar sideróforos, quelantes orgânicos de baixo peso molecular envolvidos na solubilização e seqüestro de Fe3+. A captação de ferro é fator limitante para a fixação biológica do nitrogênio, uma vez que esse elemento está diretamente envolvido em moléculas como a nitrogenase, leg-hemoglobina, ferredoxina e citocromos. Enquanto microrganismos de vida-livre, os rizóbios devem ser capazes de solubilizar ferro e competir por ele no solo. As bactérias pertencentes ao gênero Bradyrhizobium são de grande relevância agronômica devido à capacidade de fixar nitrogênio em simbiose com diversas leguminosas, especialmente a soja [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii são duas espécies capazes de nodular soja e quatro estirpes são comumente utilizadas como inoculantes no Brasil: B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019 e B. japonicum SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Os genes fegA e fhuA, relacionados à síntese de proteínas de membrana transportadoras do complexo Fe3+ - sideróforo já foram identificados em B. japonicum 61A152 e Rhizobium leguminosarum, respectivamente. Ao contrário de B. japonicum, nada se conhece sobre esses genes na espécie B. elkanii. No presente trabalho foram analisadas a habilidade em produzir sideróforos e a presença de genes relacionados à síntese de proteínas receptoras do complexo Fe3+ - sideróforo entre diferentes estirpes de Bradyrhizobium. Uma porção do gene fhuA de B. elkanii foi isolada e apresentou um elevado grau de conservação com outros genes relacionados à captação de sideróforos em diferentes bactérias. Experimentos de Southern-blot demonstraram que existe apenas uma cópia do gene fhuA, e nenhuma do gene fegA, no genoma da estirpe SEMIA 587 de B. elkanii. Através do tradicional método CAS, a capacidade de produzir e captar sideróforos in vitro foi confirmada entre as estirpes de B. elkanii utilizadas como inoculantes comerciais no Brasil. As linhagens de B. japonicum, entretanto, mesmo possuindo receptores de membrana específicos para sideróforos, não são capazes de se multiplicar em meio de cultura deficiente em ferro. Tais resultados indicam a possibilidade de diferenças significativas quanto ao sistema de captação de ferro entre tais estirpes. Estudos que confirmem a função do gene fhuA estão sendo conduzidos para verificação da viabilidade fenotípica de B. elkanii mutante para esse gene. / Although iron is one of the most abundant elements in Earth, only one small fraction is available to be used by living organisms. The solubility of iron in soils with neutral pH is very low, approximately 10-18 M. During iron deficiency, many microorganisms can produce and excrete low molecular weight organic chelators termed siderophores involved in the solubilization and sequestration of Fe3+. The iron uptake is a limiting factor for the biological nitrogen fixation as iron is directly involved in many molecules that are essential to this process, like nitrogenase, leg-hemoglobin, ferredoxin and cytochrome. While free-living microorganism, rhizobia should be able to solubilize iron and compete for it in soil. Bacteria belonging to the genus Bradyrhizobium are of enormous agricultural value since they are able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with several leguminous plants, especially soybean [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii strains are two species capable of nodulate soybean, in which four strains are commonly used as inoculant in Brazil: B. elkanii SEMIA 587 and SEMIA 5019 and B. japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In B. japonicum 61A152 and Rhizobium leguminosarum fegA and fhuA genes, which are involved in the synthesis of membrane Fe3+-siderophore uptake proteins were already identified, respectively. In the opposite, almost nothing is known about these genes in B. elkanii species. In this work the siderophore production ability and the presence of genes related to the membrane Fe3+- siderophore uptake were analyzed in several Bradyrhizobium strains. A B. elkanii fhuA DNA region was isolated and it presented a high level of homology with others siderophore uptake related genes from different bacterial species. Southern blot experiments shown that there is a single fhuA gene copy in the B. elkanii SEMIA 587 genome, and no fegA gene was identified in this genome. Through the traditional CAS methodology, the siderophore production and uptake in vitro activities were demonstrated in the B. elkanii strains used as inoculant in Brazil. B. japonicum strains, however, although having siderophores specific membrane receptors, were not able to growth in a medium lacking iron. Such results indicated that significant differences concerning iron uptake system might exist between these two bacterial species. Studies to confirm fhuA gene function are under way aiming to verify the phenotypic viability of B. elkanii fhuA mutants.

Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Maria José Valarini / Banca: Haroldo Alves Pereira Junior / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: João Martins Pizauro Junior / Resumo: Diversos estudos com bactérias fixadoras de nitrogênio buscam identificar genes responsáveis pela fixação de nitrogênio, nodulação e simbiose, assim como conhecer seu genoma e compreender melhor o metabolismo delas. No entanto ainda há poucos trabalhos sobre o genoma de Bradyrhizobium elkanii, bactéria importante no contexto da produção de alimentos e de utilização comercial. Esse é o primeiro estudo a comparar 2654 genes de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, com as bactérias Bradyrhizobium japonicum LGM 6138, Azorhizobium caulinodans LGM 6465, Mesorhizobium huakuii LGM 14107, Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii LGM 8820 e Sinorhizobium meliloti LGM 6133 através da comparação de genomas por hibridização (CGH) usando Microarray. Portanto o objetivo deste trabalho foi realizar uma taxonomia molecular através da comparação de genomas por hibridização DNA-DNA, utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA (CGH Microarray), para buscar novos genes que possam ser úteis na classificação filogenética de rizóbios. A técnica de CGH Microarray permitiu encontrar sessenta e cinco genes comuns entre todas as bactérias analisadas, após realizar comparação e classificação de todos genes encontrados em comum entre elas. Os resultados obtidos ao se comparar três árvores filogenéticas baseadas em diferentes genes, confirmaram que alterar a quantidade e as sequências nas análises, causa variação nas árvores filogenéticas como já observado em outros microrganismos ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Diverse studies with fixing nitrogen bacteria search to identify responsible genes for the nitrogen fix, nodulation and symbiosis, as well as knowing its genome and understanding the metabolism of them better. However still has few works about genome of Bradyrhizobium elkanii, important bacterium in the context of the production of foods and commercial use. This is the first study to compare 2654 genes of Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, with the bacteria Bradyrhizobium japonicum LGM 6138, Azorhizobium caulinodans LGM 6465, Mesorhizobium huakuii LGM 14107, Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii LGM 8820 and Sinorhizobium meliloti LGM 6133 through the CGH Microarray. Therefore aim of this work was to carry a molecular taxonomy through the comparison of genomes for hybridization DNA-DNA, being used the technology of microarrangements of DNA (CGH Microarray), to search new genes that can be useful in the phylogenetic classification of rhizobia. The technique of CGH Microarray allowed to find sixty and five orthologs genes between all the analyzed bacteria, after to carry through comparison and classification of all genes in common between them. The results gotten to if comparing three established phylogenetic trees in different genes, had confirmed that to modify the amount and the sequences in the analyses, cause variation in the phylogenetic trees as already observed in other microorganisms. The results suggest that how much bigger will be the number of used ortholog genes in the phylogeny, more trustworthy will be the gotten phylogenetic trees ...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

Rizóbios são bactérias aeróbias, Gram-negativas, que fixam nitrogênio atmosférico quando associadas a leguminosas. O gênero Bradyrhizobium é de grande importância na agricultura, pois essas bactérias fixam nitrogênio em simbiose com soja [Glycine max (L.) Merrill]. A caracterização dos rizóbios é fundamental para estudos relacionados à diversidade e à distribuição ecológica desses microrganismos. Três estudos foram conduzidos nesse trabalho: i) uma estratégia baseada em amplificação por PCR para diferenciar Bradyrhizobium japonicum de B. elkanii, utilizando-se seqüências 16S rDNA; ii) a caracterização da variabilidade genética de uma população de bradirrizóbios isolada de um campo experimental, trinta anos após a inoculação de estirpes padrão; iii) a avaliação da variabilidade genética de bradirrizóbios isolados de cinco regiões produtoras de soja no Estado do Rio Grande do Sul (RS) e dos possíveis fatores ambientais que poderiam ser os responsáveis por tal diversidade. Técnicas de biologia molecular foram utilizadas na identificação, ocorrência, distribuição e estudo populacional dos rizóbios, especialmente a amplificação do gene 16S rRNA por PCR, rep-PCR e AFLP.Essas duas últimas técnicas quando combinadas permitiram uma análise mais precisa da variabilidade genética das populações estudadas. O índice de diversidade de Shannon foi utilizado para comparar o grau de diversidade observado nas diferentes populações. Também foi observada uma correlação direta entre o grau de diversidade e o pH do solo. Os resultados obtidos permitiram concluir que as populações de bradirrizóbios que nodulam as lavouras de soja do RS são altamente variáveis, podem persistir nos solos, mesmo na ausência da planta hospedeira, e sofrem influência de fatores bióticos e abióticos. / Rhizobia are Gram-negative aerobic bacteria that fix atmospheric nitrogen in symbiosis with leguminous plants. Bacteria belonging to the Bradyrhizobium genus are very important because they are able to nodulate and fix nitrogen in symbiosis with soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Characterization of rhizobia is fundamental in studies concerning the diversity and ecological distribution of these microorganisms. Three studies have been conducted in this work: i) a strategy based on amplification by PCR to differentiate Bradyrhizobium japonicum and B. elkanii using 16S rDNA sequences; ii) the genetic variability assessment of a bradyrhizobial population isolated from an experimental field thirty years after the inoculation with reference strains; iii) the genetic variability characterization of bradyrhizobia isolated from five soybean fields in different regions in Rio Grande do Sul (RS) State and the environmental factors that can influence such diversity. Molecular biology techniques were used for the identification, occurrence, distribution, and studies of rhizobia population, specially the 16S rRNA gene amplification by PCR, rep-PCR and AFLP. When combined, these last two techniques provided an accurate analysis of the genetic diversity of the analyzed populations. Shannon diversity index was used to compare the diversity among different populations.A direct correlation was observed between diversity degree and soil pH. The results obtained have shown that bradyrhizobia nodulating soybean in RS are highly variable and were able to persist in soil even when the host legume was lacking. Besides they have shown to be influenced by abiotic and biotic parameters.

Embora o ferro seja um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre, somente uma pequena fração está disponível para ser utilizada pelos organismos vivos. A solubilidade do ferro em solos com pH neutro é muito baixa, aproximadamente 10-18 M. Em condições de baixa disponibilidade de ferro, diversos microrganismos podem produzir e excretar sideróforos, quelantes orgânicos de baixo peso molecular envolvidos na solubilização e seqüestro de Fe3+. A captação de ferro é fator limitante para a fixação biológica do nitrogênio, uma vez que esse elemento está diretamente envolvido em moléculas como a nitrogenase, leg-hemoglobina, ferredoxina e citocromos. Enquanto microrganismos de vida-livre, os rizóbios devem ser capazes de solubilizar ferro e competir por ele no solo. As bactérias pertencentes ao gênero Bradyrhizobium são de grande relevância agronômica devido à capacidade de fixar nitrogênio em simbiose com diversas leguminosas, especialmente a soja [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii são duas espécies capazes de nodular soja e quatro estirpes são comumente utilizadas como inoculantes no Brasil: B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019 e B. japonicum SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Os genes fegA e fhuA, relacionados à síntese de proteínas de membrana transportadoras do complexo Fe3+ - sideróforo já foram identificados em B. japonicum 61A152 e Rhizobium leguminosarum, respectivamente. Ao contrário de B. japonicum, nada se conhece sobre esses genes na espécie B. elkanii. No presente trabalho foram analisadas a habilidade em produzir sideróforos e a presença de genes relacionados à síntese de proteínas receptoras do complexo Fe3+ - sideróforo entre diferentes estirpes de Bradyrhizobium. Uma porção do gene fhuA de B. elkanii foi isolada e apresentou um elevado grau de conservação com outros genes relacionados à captação de sideróforos em diferentes bactérias. Experimentos de Southern-blot demonstraram que existe apenas uma cópia do gene fhuA, e nenhuma do gene fegA, no genoma da estirpe SEMIA 587 de B. elkanii. Através do tradicional método CAS, a capacidade de produzir e captar sideróforos in vitro foi confirmada entre as estirpes de B. elkanii utilizadas como inoculantes comerciais no Brasil. As linhagens de B. japonicum, entretanto, mesmo possuindo receptores de membrana específicos para sideróforos, não são capazes de se multiplicar em meio de cultura deficiente em ferro. Tais resultados indicam a possibilidade de diferenças significativas quanto ao sistema de captação de ferro entre tais estirpes. Estudos que confirmem a função do gene fhuA estão sendo conduzidos para verificação da viabilidade fenotípica de B. elkanii mutante para esse gene. / Although iron is one of the most abundant elements in Earth, only one small fraction is available to be used by living organisms. The solubility of iron in soils with neutral pH is very low, approximately 10-18 M. During iron deficiency, many microorganisms can produce and excrete low molecular weight organic chelators termed siderophores involved in the solubilization and sequestration of Fe3+. The iron uptake is a limiting factor for the biological nitrogen fixation as iron is directly involved in many molecules that are essential to this process, like nitrogenase, leg-hemoglobin, ferredoxin and cytochrome. While free-living microorganism, rhizobia should be able to solubilize iron and compete for it in soil. Bacteria belonging to the genus Bradyrhizobium are of enormous agricultural value since they are able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with several leguminous plants, especially soybean [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii strains are two species capable of nodulate soybean, in which four strains are commonly used as inoculant in Brazil: B. elkanii SEMIA 587 and SEMIA 5019 and B. japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In B. japonicum 61A152 and Rhizobium leguminosarum fegA and fhuA genes, which are involved in the synthesis of membrane Fe3+-siderophore uptake proteins were already identified, respectively. In the opposite, almost nothing is known about these genes in B. elkanii species. In this work the siderophore production ability and the presence of genes related to the membrane Fe3+- siderophore uptake were analyzed in several Bradyrhizobium strains. A B. elkanii fhuA DNA region was isolated and it presented a high level of homology with others siderophore uptake related genes from different bacterial species. Southern blot experiments shown that there is a single fhuA gene copy in the B. elkanii SEMIA 587 genome, and no fegA gene was identified in this genome. Through the traditional CAS methodology, the siderophore production and uptake in vitro activities were demonstrated in the B. elkanii strains used as inoculant in Brazil. B. japonicum strains, however, although having siderophores specific membrane receptors, were not able to growth in a medium lacking iron. Such results indicated that significant differences concerning iron uptake system might exist between these two bacterial species. Studies to confirm fhuA gene function are under way aiming to verify the phenotypic viability of B. elkanii fhuA mutants.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-22Bitstream added on 2014-06-13T19:03:37Z : No. of bitstreams: 1 souza_jam_dr_jabo.pdf: 4083420 bytes, checksum: cb86ca179e1196f514509e27854de1c3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O nitrogênio é o nutriente requerido em maior quantidade para a cultura da soja. Avanços nas pesquisas de melhoramento genético vegetal e microbiologia do solo permitiram expandir o uso de inoculantes comerciais contendo estirpes de Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii. Estas bactérias infectam as raízes da planta e induzem a formação de nódulos, que abrigam a forma bacterióide, diferenciada da bactéria, responsável pela fixação simbiótica do nitrogênio. Informações sobre processos bioquímicos envolvidos no metabolismo da relação simbiótica podem ser adquiridas através de análises globais de expressão gênica. Para esta finalidade, destaca-se a tecnologia de microarranjo de DNA para detecção de genes diferencialmente expressos em larga escala. O objetivo geral deste trabalho foi identificar genes diferencialmente expressos, por meio de microarranjos de DNA, em Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587 cultivada em diferentes meios de cultura, RDM (Rhizobia Defined Medium), TY (Triptone-Yeast Medium) e YMB (Yeast-Mannitol Medium), e em bacterióides isolados de nódulos de soja em diferentes períodos de desenvolvimento, 13, 28 e 48 dias após inoculação. Para esta finalidade, a partir do seqüenciamento de DNA genômico de B. elkanii, um microarranjo (Be587) foi gerado contendo 2654 genes. Em meio RDM, a bactéria confrontou-se com a necessidade de se adaptar e sintetizar suas subunidades formadoras de macromoléculas a partir de uma única fonte de carbono, refletindo em um metabolismo mais ativo nas fases lag e log. Por outro lado, em meio TY, as células cultivadas na presença de uma boa fonte de carbono e energia cresceram rapidamente esgotando os recursos disponíveis no meio, 8 o que pode ter causado uma situação de estresse que se refletiu na identificação... / Nitrogen is the most required nutrient by soybean culture. Advanced researches in genetic plant breeding and soil microbiology allowed the expansion in commercial inoculants applications containing strains of Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii. These bacteria infect plant roots and induce nodule formation which home the differentiated bacteria, named bacteroid. The bacteroid in turn is responsible for symbiotic nitrogen fixation. Biochemical knowledge about processes of symbiotic regulation can be acquired by global analysis of gene expression. To achieve such information, the DNA microarray technology, used for detection of differentially expressed genes in large scale, was used. The purpose of this work was identificate differentially expressed genes of Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587, grown under different media conditions, such as RDM (Rhizobia Defined Medium), TY (Triptone- Yeast Medium) and YMB (Yeast-Mannitol Medium), and in bacteroids from soybean nodules at different developmental stages, 13, 28 e 49 days after inoculation. For this purpose, the DNA microarray Be587 with 2654 genes was generated from B. elkanii genomic DNA. In RDM medium the bacterium was confronted with the need of adaptation and building of macromolecules subunits from a single carbon source, what was reflected in a more active metabolism in lag and log phases. In turn, in TY medium with good carbon and energy sources the cells grew fastly and exhaust the medium sources available. Such condition can submitted the bacterial cells to a stress condition that reflected in the identification of higher number differentially expressed genes. At different bacteroids stages, the analysis detected genes related to nodulation and 10 nitrogen fixation regulation more than structural genes. Inasmuch, an organic nitrogen recycle might be involved... (Complete abstract, click electronic access below)

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21152号 / 農博第2278号 / 新制||農||1059(附属図書館) / 学位論文||H30||N5126(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科農学専攻 / (主査)教授 奥本 裕, 教授 白岩 立彦, 教授 冨永 達 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM