As plantas respondem ao ataque de insetos pela indução e acumulação de um conjunto grande de proteínas de defesa. Nesse trabalho foi feita uma investigação sobre as modificações transcricionais que ocorrem em plantas de cana-de-açúcar, em resposta ao ataque de lagartas de Diatraea saccharalis. A primeira abordagem foi o estudo detalhado da indução de duas isoformas do homólogo de cana-de-açúcar do gene de cevada induzido por dano barwin (barley woundinducible), chamado de sugarwin (sugarcane wound-inducible). A indução de transcritos de sugarwin ocorreu em resposta ao ferimento mecânico, dano provocado por D. saccharalis e tratamento com metil jasmonato. Além disso, sua expressão foi restrita ao local de dano. Sugarwins fazem parte do grupo de genes induzidos tardiamente por dano. A localização subcelular do peptídeo sinal fusionado à gfp (green fluorescent protein) mostra que essas proteínas são secretadas. Embora a função do domínio barwin não esteja completamente elucidada, atividades anti-patogênicas têm sido descritas para um grande número de homólogos. Alinhamentos múltiplos de seqüências do domínio barwin das proteínas de cana-de-açúcar e de outras proteínas de mono e dicotiledôneas revelaram altos índices de similaridade, sugerindo que sua função é conservada entre espécies. Esse é o primeiro relato da indução de uma proteína da família Barwin por herbivoria. A atividade dessas proteínas contra insetos nunca foi estudada. Os resultados apresentados aqui sugerem que as SUGARWINS fazem parte da estratégia de defesa de cana-de-açúcar. A segunda abordagem para estudar a resposta da cana-de-açúcar ao dano por D. saccharalis foi a análise em larga-escala, usando macroarranjos de DNA, de serino proteases e inibidores de serino proteases de cana-de-açúcar diferencialmente expressos em resposta a herbivoria. Enquanto que a função dos inibidores de proteases na defesa de plantas contra insetos e patógenos está bem estabelecida, o envolvimento de proteases na defesa tem sido proposto recentemente. O monitoramento de transcritos de serino proteases de cana-de-açúcar responsivos a herbivoria revelou vários genes cuja função precisa ser investigada. Uma das aplicações desses resultados é a identificação de genes para uso em estratégias biotecnológicas que visam aumentar a resistência de cana-de-açúcar a insetos. / Plants respond to insect damage by induction and accumulation of a large set of defense proteins. An investigation was undertaken to study the sugarcane transcriptional changes following Diatraea saccharalis damage. The first approach was a detailed study about the induction of two isoforms of a sugarcane homologue of a barley wound inducible gene, barwin, named sugarwin (sugarcane wound-inducible). Induction of sugarwin transcripts occurs in response to mechanical wounding, D. saccharalis feeding and methyl jasmonate treatment. Their expression is restricted to the site of damage. Sugarwins are members of the late wound-inducible genes. The subcellular localization of the signal peptide fused to the gfp (green fluorescent protein) shows that these proteins are secreted. Although the exact function of the barwin domain has not been completely elucidated, antipathogenic activities has been described for a number of homologues. Multiple sequence alignment of barwin domain-containing sugarcane proteins and of mono and dicotiledoneous proteins reveals high similarity, suggesting that their function is conserved among species. This is the first report of a barwin-like protein induced by herbivory. The activity of this type of proteins against insects has never been studied. Based on the results presented here, it can be concluded that SUGARWINS are part of the sugarcane defense response strategy. The second approach to study the sugarcane response to D. saccharalis damage was the large-scale analysis, using DNA macroarrays, of serine proteases and serine protease inhibitors differently expressed in response to herbivory. While the protease inhibitors function in defense is well-established, the involvement of proteases in defense has been recently proposed. The transcript monitoring of sugarcane serine proteases in response to herbivory revealed several candidate genes for further functional studies. One of the greatest applications of these results is the identification of genes for use in biotechnological strategies to improve sugarcane insect resistance.

A magnitude do problema de Diatraea saccharalis (Fabricius) tem aumentado nos últimos anos, principalmente nas culturas de cana-de-açúcar e milho no Brasil. Tradicionalmente, D. saccharalis tem sido controlado com agentes de controle biológico, principalmente na cultura da cana-de-açúcar. No entanto, a intervenção química tem sido necessária para o controle de D. saccharalis em ambas as culturas. Visando estabelecer estratégias proativas para o manejo da resistência de D. saccharalis a inseticidas e integrar as táticas de controle químico e biológico, objetivou-se nesse trabalho avaliar a toxicidade de alguns inseticidas (triflumuron, lambdacyhalothrin e fipronil) a D. saccharalis e ao parasitóide Cotesia flavipes (Cameron). A caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade de D. saccharalis a esses inseticidas foi realizada com bioensaio de ingestão, mediante contaminação da superfície da dieta artificial com o inseticida, utilizando-se lagartas de 2º instar. Baseado nas curvas de concentração-mortalidade da população suscetível de referência, foram definidas as concentrações diagnósticas de 320 µg de triflumuron /mL de água [I.A.(ppm)], 32 µg de fipronil /mL de água, e 3,2 µg de lambdacyhalothrin/ mL de água, correspondentes à CL99, para o monitoramento da resistência Foram verificadas diferenças significativas na suscetibilidade a inseticidas em populações de D. saccharalis coletadas em diferentes regiões produtoras de milho no Brasil e uma no Paraguai. Para triflumuron, as sobrevivências variaram de 0,85 e 34,2%; para fipronil de 0,21 e 2,71%; e para lambda-cyhalothrin de 0,21 a 7,9%. A toxicidade desses inseticidas sobre C. flavipes foi avaliada mediante determinações de efeitos letal e subletal desses inseticidas sobre adultos do parasitóide. Inicialmente foram avaliadas as concentrações recomendadas de 0,08 mg de triflumuron/L de água e 0,075 mg de lambda-cyhalothrin/L de água, além de 10 e 50% da concentração recomendada, mediante bioensaio de contato residual em discos de folha de canade- açúcar de resíduos com 0, 24 e 48 h de idade. A maior toxicidade foi observada com lambdacyhalothrin (mortalidade de até 100%). Triflumuron causou mortalidade de mortalidade de no máximo 32%. Observou-se também uma redução da longevidade de C. flavipes em todas as concentrações e idade de resíduos para ambos inseticidas. Posteriormente, para avaliar os efeitos indiretos de inseticidas sobre C. flavipes, lagartas sobreviventes de D. saccharalis a CL25 de triflumuron, lambda-cyhalothrin e fipronil foram expostas a C. flavipes para parasitismo. A capacidade de parasitismo foi também avaliada para a geração F1 do parasitóide. Nenhum dos inseticidas afetou a emergência de adultos, a mortalidade de larvas e pupas, e a razão sexual do parasitóide. Por outro lado, lambda-cyhalothrin e fipronil afetaram negativamente a taxa instantânea de crescimento de C. flavipes. Portanto, as estratégias de uso destes inseticidas para o controle de D. saccharalis devem ser implementadas com cautela para preservar a vida útil desses importantes inseticidas em programas de manejo integrado de pragas. / The magnitude of Diatraea saccharalis (Fabricius) problem has increased in the past years, mainly in sugarcane and maize crops in Brazil. Traditionally, D. saccharalis has been controlled with biological control agents. However, chemical intervention has been necessary to control D. saccharalis in both crops. For establishing a proactive insecticide resistance management of D. saccharalis and integrating chemical and biological control tactics, the major objective of this work was to evaluate the toxicity of some insecticides (triflumuron, lambdacyhalothrin e fipronil) to D. saccharalis and to the parasitoid Cotesia flavipes (Cameron). The baseline susceptibility of D. saccharalis to these insecticides was characterized with diet surface treatment bioassay by using 2nd instar larvae. Based on concentration-mortality response of the susceptible reference population, diagnostic concentrations of 320 µg of triflumuron/mL of water [A.I. (ppm)], 32 µg of fipronil/mL of water, and 3.2 µg de lambda-cyhalothrin/mL of water, corresponding to LC99, were defined for monitoring resistance. Significant differences in susceptibilities to insecticides were found in populations of D. saccharalis collected from major maize-production regions and one population from Paraguay. For triflumuron, the survivorship varied from 0.8 to 34.2%; for fipronil, from 0.2 to 2.7%; and for lambda-cyhalothrin, from 0.2 to 7.9%. The toxicity of these insecticides to C. flavipes was evaluated by determining the lethal and sublethal effects of the insecticides to the adults of this parasitoid. Initially, commercial rates of 0.08 mg triflumuron/ L of water and 0.075 mg lambda-cyhalothrin / L of water, and 10% and 50% of commercial rates, were evaluated with residual contact bioassay by using sugarcane leaf disks of 0, 24 and 48 h-old residues. The highest toxicity was detected to lambda-cyhalothrin (mortality up to 100%). Triflumuron caused mortality up to 32%. Reduction in the longevity of C. flavipes was detected in all concentrations and residue ages of both insecticides. Then, to evaluate the indirect effect of the insecticides, D. saccharalis larvae that survived at LC25 of triflumuron, lambda-cyhalothrin and fipronil were exposed to C. flavipes. The parasitism capacity of F1 generation of the parasitoid was also evaluated. None of the insecticide affected the adult emergence, pupal and larval mortality, and sexual ratio of the parasitoid. On the other hand, lambda-cyhalothrin e fipronil negatively affect the instantaneous rate of growth of C. flavipes. Therefore, the strategies of the use of these insecticides for controlling D. saccharalis should be carefully designed to preserve their lifetime in integrated pest management programs.

O seqüenciamento em larga-escala e a aplicação da tecnologia de seqüências expressas (ESTs) permitiram a identificação de milhares de seqüências genômicas de vários organismos. Através de projetos como o de obtenção de ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST - Sugarcane EST Project), a tecnologia de macro e microarranjos de DNA pôde ser aplicada para o monitoramento da expressão gênica. O primeiro passo deste trabalho foi otimizar a técnica de macroarranjos utilizando-se colônias bacterianas. Os arranjos foram construídos com o auxílio do robô Q-Bot. Células bacterianas contendo clones de cDNA de cana-de-açúcar foram arranjadas em duplicata em membranas de náilon e crescidas por 6 e 12 horas. Como resultado, concluiu-se que é possível estudar a expressão gênica em larga-escala usando macroarranjos de colônias bacterianas crescidas por 6 horas. Na segunda parte, o objetivo foi identificar genes de defesa em duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), em resposta ao herbívoro Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). A cana-de-açúcar é de grande importância para a agricultura brasileira e para a economia geral de muitos países em desenvolvimento. Estas plantas são atacadas por D. saccharalis, a mais importante praga desta cultura, causando significativas perdas econômicas. Como é sabido, as plantas desenvolveram complexas estratégias para se protegerem do ataque de insetos-praga. As variedades SP80-3280 (susceptível) e SP81-3250 (tolerante) de cana-de-açúcar foram expostas à D. saccharalis. Plantas submetidas à lagarta e plantas controle foram coletadas em 0.5, 6, 12 e 24 horas de experimento. As análises permitiram a identificação de genes diferencialmente expressos em resposta à lagarta nas duas variedades. Foram analisados o tempo, dinâmica e regulação da expressão de 3.840 clones do SUCEST, os quais foram crescidos na membrana de náilon por 6 horas. Estes ESTs foram agrupados em dezesseis classes: metabolismo de aminoácidos, crescimento/desenvolvimento, metabolismo de proteínas, metabolismo de RNA, metabolismo secundário, resposta à diferentes condições de estresse, transporte, bioenergética, transdução de sinal, dinâmica celular, metabolismo de DNA, metabolismo de lipídios, elementos móveis, metabolismo de nitrogênio, sulfato e fosfato, metabolismo de nucleotídeos e função não determinada (ND). Estes resultados ajudam elucidar as estratégias de defesa desenvolvidas pela cana-de-açúcar para evitar os danos causados por esta praga. Neste estudo, os dados do macroarray revelaram 580 ESTs com expressão aumentada, oriundos das duas variedades. Estes resultados são importantes não somente porque este é o primeiro estudo em larga-escala da expressão gênica de uma monocotiledônea em resposta ao ataque de herbívoros, mas também porque permite a comparação dos perfis de expressão entre genótipos susceptível e tolerante de cana-de-açúcar. Este estudo abre possibilidades para a engenharia genética de plantas de cana-de-açúcar inseto-resistentes e também para o uso destes genes como marcadores moleculares em programas de melhoramento assistido. / Large-scale sequencing and the application of expressed sequence tag (EST) technology has led to the identification of hundreds of thousands of genomic sequences from various organisms. Through projects like the Sugarcane Expressed Sequence Tag (SUCEST), DNA arrays technology could be applied in monitoring gene expression. The first step of this work was to optimize the macroarray technique with bacterial colonies. Arrays were robotically constructed (Q-Bot). Bacterial cells carrying sugarcane cDNA clones were arrayed in duplicate onto nylon membrane and grown for 6 and 12 hours. As a result, we conclude that is possible to study the gene expression in large-scale using macroarray through bacterial colony that grown for 6 hours. The second part of this work was to study how different two sugarcane varieties (Saccharum sp.) are in response resistance against Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Sugarcane is of great importance for Brazilian’s agriculture and for the general economy of many tropical developing countries. These plants are attacked by D. saccharalis, the most important insect pest of sugarcane, causing significant economic losses. As it is well known, plants have evolved complex defense strategies to protect them in opposition to attack by insects. The varieties SP80-3280 (susceptible) and SP81-3250 (tolerant) were exposed to D. saccharalis. Plants materials from plants with the borer and control plants (without the borer) were collected at 0.5, 6, 12 and 24 hours time points. The analysis revealed genes differentially expressed in response to sugarcane borer in both varieties. We analyzed the timing, dynamics, and regulation of the expression of 3,840 SUCEST clones, which were grown on a nylon membrane for 6 h. These ESTs was grouped into 16 broad categories: amino-acid metabolism, plant grow and development, protein metabolism, RNA metabolism, secondary metabolism, stress response, transport, bioenergetics, signal transduction, cellular dynamics, DNA metabolism, lipid, fatty-acid metabolism, mobile genetic elements, nitrogen, sulphur and phosphate metabolism, nucleotide metabolism, and the group matched to unable to classify, which no indication of the function of the gene product are known. These results help to elucidate the defense strategies developed by sugarcane in order to prevent against insect damage. In this study, macroarray analyses revealed 580 ESTs with increased expression, from both varieties. These results are important not only because this is the first large-scale gene expression study of a monocot in response to insect attack, but also because it allows the comparison of the gene expression pattern between susceptible and tolerant genotypes. This study opens possibilities for genetically-engineering of insect-resistant sugarcane and for using these genes as molecular markers in conventional breeding programs.

A broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é uma das pragas mais prejudiciais aos canaviais brasileiros. Atualmente, o controle biológico aplicado é o método mais utilizado para o controle das lagartas. Entretanto, em certos talhões, o parasitóide Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) não tem controlado eficientemente a praga, sendo registrada intensidade de infestação superior a 25%. Nesse contexto, a aplicação da Técnica do Inseto Estéril seria uma ferramenta adicional a ser empregada no Manejo Integrado de Pragas, pois é compatível com outros métodos de controle. A interferência na homeostase dos hormônios envolvidos no processo de ecdise com fontes exógenas de hormônio ou análogos sintéticos (agonistas ou antagonistas) pode resultar na interrupção do processo reprodutivo ou desenvolvimento anormal do embrião dos insetos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de inseticidas do grupo dos reguladores de crescimento de insetos sobre a reprodução de D. saccharalis, fornecidos na forma de isca com atrativo alimentar em condições de laboratório. Foram testados os seguintes inseticidas: clorfluazurom (1,0 e 1,5 g i.a./L), diflubenzurom (3,75; 5,0 e 7,5 g i.a./L), flufenoxurom (1,0 g i.a./L), lufenurom (0,75; 1,0 e 2,0 g i.a./L), novalurom (0,5 e 1,0 g i.a./L) piriproxifem (1,0; 1,5; 1,8 e 2,0 g i.a./L) e teflubenzurom (1,5; 3,0 e 6,0 g i.a./L), fornecidos a mariposas com um dia de idade em algodão embebido com uma solução de melaço a 10%. Todos os tratamentos, com exceção da menor dosagem de lufenurom (0,75 g i.a./L) reduziram a produção de ovos em relação à testemunha. Flufenoxurom (1,00 g i.a./L) e clorfluazurom (1,50 g i.a./L) reduziram a longevidade de ambos os sexos tratados por ingestão; enquanto, lufenurom (2,0 g i.a./L), novalurom (1,0 g i.a./L) e teflubenzurom (3,0 g i.a./L) reduziram a sobrevivência apenas dos machos. Os tratamentos mais eficientes na esterilização foram piriproxifem (1,8 g i.a./L e 2,0 g i.a./L) e lufenurom (2,0 g i.a./L), apresentando eficiências superiores ou próximas a 80%. / The sugarcane borer Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is an important pest in Brazilian sugarcane crops. Currently, biological control is the most frequently used method for controlling D saccharalis. However, in several locations, the parasitoid Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) has not been efective for controlling this pest, and it has been recorded infestation intensity above 25%. In this context, the Sterile Insect Technique could be an addicional control method in Intregrated Pest Management, because it is compatible with other control methods. The use of insecticides that interferes in hormone homeostasis involved in the ecdyse´s process with exogenous hormone sources or synthetic analogues (agonists or antagonists) can result in the interruption of the reproductive process or abnormal development of the insect?s embryo. Then, the objective of this study was to evaluate the insecticides that regulates the insect growth on the D. saccharalis reproduction. The insecticides tested were: chlorfluazuron (1,0 and 1,5 g a.i./L), diflubenzuron (3,75; 5,0 and 7,5 g a.i./L), flufenoxuron (1,0 g a.i./L), lufenuron (0,75; 1,0 and 2,0 g a.i./L), novaluron (0,5 and 1,0 g a.i./L) pyriproxyfen (1,0; 1,5; 1,8 and 2,0 g a.i./L) and teflubenzuron (1,5; 3,0 and 6,0 g a.i./L). Each insecticide was provided to 1-day moths on soaked cotton with a sugar solution at 10% as a bait. All treatments, except to of the lowest concentration of lufenuron (0,75 g a.i./L) decreased the egg production in relation to the control. Flufenoxuron (1,00 g g a.i./L) and chlorfluazuron (1,50 g a.i./L) decreased the lifespan of both sexes treated by ingestion. Lufenuron (2,0 g a.i./L), novaluron (1,0 g a.i./L) and teflubenzuron (3,0 g a.i./L) decreased the male´s lifespan. The most effective treatments for sterilization were pyriproxyfen (1,8 g a.i./L and 2,0 g a.i./L) and lufenuron (2,0 g a.i./L), witch showed efficiencies greater or close to 80%.

O Filo Microsporidia é composto por parasitas intracelulares obrigatórios que infectam de invertebrados a mamíferos. Alguns gêneros de microsporídeos entomopatogênicos são de extrema importância, visto que diversos estudos epizootiológicos indicam tais agentes como detentores de um papel fundamental na regulação da densidade populacional de seus hospedeiros. Além disso, esses patógenos são considerados como um dos principais obstáculos na manutenção da sanidade nas criações de insetos em laboratório. No Brasil, a partir de 1977, foram relatadas as primeiras ocorrências de nosemoses em criações de laboratório da broca-da-cana, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Crambidae). Este problema agravou-se no decorrer dos anos em função de alterações nas técnicas de criação da broca visando aumentar a escala produtiva deste inseto e do parasitoide Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae). Os objetivos deste trabalho consistiram na: (i) caracterização morfológica e molecular do patógeno, abordando ciclo de vida, patogenicidade a outros lepidópteros de importância agrícola e prevalência em populações de laboratório e campo de D. saccharalis e C. flavipes; (ii) determinação da virulência de Nosema sp. a D. saccharalis em laboratório; (iii) caraterização da propagação do patógeno nas lagartas e sua disseminação pelas fezes; (iv) efeitos da infecção na biologia de D. saccharalis e de C. flavipes e no desempenho do parasitoide quanto à seleção de hospedeiros infectados e não infectados; (v) transmissão do patógeno por C. flavipes a sua progênie e seus hospedeiros e (vi) controle de Nosema sp. em D. saccharalis por produtos antimicrobianos. Foi confirmado que o microsporídeo isolado de D. saccharalis pertence ao gênero Nosema, sendo patogênico à todas as espécies-praga avaliadas. A prevalência do patógeno em C. flavipes foi maior que a prevalência nas criações de D. saccharalis. Os esporos de Nosema sp. foram liberados nas fezes de D. saccharalis, variando o tempo até a liberação e a quantidade de esporos de acordo com o inóculo inicial de infecção. Embora Nosema seja considerado por muitos cientistas como enzoótico e com baixo potencial como agente de controle microbiano para ser usado de forma inundativa, a DL50 para D. saccharalis de 1º ínstar foi estimada em 5,6 esporos, demonstrando como as lagartas recém-eclodidas são muito suscetíveis ao microsporídeo. Infecções por Nosema sp. afetaram negativamente a biologia de D. saccharalis, exceto a duração da fase de pupa, sendo transmitido horizontal e verticalmente. Não foram observadas diferenças significativas na mortalidade de D. saccharalis infectadas por Nosema sp. tratadas com os antimicrobianos utilizados neste estudo em comparação à mortalidade do tratamento controle. Os parâmetros biológicos e o comportamento de C. flavipes sofreram alterações causadas pelo patógeno Nosema sp., que foi transmitido pelo parasitoide para o hospedeiro e por pelo menos quatro geraçõe de C. flavipes. Estes resultados ressaltam a relevância dos estudos sobre o impacto de Nosema sp. em D. saccharalis e C. flavipes, justificando esforços futuros no manejo da doença, dada a importância dessas espécies no agroecossistema da cana-de-açúcar. / The phylum Microsporidia consists of obligatory intracellular parasites that infect from invertebrates to mammalians. Some genera of entomopathogenic microsporidia are extremely important, considering that several epizootiological studies indicate that these agents as having a key role in density population regulating of their hosts. In addition, these pathogens are considered a major obstacle in maintaining healthiness in laboratory insect rearing. In Brazil occurrences of nosemoses were first reported in laboratory rearing of sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Crambidae), in the 1977. This problem has worsened over the years due to changes in the rearing methods aiming to increase the production scale of this insect and the parasitoid Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae). The objectives of this project consisted of (i) morphological and molecular characterization of the pathogen, addressing life cycle, pathogenicity to other lepidopterans of agricultural importance and prevalence in D. saccharalis and C. flavipes in laboratory rearing and in sugarcane plantations in the State of São Paulo, (ii) virulence of Nosema sp. to D. saccharalis in laboratory, (iii) transmission of the pathogen in D. saccharalis larvae and their dissemination in feces, (iv) the effects of infection on D. saccharalis and C. flavipes biology and performance of the parasitoid on the selection of infected and uninfected hosts, (v) the transmission of the pathogen by C. flavipes to their progeny and their hosts and (vi) the control of Nosema sp. in D. saccharalis by antimicrobial products. It was confirmed that the microsporidium isolated from D. saccharalis belongs to the genus Nosema, being pathogenic to all pest species evaluated in the host specificity study. The prevalence of the pathogen in C. flavipes was higher than the one in the D. saccharalis rearing facilities. Nosema sp spores were disseminated in the feces of D. saccharalis, varying the time until their release and the quantity of spores according to the initial inoculum of infection. Although Nosema is considered by many scientists as enzootic and low potential as a microbial control agent to be used inundatively, the LD50 for 1st instar D. saccharalis was estimated as 5.6 spores, demonstrating how that the newly-hatched larvae are very susceptible to this pathogen. Nosema sp. infections negatively affected the biology of D. saccharalis, except in the duration of the pupal stage, being transmitted horizontally and vertically. There were no significant differences in mortality of D. saccharalis infected by Nosema sp. treated with the antibiotics used in this study compared with the mortality of the control treatment. The biological parameters and behavior of C. flavipes suffered adverse effects caused by the pathogen Nosema sp., which was transmitted to the host by the parasitoid and its progeny to four C. flavipes generation. These results underscore the relevance of studies on the impact of Nosema sp. in D. saccharalis and C. flavipes, justifying future efforts in managing the disease, given the importance of these species in the sugarcane ecosystem.

As plantas respondem ao ataque de insetos pela indução e acumulação de um conjunto grande de proteínas de defesa. Nesse trabalho foi feita uma investigação sobre as modificações transcricionais que ocorrem em plantas de cana-de-açúcar, em resposta ao ataque de lagartas de Diatraea saccharalis. A primeira abordagem foi o estudo detalhado da indução de duas isoformas do homólogo de cana-de-açúcar do gene de cevada induzido por dano barwin (barley woundinducible), chamado de sugarwin (sugarcane wound-inducible). A indução de transcritos de sugarwin ocorreu em resposta ao ferimento mecânico, dano provocado por D. saccharalis e tratamento com metil jasmonato. Além disso, sua expressão foi restrita ao local de dano. Sugarwins fazem parte do grupo de genes induzidos tardiamente por dano. A localização subcelular do peptídeo sinal fusionado à gfp (green fluorescent protein) mostra que essas proteínas são secretadas. Embora a função do domínio barwin não esteja completamente elucidada, atividades anti-patogênicas têm sido descritas para um grande número de homólogos. Alinhamentos múltiplos de seqüências do domínio barwin das proteínas de cana-de-açúcar e de outras proteínas de mono e dicotiledôneas revelaram altos índices de similaridade, sugerindo que sua função é conservada entre espécies. Esse é o primeiro relato da indução de uma proteína da família Barwin por herbivoria. A atividade dessas proteínas contra insetos nunca foi estudada. Os resultados apresentados aqui sugerem que as SUGARWINS fazem parte da estratégia de defesa de cana-de-açúcar. A segunda abordagem para estudar a resposta da cana-de-açúcar ao dano por D. saccharalis foi a análise em larga-escala, usando macroarranjos de DNA, de serino proteases e inibidores de serino proteases de cana-de-açúcar diferencialmente expressos em resposta a herbivoria. Enquanto que a função dos inibidores de proteases na defesa de plantas contra insetos e patógenos está bem estabelecida, o envolvimento de proteases na defesa tem sido proposto recentemente. O monitoramento de transcritos de serino proteases de cana-de-açúcar responsivos a herbivoria revelou vários genes cuja função precisa ser investigada. Uma das aplicações desses resultados é a identificação de genes para uso em estratégias biotecnológicas que visam aumentar a resistência de cana-de-açúcar a insetos. / Plants respond to insect damage by induction and accumulation of a large set of defense proteins. An investigation was undertaken to study the sugarcane transcriptional changes following Diatraea saccharalis damage. The first approach was a detailed study about the induction of two isoforms of a sugarcane homologue of a barley wound inducible gene, barwin, named sugarwin (sugarcane wound-inducible). Induction of sugarwin transcripts occurs in response to mechanical wounding, D. saccharalis feeding and methyl jasmonate treatment. Their expression is restricted to the site of damage. Sugarwins are members of the late wound-inducible genes. The subcellular localization of the signal peptide fused to the gfp (green fluorescent protein) shows that these proteins are secreted. Although the exact function of the barwin domain has not been completely elucidated, antipathogenic activities has been described for a number of homologues. Multiple sequence alignment of barwin domain-containing sugarcane proteins and of mono and dicotiledoneous proteins reveals high similarity, suggesting that their function is conserved among species. This is the first report of a barwin-like protein induced by herbivory. The activity of this type of proteins against insects has never been studied. Based on the results presented here, it can be concluded that SUGARWINS are part of the sugarcane defense response strategy. The second approach to study the sugarcane response to D. saccharalis damage was the large-scale analysis, using DNA macroarrays, of serine proteases and serine protease inhibitors differently expressed in response to herbivory. While the protease inhibitors function in defense is well-established, the involvement of proteases in defense has been recently proposed. The transcript monitoring of sugarcane serine proteases in response to herbivory revealed several candidate genes for further functional studies. One of the greatest applications of these results is the identification of genes for use in biotechnological strategies to improve sugarcane insect resistance.

A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.

O Filo Microsporidia é composto por parasitas intracelulares obrigatórios que infectam de invertebrados a mamíferos. Alguns gêneros de microsporídeos entomopatogênicos são de extrema importância, visto que diversos estudos epizootiológicos indicam tais agentes como detentores de um papel fundamental na regulação da densidade populacional de seus hospedeiros. Além disso, esses patógenos são considerados como um dos principais obstáculos na manutenção da sanidade nas criações de insetos em laboratório. No Brasil, a partir de 1977, foram relatadas as primeiras ocorrências de nosemoses em criações de laboratório da broca-da-cana, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Crambidae). Este problema agravou-se no decorrer dos anos em função de alterações nas técnicas de criação da broca visando aumentar a escala produtiva deste inseto e do parasitoide Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae). Os objetivos deste trabalho consistiram na: (i) caracterização morfológica e molecular do patógeno, abordando ciclo de vida, patogenicidade a outros lepidópteros de importância agrícola e prevalência em populações de laboratório e campo de D. saccharalis e C. flavipes; (ii) determinação da virulência de Nosema sp. a D. saccharalis em laboratório; (iii) caraterização da propagação do patógeno nas lagartas e sua disseminação pelas fezes; (iv) efeitos da infecção na biologia de D. saccharalis e de C. flavipes e no desempenho do parasitoide quanto à seleção de hospedeiros infectados e não infectados; (v) transmissão do patógeno por C. flavipes a sua progênie e seus hospedeiros e (vi) controle de Nosema sp. em D. saccharalis por produtos antimicrobianos. Foi confirmado que o microsporídeo isolado de D. saccharalis pertence ao gênero Nosema, sendo patogênico à todas as espécies-praga avaliadas. A prevalência do patógeno em C. flavipes foi maior que a prevalência nas criações de D. saccharalis. Os esporos de Nosema sp. foram liberados nas fezes de D. saccharalis, variando o tempo até a liberação e a quantidade de esporos de acordo com o inóculo inicial de infecção. Embora Nosema seja considerado por muitos cientistas como enzoótico e com baixo potencial como agente de controle microbiano para ser usado de forma inundativa, a DL50 para D. saccharalis de 1º ínstar foi estimada em 5,6 esporos, demonstrando como as lagartas recém-eclodidas são muito suscetíveis ao microsporídeo. Infecções por Nosema sp. afetaram negativamente a biologia de D. saccharalis, exceto a duração da fase de pupa, sendo transmitido horizontal e verticalmente. Não foram observadas diferenças significativas na mortalidade de D. saccharalis infectadas por Nosema sp. tratadas com os antimicrobianos utilizados neste estudo em comparação à mortalidade do tratamento controle. Os parâmetros biológicos e o comportamento de C. flavipes sofreram alterações causadas pelo patógeno Nosema sp., que foi transmitido pelo parasitoide para o hospedeiro e por pelo menos quatro geraçõe de C. flavipes. Estes resultados ressaltam a relevância dos estudos sobre o impacto de Nosema sp. em D. saccharalis e C. flavipes, justificando esforços futuros no manejo da doença, dada a importância dessas espécies no agroecossistema da cana-de-açúcar. / The phylum Microsporidia consists of obligatory intracellular parasites that infect from invertebrates to mammalians. Some genera of entomopathogenic microsporidia are extremely important, considering that several epizootiological studies indicate that these agents as having a key role in density population regulating of their hosts. In addition, these pathogens are considered a major obstacle in maintaining healthiness in laboratory insect rearing. In Brazil occurrences of nosemoses were first reported in laboratory rearing of sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Crambidae), in the 1977. This problem has worsened over the years due to changes in the rearing methods aiming to increase the production scale of this insect and the parasitoid Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae). The objectives of this project consisted of (i) morphological and molecular characterization of the pathogen, addressing life cycle, pathogenicity to other lepidopterans of agricultural importance and prevalence in D. saccharalis and C. flavipes in laboratory rearing and in sugarcane plantations in the State of São Paulo, (ii) virulence of Nosema sp. to D. saccharalis in laboratory, (iii) transmission of the pathogen in D. saccharalis larvae and their dissemination in feces, (iv) the effects of infection on D. saccharalis and C. flavipes biology and performance of the parasitoid on the selection of infected and uninfected hosts, (v) the transmission of the pathogen by C. flavipes to their progeny and their hosts and (vi) the control of Nosema sp. in D. saccharalis by antimicrobial products. It was confirmed that the microsporidium isolated from D. saccharalis belongs to the genus Nosema, being pathogenic to all pest species evaluated in the host specificity study. The prevalence of the pathogen in C. flavipes was higher than the one in the D. saccharalis rearing facilities. Nosema sp spores were disseminated in the feces of D. saccharalis, varying the time until their release and the quantity of spores according to the initial inoculum of infection. Although Nosema is considered by many scientists as enzootic and low potential as a microbial control agent to be used inundatively, the LD50 for 1st instar D. saccharalis was estimated as 5.6 spores, demonstrating how that the newly-hatched larvae are very susceptible to this pathogen. Nosema sp. infections negatively affected the biology of D. saccharalis, except in the duration of the pupal stage, being transmitted horizontally and vertically. There were no significant differences in mortality of D. saccharalis infected by Nosema sp. treated with the antibiotics used in this study compared with the mortality of the control treatment. The biological parameters and behavior of C. flavipes suffered adverse effects caused by the pathogen Nosema sp., which was transmitted to the host by the parasitoid and its progeny to four C. flavipes generation. These results underscore the relevance of studies on the impact of Nosema sp. in D. saccharalis and C. flavipes, justifying future efforts in managing the disease, given the importance of these species in the sugarcane ecosystem.

A broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é uma das pragas mais prejudiciais aos canaviais brasileiros. Atualmente, o controle biológico aplicado é o método mais utilizado para o controle das lagartas. Entretanto, em certos talhões, o parasitóide Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) não tem controlado eficientemente a praga, sendo registrada intensidade de infestação superior a 25%. Nesse contexto, a aplicação da Técnica do Inseto Estéril seria uma ferramenta adicional a ser empregada no Manejo Integrado de Pragas, pois é compatível com outros métodos de controle. A interferência na homeostase dos hormônios envolvidos no processo de ecdise com fontes exógenas de hormônio ou análogos sintéticos (agonistas ou antagonistas) pode resultar na interrupção do processo reprodutivo ou desenvolvimento anormal do embrião dos insetos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de inseticidas do grupo dos reguladores de crescimento de insetos sobre a reprodução de D. saccharalis, fornecidos na forma de isca com atrativo alimentar em condições de laboratório. Foram testados os seguintes inseticidas: clorfluazurom (1,0 e 1,5 g i.a./L), diflubenzurom (3,75; 5,0 e 7,5 g i.a./L), flufenoxurom (1,0 g i.a./L), lufenurom (0,75; 1,0 e 2,0 g i.a./L), novalurom (0,5 e 1,0 g i.a./L) piriproxifem (1,0; 1,5; 1,8 e 2,0 g i.a./L) e teflubenzurom (1,5; 3,0 e 6,0 g i.a./L), fornecidos a mariposas com um dia de idade em algodão embebido com uma solução de melaço a 10%. Todos os tratamentos, com exceção da menor dosagem de lufenurom (0,75 g i.a./L) reduziram a produção de ovos em relação à testemunha. Flufenoxurom (1,00 g i.a./L) e clorfluazurom (1,50 g i.a./L) reduziram a longevidade de ambos os sexos tratados por ingestão; enquanto, lufenurom (2,0 g i.a./L), novalurom (1,0 g i.a./L) e teflubenzurom (3,0 g i.a./L) reduziram a sobrevivência apenas dos machos. Os tratamentos mais eficientes na esterilização foram piriproxifem (1,8 g i.a./L e 2,0 g i.a./L) e lufenurom (2,0 g i.a./L), apresentando eficiências superiores ou próximas a 80%. / The sugarcane borer Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is an important pest in Brazilian sugarcane crops. Currently, biological control is the most frequently used method for controlling D saccharalis. However, in several locations, the parasitoid Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) has not been efective for controlling this pest, and it has been recorded infestation intensity above 25%. In this context, the Sterile Insect Technique could be an addicional control method in Intregrated Pest Management, because it is compatible with other control methods. The use of insecticides that interferes in hormone homeostasis involved in the ecdyse´s process with exogenous hormone sources or synthetic analogues (agonists or antagonists) can result in the interruption of the reproductive process or abnormal development of the insect?s embryo. Then, the objective of this study was to evaluate the insecticides that regulates the insect growth on the D. saccharalis reproduction. The insecticides tested were: chlorfluazuron (1,0 and 1,5 g a.i./L), diflubenzuron (3,75; 5,0 and 7,5 g a.i./L), flufenoxuron (1,0 g a.i./L), lufenuron (0,75; 1,0 and 2,0 g a.i./L), novaluron (0,5 and 1,0 g a.i./L) pyriproxyfen (1,0; 1,5; 1,8 and 2,0 g a.i./L) and teflubenzuron (1,5; 3,0 and 6,0 g a.i./L). Each insecticide was provided to 1-day moths on soaked cotton with a sugar solution at 10% as a bait. All treatments, except to of the lowest concentration of lufenuron (0,75 g a.i./L) decreased the egg production in relation to the control. Flufenoxuron (1,00 g g a.i./L) and chlorfluazuron (1,50 g a.i./L) decreased the lifespan of both sexes treated by ingestion. Lufenuron (2,0 g a.i./L), novaluron (1,0 g a.i./L) and teflubenzuron (3,0 g a.i./L) decreased the male´s lifespan. The most effective treatments for sterilization were pyriproxyfen (1,8 g a.i./L and 2,0 g a.i./L) and lufenuron (2,0 g a.i./L), witch showed efficiencies greater or close to 80%.

A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.