O Reconhecimento do odor maternal é fundamental para a sobrevivência de filhotes altriciais como os ratos, pois eles dependem da mãe para proteção, manutenção da temperatura corporal e alimentação. Essa identificação da mãe nos primeiros dias de vida do filhote ocorre através do paradigma do aprendizado olfatório, que se dá pelo pareamento do cuidado maternal (estímulo tátil ou estímulo incondicionado) com o cheiro da mãe (estímulo condicionado). Esse estímulo tátil, aplicado pela mãe, atua sobre o locus coeruleos que emite uma projeção para o bulbo olfatório, promovendo a liberação de noradrenalina que resulta na fosforilação do fator de transcrição CREB (“Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc”). A fostorilação dessa proteína é o passo fundamental para a formação do aprendizado olfatório. O envolvimento da 5-HT nesse tipo de memória ainda não está bem esclarecido, mas postula-se que sua participação seria sinérgica a NA induzindo a fosforilação do CREB. Dessa forma, a manipulação neonatal que se caracteriza como um estímulo tátil induz por si só um aumento do comportamento maternal. Esse estímulo aparentemente não nocivo em ratos é capaz de interferir em filhotes fêmeas na preferência do odor materno, devido a alteração na via NA/CREB. Assim, o presente trabalho procurou analisar os efeitos da manipulação repetida sobre os níveis de fosforilação de CREB, NA e 5-HT no bulbo olfatório de filhotes aos sete dias de idade. Os resultados mostraram no bulbo olfatório dos filhotes machos um aumento da atividade 5-HT. Enquanto em ambos os sexos foi verificada uma redução turnover de NA. Assim, a redução da atividade noradrenérgica causada pelo procedimento de manipulação repetida, talvez seja a causa de possíveis alterações comportamentais e neuroendócrinas verificadas na relação mãe-filhote e na vida adulta.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The present thesis will try to elucidate important excitatory mechanisms in the brainstem related to cardio-respiratory control. We will discuss 4 recently published papers (cardiovascular control: Moreira e cols., 2005 e 2007; cardiorespiratory control: Takakura e cols., 2006; Moreira e cols., 2006). Papers 1 and 2: Glutamatergic mechanisms related to cardiovascular control. In the present study, we investigated the effects of inhibition of the caudal ventrolateral medulla (CVLM) with the GABA(A) agonist muscimol combined with the blockade of glutamatergic mechanism in the nucleus of the solitary tract (NTS) with kynurenic acid (kyn) on mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR), and regional vascular resistances. In male Holtzman rats anesthetized intravenously with urethane/chloralose, bilateral injections of muscimol (120 pmol) into the CVLM or bilateral injections of kyn (2.7 nmol) into the NTS alone increased MAP to 186 ± 11 and to 142 ± 6 mmHg, respectively, vs. control: 105 ± 4 mmHg; HR to 407 ± 15 and to 412 ± 18 beats per minute (bpm), respectively, vs. control: 352 ± 12 bpm; and renal, mesenteric and hindquarter vascular resistances. However, in rats with the CVLM bilaterally blocked by muscimol, additional injections of kyn into the NTS reduced MAP to 88 ± 5 mmHg and mesenteric and hindquarter vascular resistances below control baseline levels. Moreover, in rats with the glutamatergic mechanisms of the NTS blocked by bilateral injections of kyn, additional injections of muscimol into the CVLM also reduced MAP to 92 ± 2 mmHg and mesenteric and hindquarter vascular resistances below control baseline levels. Simultaneous blockade of NTS and CVLM did not modify the increase in HR but also abolished the increase in renal vascular resistance produced by each treatment alone. The results suggest that important pressor mechanisms arise from the NTS and CVLM to control vascular resistance and arterial pressure under the conditions of the present study. Papers 3 and 4: Central chemoreceptors brainstem mechanisms related to cardio-respiratory control. Paper 3: Interaction between central and peripheral chemoreceptors. The rat retrotrapezoid nucleus (RTN) contains pH-sensitive neurons that are putative central chemoreceptors. Here, we examined whether these neurons respond to peripheral chemoreceptor stimulation and whether the input is direct from the solitary tract nucleus (NTS) or indirect via the respiratory network. A dense neuronal projection from commissural NTS (commNTS) to RTN was revealed using the anterograde tracer biotinylated dextran amine (BDA). Within RTN, 51% of BDA-labelled axonal varicosities contained detectable levels of vesicular glutamate transporter-2 (VGLUT2) but only 5% contained glutamic acid decarboxylase-67 (GAD67). Awake rats were exposed to hypoxia (n = 6) or normoxia (n = 5) 1 week after injection of the retrograde tracer cholera toxin B (CTB) into RTN. Hypoxia-activated neurons were identified by the presence of Fosimmunoreactive nuclei. CommNTS neurons immunoreactive for both Fos and CTB were found only in hypoxia-treated rats. VGLUT2 mRNA was detected in 92 ± 13% of these neurons whereas only 12 ± 9% contained GAD67 mRNA. In urethane-chloralose-anaesthetized rats, bilateral inhibition of the RTN with muscimol eliminated the phrenic nerve discharge (PND) at rest, during hyperoxic hypercapnia (10% CO2), and during peripheral chemoreceptor stimulation (hypoxia and/or i.v. sodium cyanide, NaCN). RTN CO2-activated neurons were recorded extracellularly in anaesthetized intact or vagotomized rats. These neurons were strongly activated by hypoxia (10-15% O2; 30 s) or by NaCN. Hypoxia and NaCN were ineffective in rats with carotid chemoreceptor denervation. Bilateral injection of muscimol into the ventral respiratory column 1.5 mm caudal to RTN eliminated PND and the respiratory modulation of RTN neurons. Muscimol did not change the threshold and sensitivity of RTN neurons to hyperoxic hypercapnia nor their activation by peripheral chemoreceptor stimulation. In conclusion, RTN neurons respond to brain pCO2 presumably via their intrinsic chemosensitivity and to carotid chemoreceptor activation via a direct glutamatergic pathway from commNTS that bypasses the respiratory network. RTN neurons probably contribute a portion of the chemical drive to breathe. Paper 4: Central chemoreceptors and sympathetic vasomotor outflow. The present study explores how elevations in brain pCO2 increase the sympathetic nerve discharge (SND). SND, phrenic nerve discharge (PND) and putative sympathoexcitatory vasomotor neurons of the rostral ventrolateral medulla (RVLM) were recorded in anaesthetized sino-aortic denervated and vagotomized rats. Hypercapnia (end-expiratory CO2 from 5% to 10%) increased SND (97 ± 6%) and the activity of RVLM neurons (67 ± 4%). Injection of kynurenic acid (Kyn, ionotropic glutamate receptor antagonist) into RVLM or the retrotrapezoid nucleus (RTN) eliminated or reduced PND, respectively, but did not change the effect of CO2 on SND. Bilateral injection of Kyn or muscimol into the rostral ventral respiratory group (rVRG-pre-Botzinger region, also called CVLM) eliminated PND while increasing the stimulatory effect of CO2 on SND. Muscimol injection into commissural part of the solitary tract nucleus (commNTS) had no effect on PND or SND activation by CO2. As expected, injection of Kyn into RVLM or muscimol into commNTS virtually blocked the effect of carotid body stimulation on SND in rats with intact carotid sinus nerves. In conclusion, CO2 increases SND by activating RVLM sympathoexcitatory neurons. The relevant central chemoreceptors are probably located within or close to RVLM and not in the NTS or in the rVRG-pre-Botzinger/CVLM region. RVLM sympathoexcitatory neurons may be intrinsically pH-sensitive and/or receive excitatory synaptic inputs from RTN chemoreceptors. Activation of the central respiratory network reduces the overall sympathetic response to CO2, presumably by activating barosensitive CVLM neurons and inhibiting RTN chemoreceptors. / A presente tese de doutorado vai tentar elucidar os mecanismos excitatórios do bulbo relacionados ao controle cardiovascular e respiratório. Para tanto serão discutidos 4 trabalhos recentemente publicados (controle cardiovascular: Moreira e cols., 2005 e 2007; controle cardio-respiratório: Takakura e cols., 2006; Moreira e cols., 2006). Trabalhos 1 e 2: Relacionado aos mecanismos glutamatérgicos responsáveis pelo controle cardiovascular. No presente estudo, procuramos investigar os efeitos cardiovasculares promovidos pela inibição da região caudoventrolateral (CVL) do bulbo com a injeção bilateral de muscimol, juntamente com o bloqueio glutamatérgico dos núcleos do trato solitário (NTS) (região postremal ou comissural) com a injeção de ácido quinurênico (antagonista de receptores glutamatérgicos). Foram utilizados ratos Holtzman, anestesiados com uretana e alfa-cloralose e registrou-se a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e fluxo sanguíneo para os leitos renal, mesentérico e aórtico. A injeção bilateral de muscimol (agonista GABAérgico do sub-tipo A) (2 mM) na região do CVL ou a injeção de ácido quinurênico (50 mM) no NTS postremal produzem aumento de PAM (186 ± 11 ou 142 ± 6 mmHg, respectivamente, vs. controle: 105 ± 4 mmHg), de FC (407 ± 15 ou 412 ± 18 bpm, respectivamente, vs. controle: 352 ± 12 bpm) e aumento de resistência vascular renal, mesentérica e aórtica. A injeção de ácido quinurênico no NTS comissural (NTScom) não produz alterações nos valores basais da PAM, FC e resistência vascular. Entretanto, em animais com a injeção bilateral de muscimol no CVL, a injeção de ácido quinurênico no NTS (postremal ou comissural) reduziu a PAM e resistência vascular para valores abaixo do valor controle. Do mesmo modo, em ratos com o bloqueio do NTS (postremal ou comissural), a subsequente inibição do CVL produziu também uma redução da PAM e resistência vascular para valores abaixo do valor controle. Em animais com lesão eletrolítica da região do NTScom, a injeção de muscimol na região do CVL produziu redução da PAM e resistência vascular para valores abaixo do valor controle. Dinte disso, os resultados sugerem a existência de importantes mecanismos excitatórios no NTS (região postremal e comissural) e no CVL para controle da pressão arterial e resistência vascular. Trabalhos 3 e 4: Relacionado aos mecanismos bulbares ativados pelos quimiorreceptores centrais no controle cardio-respiratório. Trabalho 3: Interação entre quimiorreceptores centrais e periféricos. O núcleo retrotapezóide (NRT) contém neurônios sensíveis ao pH e são característicos como sendo quimiorreceptores centrais. A hipótese desse trabalho é procurar mostrar que a ativação dos quimiorreceptores periféricos promove a ativação dos quimiorreceptores centrais no NRT e que essa ativação é mediada por uma via direta do NTScom para o NRT. Nesse estudo foram utilizados ratos Sprague-Dawley. Uma densa projeção do NTScom para a região do NRT foi mostrada com o uso de traçadores anterógrados (amina dextrana biotinilada - BDA) injetados por iontoforese na região do NTScom. Na região do NRT, mais de 50% dos terminais que expressam BDA contêm a vesícula de transporte para glutamato (VGLUT2), mas apenas 5% contêm glutamina ácido descarboxilase (GAD67). Em um outro grupo de animais, uma semana após a injeção do traçador retrógrado cólera toxina B (CTB) no NRT, os animais foram expostos a períodos de hipóxia por 3 horas. A presença da proteína Fos serviu para identificar os neurônios que eram ativados pela hipóxia. Neurônios imunorreativos para Fos e CTB foram encontrados na região do NTScom. A grande maioria dos neurônios que eram imunorreativos para Fos e CTB, expressavam VGLUT2 mRNA, enquanto uma minoria expressou GAD67 mRNA. Na segunda parte do estudo foram utilizados animais anestesiados com uretana e alfa-cloralose e vagotomizados. A injeção bilateral de muscimol no NRT promoveu a eliminação do nervo frênico durante uma situação controle, durante a estimulação dos quimiorreceptores centrais (hipercapnia – 10% de CO2) e durante a estimulação dos quimiorreceptores periféricos (injeção endovenosa de cianeto de sódio ou hipóxia (10-15% de O2). A atividade dos neurônios quimiossensíveis do NRT foram registrados em animais intactos ou vagotomizados para possíveis comparações. Todos os neurônios quimiossensíveis do NRT foram ativados pelos quimiorreceptores periféricos. A ativação dos quimiorreceptores periféricos não promoveu a ativação dos neurônios do NRT em animais com desnervação dos quimiorreceptores. A injeção bilateral de muscimol na região do CVL promoveu a eliminação do nervo frênico e a modulação respiratória nos neurônios do NRT. A injeção de muscimol não alterou o limiar e a sensibilidade dos neurônios do NRT durante uma situação de hipercapnia e também durante a ativação dos quimiorreceptores periféricos. Portanto, podemos concluir nesse estudo que os neurônios do NRT respondem às variações de CO2 devido a presença de 2 mecanismos: sua quimiossensibilidade intrínseca e por meio da ativação dos quimiorreptores periféricos (via glutamatérgica direta do NTScom para o NRT). Trabalho 4: Quimiorreceptores centrais e atividade simpática. O próximo estudo procurou explorar como elevações na pCO2 pode aumentar a atividade simpática. Foram registrados a atividade simpática eferente do nervo esplâncnico, atividade do nervo frênico e atividade dos neurônios vasomotores da região rostroventrolateral (RVL) do bulbo. Os experimentos foram realizados em ratos Sprague-Dawley, anestesiados com halotana e completamente desnervados. Hipercapnia (variação do CO2 expirado de 5 para 10%) promoveu aumento da atividade simpática (97 ± 6%) e da atividade dos neurônios do RVL (67 ± 4%). A injeção bilateral de ácido quinurênico no RVL ou no NRT eliminou ou reduziu a atividade do nervo frênico, respectivamente, mas não alterou a atividade simpática eferente produzida pela hipercapnia. A injeção bilateral de ácido quinurênico ou muscimol na região do CVL eliminou a atividade do nervo frênico e promoveu um aumento do efeito estimulatório do CO2 na atividade simpática. A injeção de muscimol na região comissural do NTS não alterou as respostas estimulatórias do CO2 sobre a atividade simpática e atividade do nervo frênico. Como esperado, a injeção de ácido quinurênico no RVL ou a injeção de muscimol no NTS comissural, em ratos intactos, bloqueou os efeitos cardio-respiratórios da estimulação dos quimiorreceptores periféricos com a injeção endovenosa de cianeto de sódio. Em conclusão, a hipercapnia aumentou a atividade simpática por ativação dos neurônios bulbo-espinais do RVL. Os neurônios excitatórios do RVL podem ser sensíveis a variações de CO2 e/ou receber projeções excitatórias dos quimiorreceptores centrais da região do NRT. Durante uma situação de hipercapnia, o total de aumento da atividade simpática produzido pela ativação dos quimiorreceptores centrais parece estar reduzido. Esse efeito é, portanto, mediado pela ativação de neurônios barossensíveis da região do CVL ou, então, pela inibição dos quimiorreceptores centrais do NRT. / FAPESP: 03/08163-4 / FAPESP: 98/06231-2 / Capes: 3495/04-3 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Meticulous incision or excision of the stenotic segment and any associated proximal and distal spongiofibrosis is critical to the reliable success of urethroplasty procedures. However, normal urethral limits are determined during surgical reconstruction based on macroscopic aspects only. To our knowledge, microscopic studies evaluating the normal urethral ends have not been done. We aimed to describe the histological pattern of the presumed healthy limits of the urethral stricture disease, and the effect of a suprapubic urinary diversion on the proximal urethral end. Materials and Methods: Samples were obtained from 29 patients 20 to 65 years old (mean age 40.3) who underwent end-to-end bulbar urethroplasty. After urethral strictured segments were excised, biopsies of the presumed healthy ends (proximal and distal) were performed. Structural characterization was evaluated by staining histological sections in Haematoxylin-Eosin, Massons trichrome, Weigerts resorcin-fuchsin method, and picrosirius-polarization method. At least one month before urethroplasty, suprapubic urinary diversion was performed in fifteen (52%) patients. The control group consisted of 10 bulbar urethras obtained from fresh, macroscopically normal cadavers 21 to 32 years old (mean age 24.7). Results: Urethral strictures were due to contraction of the fibrous tissue which has begun to replace the normal structures of the corpus spongiosum. A replacement of the vascular sinusoids in the corpus spongiosum by a dense extracellular matrix (ECM) occurred in all patients. ECM was formed mainly by collagen (vast majority of them) and elastic fibers. No patient presented microscopic normal urethral ends. All urethral edges presented chronic and/or acute microscopic changes if compared to the control group. With regard to the proximal end, the deposit of ECM presented high cellular density in 18 (62.1%) cases. These cells were predominantly fibroblast and inflammatory cells and were related to the time of the urethral injury and the absence of a suprapubic urinary diversion. Also, in these patients, elastic fibres had a heterogeneous distribution in the proximal urethral end. Epithelial hyperplasia was found in 20 (69%) proximal urethral ends, and acute urethritis with mixed inflammatory cells was also evidenced. With regard to the distribution of collagen I and III, marked differences were found in all groups. Conclusion: Presumed healthy urethral ends of the end-to-end bulbar urethroplasty present structural changes. A suprapubic urinary diversion may influence the composition of the ECM in the proximal bulbar urethra. However, the clinical role of these findings needs further investigation. / A realização meticulosa de uma incisão ou excisão do segmento estenosado e da esponjofibrose associada, proximal ou distal, é crítica para o sucesso da uretroplastia anterior. Entretanto, a normalidade das margens da uretra estenosada é determinada durante o procedimento cirúrgico, baseado apenas no aspecto macroscópico do tecido. Não se encontraram na literatura estudos microscópicos avaliando as margens normais. O objetivo deste trabalho é caracterizar o aspecto histológico das margens aparentemente normais da estenose uretral masculina e o efeito causado pela realização de uma cistostomia supra púbica na microestrutura da extremidade uretral proximal à estenose. Materiais e Método: As amostras foram obtidas de 29 pacientes com média de idade de 40,3 anos, variando de 20 a 65 anos, submetidos à uretroplastia bulbar término-terminal. O segmento estenosado foi removido e foram realizadas biópsias nas extremidades supostamente sadias (proximais e distais). A caracterização estrutural foi realizada pelas seguintes colorações histológicas: Hematoxilina/Eosina, tricrômico de Masson, resorcina-fucsina de Weigert e picrosirius polarizado. Em 15 pacientes (52%) foi realizada uma cistostomia suprapúbica, cerca de um mês antes da uretroplastia,. O grupo controle consistiu de 10 uretras bulbares macroscopicamente normais, obtidas de cadáveres frescos, com média de idade de 24,7 anos (entre 21 e 32 anos). Resultados: A estenose de uretra decorreu da retração cicatricial do tecido fibroso, constituído por uma matriz extracelular (MEC) densa em todos os casos, que ocupou os seios vasculares do corpo esponjoso. A MEC foi constituída, na sua maioria, principalmente por colágeno e fibras elásticas. Em nenhum paciente as margens uretrais eram normais. Todas as extremidades tinham alterações microscópicas agudas e/ou crônicas quando comparadas ao grupo controle. Nas extremidades proximais, o depósito de MEC tinha alta densidade celular em 18 casos (62,1%). Estas células foram predominantemente inflamatórias e fibroblastos. Sua presença se relacionou ao tempo de lesão uretral e à ausência de cistostomia suprapúbica. Além disso, as fibras elásticas tiveram distribuição heterogênea na extremidade proximal. Encontrou-se hiperplasia epitelial em 20 (69%) extremidades proximais da uretra e uretrite aguda com infiltrado inflamatório misto. Com relação à distribuição de colágeno tipo I e III, diferenças marcantes foram encontradas em todos os grupos. Conclusão: As extremidades supostamente normais da uretroplastia término-terminal apresentam alterações estruturais. A derivação urinária suprapúbica pode influenciar a composição da MEC na uretra bulbar proximal. O valor clínico destes achados, entretanto, necessita maiores investigações. Palavras Chave: Uretra, Estenose uretral, Matriz extracelular, Colágeno, Procedimentos cirúrgicos reconstrutores.

O Reconhecimento do odor maternal é fundamental para a sobrevivência de filhotes altriciais como os ratos, pois eles dependem da mãe para proteção, manutenção da temperatura corporal e alimentação. Essa identificação da mãe nos primeiros dias de vida do filhote ocorre através do paradigma do aprendizado olfatório, que se dá pelo pareamento do cuidado maternal (estímulo tátil ou estímulo incondicionado) com o cheiro da mãe (estímulo condicionado). Esse estímulo tátil, aplicado pela mãe, atua sobre o locus coeruleos que emite uma projeção para o bulbo olfatório, promovendo a liberação de noradrenalina que resulta na fosforilação do fator de transcrição CREB (“Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc”). A fostorilação dessa proteína é o passo fundamental para a formação do aprendizado olfatório. O envolvimento da 5-HT nesse tipo de memória ainda não está bem esclarecido, mas postula-se que sua participação seria sinérgica a NA induzindo a fosforilação do CREB. Dessa forma, a manipulação neonatal que se caracteriza como um estímulo tátil induz por si só um aumento do comportamento maternal. Esse estímulo aparentemente não nocivo em ratos é capaz de interferir em filhotes fêmeas na preferência do odor materno, devido a alteração na via NA/CREB. Assim, o presente trabalho procurou analisar os efeitos da manipulação repetida sobre os níveis de fosforilação de CREB, NA e 5-HT no bulbo olfatório de filhotes aos sete dias de idade. Os resultados mostraram no bulbo olfatório dos filhotes machos um aumento da atividade 5-HT. Enquanto em ambos os sexos foi verificada uma redução turnover de NA. Assim, a redução da atividade noradrenérgica causada pelo procedimento de manipulação repetida, talvez seja a causa de possíveis alterações comportamentais e neuroendócrinas verificadas na relação mãe-filhote e na vida adulta.

Meticulous incision or excision of the stenotic segment and any associated proximal and distal spongiofibrosis is critical to the reliable success of urethroplasty procedures. However, normal urethral limits are determined during surgical reconstruction based on macroscopic aspects only. To our knowledge, microscopic studies evaluating the normal urethral ends have not been done. We aimed to describe the histological pattern of the presumed healthy limits of the urethral stricture disease, and the effect of a suprapubic urinary diversion on the proximal urethral end. Materials and Methods: Samples were obtained from 29 patients 20 to 65 years old (mean age 40.3) who underwent end-to-end bulbar urethroplasty. After urethral strictured segments were excised, biopsies of the presumed healthy ends (proximal and distal) were performed. Structural characterization was evaluated by staining histological sections in Haematoxylin-Eosin, Massons trichrome, Weigerts resorcin-fuchsin method, and picrosirius-polarization method. At least one month before urethroplasty, suprapubic urinary diversion was performed in fifteen (52%) patients. The control group consisted of 10 bulbar urethras obtained from fresh, macroscopically normal cadavers 21 to 32 years old (mean age 24.7). Results: Urethral strictures were due to contraction of the fibrous tissue which has begun to replace the normal structures of the corpus spongiosum. A replacement of the vascular sinusoids in the corpus spongiosum by a dense extracellular matrix (ECM) occurred in all patients. ECM was formed mainly by collagen (vast majority of them) and elastic fibers. No patient presented microscopic normal urethral ends. All urethral edges presented chronic and/or acute microscopic changes if compared to the control group. With regard to the proximal end, the deposit of ECM presented high cellular density in 18 (62.1%) cases. These cells were predominantly fibroblast and inflammatory cells and were related to the time of the urethral injury and the absence of a suprapubic urinary diversion. Also, in these patients, elastic fibres had a heterogeneous distribution in the proximal urethral end. Epithelial hyperplasia was found in 20 (69%) proximal urethral ends, and acute urethritis with mixed inflammatory cells was also evidenced. With regard to the distribution of collagen I and III, marked differences were found in all groups. Conclusion: Presumed healthy urethral ends of the end-to-end bulbar urethroplasty present structural changes. A suprapubic urinary diversion may influence the composition of the ECM in the proximal bulbar urethra. However, the clinical role of these findings needs further investigation. / A realização meticulosa de uma incisão ou excisão do segmento estenosado e da esponjofibrose associada, proximal ou distal, é crítica para o sucesso da uretroplastia anterior. Entretanto, a normalidade das margens da uretra estenosada é determinada durante o procedimento cirúrgico, baseado apenas no aspecto macroscópico do tecido. Não se encontraram na literatura estudos microscópicos avaliando as margens normais. O objetivo deste trabalho é caracterizar o aspecto histológico das margens aparentemente normais da estenose uretral masculina e o efeito causado pela realização de uma cistostomia supra púbica na microestrutura da extremidade uretral proximal à estenose. Materiais e Método: As amostras foram obtidas de 29 pacientes com média de idade de 40,3 anos, variando de 20 a 65 anos, submetidos à uretroplastia bulbar término-terminal. O segmento estenosado foi removido e foram realizadas biópsias nas extremidades supostamente sadias (proximais e distais). A caracterização estrutural foi realizada pelas seguintes colorações histológicas: Hematoxilina/Eosina, tricrômico de Masson, resorcina-fucsina de Weigert e picrosirius polarizado. Em 15 pacientes (52%) foi realizada uma cistostomia suprapúbica, cerca de um mês antes da uretroplastia,. O grupo controle consistiu de 10 uretras bulbares macroscopicamente normais, obtidas de cadáveres frescos, com média de idade de 24,7 anos (entre 21 e 32 anos). Resultados: A estenose de uretra decorreu da retração cicatricial do tecido fibroso, constituído por uma matriz extracelular (MEC) densa em todos os casos, que ocupou os seios vasculares do corpo esponjoso. A MEC foi constituída, na sua maioria, principalmente por colágeno e fibras elásticas. Em nenhum paciente as margens uretrais eram normais. Todas as extremidades tinham alterações microscópicas agudas e/ou crônicas quando comparadas ao grupo controle. Nas extremidades proximais, o depósito de MEC tinha alta densidade celular em 18 casos (62,1%). Estas células foram predominantemente inflamatórias e fibroblastos. Sua presença se relacionou ao tempo de lesão uretral e à ausência de cistostomia suprapúbica. Além disso, as fibras elásticas tiveram distribuição heterogênea na extremidade proximal. Encontrou-se hiperplasia epitelial em 20 (69%) extremidades proximais da uretra e uretrite aguda com infiltrado inflamatório misto. Com relação à distribuição de colágeno tipo I e III, diferenças marcantes foram encontradas em todos os grupos. Conclusão: As extremidades supostamente normais da uretroplastia término-terminal apresentam alterações estruturais. A derivação urinária suprapúbica pode influenciar a composição da MEC na uretra bulbar proximal. O valor clínico destes achados, entretanto, necessita maiores investigações. Palavras Chave: Uretra, Estenose uretral, Matriz extracelular, Colágeno, Procedimentos cirúrgicos reconstrutores.

A manipulação neonatal altera o comportamento maternal e a relação mãefilhote induzindo mudanças fisiológicas e alterações comportamentais em resposta a estímulos estressores, que perduram ao longo da vida do animal. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da manipulação neonatal (dia pós-natal 1 ao dia pósnatal 10) sobre o número de células nas camadas do bulbo olfatório de ratos machos e fêmeas aos 11 e aos 90 dias de idade. Além disso, estudar o envolvimento do sistema olfatório (no início e na vida adulta do animal) no estabelecimento das relações sociais em ratos que sofreram manipulação neonatal. Nossos resultados mostraram uma redução significativa no número de células mitrais e no número total de células na camada glomerular em ratos manipulados machos e fêmeas em ambas as idades. O número de neurônios NeuN-positivo também está alterado. Fêmeas manipuladas no período neonatal apresentam redução no número de neurônios NeuN-positivos na vida adulta. Quanto às relações sociais, a manipulação neonatal não alterou a preferência olfatória no início da vida do animal (aos 11 dias de idade). Entretanto, na vida adulta este procedimento causou uma redução na preferência sexual de ratos machos. Em relação ao comportamento maternal, não foram encontradas diferenças entres os grupos manipulado e não manipulado. Estes resultados indicam que alterações no ambiente neonatal causam mudanças estruturais estáveis no bulbo olfatório, o que pode ser uma das causas das alterações nos comportamentos sociais, como por exemplo, comportamento sexual, interação e memória social, encontradas em animais que sofreram manipulação neonatal. / Neonatal handling alters maternal behavior and mother-pup inducing physiological changes and behavioral changes in response to stressful stimuli, which persist throughout the life of the animal. This study aims to examine the effects of neonatal handling (postnatal day 1 to postnatal day 10) on the number of cells in the layers of the olfactory bulb of male and female rats at 11 and 90 days old. Moreover, studying the involvement of the olfactory system (early and adult life of the animal) in the establishment of social relations in rats subjected to neonatal handling. Our results showed a significant reduction in the number of mitral cells and the number of cells in the glomerular layer in handled rats males and females at both ages. The number of NeuN-positive neurons is also changed. Neonatal handled females show a significant reduction in the number of NeuN-positive neurons in adulthood. As for social relations, neonatal handling did not alter olfactory preferences in early life of the animal (at 11 days old). However, in adulthood this procedure caused a reduction in the sexual preference of male rats. In relation to maternal behavior, no differences were found between the groups handled and nonhandled. Neonatal changes in the environment cause permanent structural changes in the olfactory bulb, which may be one of the causes of changes in social behaviors, such as sexual behavior, social interaction and memory, found in animals that underwent neonatal handling.

A manipulação neonatal altera o comportamento maternal e a relação mãefilhote induzindo mudanças fisiológicas e alterações comportamentais em resposta a estímulos estressores, que perduram ao longo da vida do animal. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da manipulação neonatal (dia pós-natal 1 ao dia pósnatal 10) sobre o número de células nas camadas do bulbo olfatório de ratos machos e fêmeas aos 11 e aos 90 dias de idade. Além disso, estudar o envolvimento do sistema olfatório (no início e na vida adulta do animal) no estabelecimento das relações sociais em ratos que sofreram manipulação neonatal. Nossos resultados mostraram uma redução significativa no número de células mitrais e no número total de células na camada glomerular em ratos manipulados machos e fêmeas em ambas as idades. O número de neurônios NeuN-positivo também está alterado. Fêmeas manipuladas no período neonatal apresentam redução no número de neurônios NeuN-positivos na vida adulta. Quanto às relações sociais, a manipulação neonatal não alterou a preferência olfatória no início da vida do animal (aos 11 dias de idade). Entretanto, na vida adulta este procedimento causou uma redução na preferência sexual de ratos machos. Em relação ao comportamento maternal, não foram encontradas diferenças entres os grupos manipulado e não manipulado. Estes resultados indicam que alterações no ambiente neonatal causam mudanças estruturais estáveis no bulbo olfatório, o que pode ser uma das causas das alterações nos comportamentos sociais, como por exemplo, comportamento sexual, interação e memória social, encontradas em animais que sofreram manipulação neonatal. / Neonatal handling alters maternal behavior and mother-pup inducing physiological changes and behavioral changes in response to stressful stimuli, which persist throughout the life of the animal. This study aims to examine the effects of neonatal handling (postnatal day 1 to postnatal day 10) on the number of cells in the layers of the olfactory bulb of male and female rats at 11 and 90 days old. Moreover, studying the involvement of the olfactory system (early and adult life of the animal) in the establishment of social relations in rats subjected to neonatal handling. Our results showed a significant reduction in the number of mitral cells and the number of cells in the glomerular layer in handled rats males and females at both ages. The number of NeuN-positive neurons is also changed. Neonatal handled females show a significant reduction in the number of NeuN-positive neurons in adulthood. As for social relations, neonatal handling did not alter olfactory preferences in early life of the animal (at 11 days old). However, in adulthood this procedure caused a reduction in the sexual preference of male rats. In relation to maternal behavior, no differences were found between the groups handled and nonhandled. Neonatal changes in the environment cause permanent structural changes in the olfactory bulb, which may be one of the causes of changes in social behaviors, such as sexual behavior, social interaction and memory, found in animals that underwent neonatal handling.

O Reconhecimento do odor maternal é fundamental para a sobrevivência de filhotes altriciais como os ratos, pois eles dependem da mãe para proteção, manutenção da temperatura corporal e alimentação. Essa identificação da mãe nos primeiros dias de vida do filhote ocorre através do paradigma do aprendizado olfatório, que se dá pelo pareamento do cuidado maternal (estímulo tátil ou estímulo incondicionado) com o cheiro da mãe (estímulo condicionado). Esse estímulo tátil, aplicado pela mãe, atua sobre o locus coeruleos que emite uma projeção para o bulbo olfatório, promovendo a liberação de noradrenalina que resulta na fosforilação do fator de transcrição CREB (“Proteína ligante ao elemento responsivo ao AMPc”). A fostorilação dessa proteína é o passo fundamental para a formação do aprendizado olfatório. O envolvimento da 5-HT nesse tipo de memória ainda não está bem esclarecido, mas postula-se que sua participação seria sinérgica a NA induzindo a fosforilação do CREB. Dessa forma, a manipulação neonatal que se caracteriza como um estímulo tátil induz por si só um aumento do comportamento maternal. Esse estímulo aparentemente não nocivo em ratos é capaz de interferir em filhotes fêmeas na preferência do odor materno, devido a alteração na via NA/CREB. Assim, o presente trabalho procurou analisar os efeitos da manipulação repetida sobre os níveis de fosforilação de CREB, NA e 5-HT no bulbo olfatório de filhotes aos sete dias de idade. Os resultados mostraram no bulbo olfatório dos filhotes machos um aumento da atividade 5-HT. Enquanto em ambos os sexos foi verificada uma redução turnover de NA. Assim, a redução da atividade noradrenérgica causada pelo procedimento de manipulação repetida, talvez seja a causa de possíveis alterações comportamentais e neuroendócrinas verificadas na relação mãe-filhote e na vida adulta.

La transmission des messages douloureux depuis les nocicepteurs périphériques jusqu’aux structures supraspinales est sous le contrôle de systèmes modulateurs, parmi lesquels figurent les voies bulbo-spinales sérotoninergiques. Cependant leur rôle n’est pas complètement élucidé puisque selon le type de récepteur sérotoninergique mis en jeu, elles pourraient soit réduire la sensation douloureuse soit au contraire l’exacerber. De plus, le contrôle exercé par la sérotonine (5 HT) pourrait dépendre du type de douleur, aiguë, inflammatoire ou neuropathique chronique. En réalité, ces ambiguïtés tiennent au fait que les études réalisées jusqu’à présent ont surtout impliqué des approches pharmacologiques souvent peu fiables. Ce constat m’a conduit à mettre en œuvre une nouvelle approche expérimentale pour tenter de cerner le véritable rôle modulateur des voies sérotoninergiques bulbo-spinales sur différents types de douleur dans des conditions physiologiques normales ou physiopathologiques chez le rat. A cette fin, j’ai réalisé ce travail de thèse en trois étapes. La première étape a consisté à préciser les caractéristiques anatomiques des voies sérotoninergiques bulbo-spinales visualisées par un marquage antérograde (PHA-L) couplé à l’immunomarquage du transporteur de la sérotonine (SERT). L’étude différentielle des deux sous-structures de la région bulbaire B3 : le noyau raphé magnus (RMg) et le noyau paragigantocellulaire latéral (LPGi) m’a permis de montrer que les neurones sérotoninergiques qu’elles contiennent se projettent respectivement dans les couches profondes (VI-VI) et superficielles (I-II) de la corne dorsale, à tous les étages de la moelle épinière. Afin de dépléter sélectivement la 5-HT dans la corne dorsale, j’ai, dans une deuxième étape, injecté bilatéralement dans la région B3 un lentivirus recombinant LV-shTPH2 pour y éteindre l’expression de la TPH2, l’enzyme limitante de la synthèse de 5-HT. Les contrôles immunohistochimiques ont montré l’inhibition bilatérale de l’expression de la TPH2 dans le RMg et le LPGi, et la diminution de l’immunomarquage de la 5-HT sélectivement dans la corne dorsale, l’expression inchangée du transporteur SERT confirmant le maintien de l’intégrité des fibres sérotoninergiques chez les rats LV-shTPH2. L’évaluation de la sensibilité des animaux ainsi déplétés en 5-HT à différents tests validés de nociception aiguë n’a pas révélé de modifications significatives par rapport aux témoins. Mais dans des conditions de forte stimulation nociceptive thermique (50°C) ou chimique (carragénine), l’augmentation de l’immunomarquage de c-Fos dans la corne dorsale chez les rats LV-shTPH2 montre que la déplétion de 5-HT facilite la sensibilisation synaptique. Des différences encore plus nettes entre les rats LV-shTPH2 et les témoins sont surtout apparues en cas de douleur inflammatoire (formaline) ou neuropathique (ligature du nerf sciatique). Les modifications induites par la déplétion de 5-HT n’étaient cependant pas univoques puisqu’une hypoalgésie a été observée dans le cas d’une douleur inflammatoire et, qu’au contraire, l’hyperalgésie associée à la douleur neuropathique était exacerbée chez les rats LV-shTPH2. Ces modulations opposées laissant à penser l’implication de projections et/ou de récepteurs sérotoninergiques distincts, nous avons réalisé, dans une troisième étape, une étude pharmacologique qui a permis de montrer que l’effet pro-hyperalgésique observé chez les rats neuropathiques déplétés en 5-HT était probablement lié à un déficit d’activation de récepteurs 5 HT7. Notre étude démontre la réalité du contrôle physiologique du relai spinal des voies nociceptives par la 5-HT, via l’implication de projections bulbo-spinales et de récepteurs sérotoninergiques dont l’identification pourrait déboucher sur de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The transmission of pain signals from peripheral nociceptors to supraspinal structures is under the control of modulatory systems, which include bulbo-spinal serotoninergic pathways. However, their role is not yet fully understood, as they may as well reduce or exacerbate pain as a function of 5-HT receptor types involved. Furthermore, their modulatory role might also differ depending on whether pain is acute, or chronic, with inflammatory or neuropathic origin. In fact, this ambiguous knowledge results from data essentially obtained with rather unreliable pharmacological approaches. This led me to set up an innovative experimental approach for a better assessment of the real implication of bulbo-spinal serotoninergic projections in pain control mechanisms under validated physiological and pathophysiological conditions in the rat. To this goal, I performed my PhD thesis work in three steps. The first step consisted of a precise anatomical description of bulbo-spinal serotoninergic projections identified by anterograde labeling (with PHA-L) and immunolabeling of the 5-HT transporter (SERT). The differential labeling of the two sub-areas within the B3 bulbar region : the nucleus raphé magnus (RMg) and the nucleus paragigantocellularis lateralis (LPGi) allowed the demonstration that their respective 5-HT neuron groups project separately into the deep (V-VI) and superficial (I-II) laminae of the dorsal horn, at all levels of the spinal cord. For the second step, aimed at depleting 5-HT selectively within the dorsal horn, I injected bilaterally into the B3 area a recombinant lentivirus, LV-shTPH2, designed to suppress the expression of TPH2, the rate limiting enzyme for 5-HT synthesis. Immunohistochemical controls showed that the resulting bilateral inhibition of TPH2 expression in both the RMg and the LPGi was associated with 5-HT depletion but no change in SERT (as expected of unaltered 5-HT fibers) in the dorsal horn. Using various behavioral tests, I could not detect any change in acute pain sensitivity in 5-HT-depleted rats. In contrast, the increased c-Fos immunohistochemical labeling within the dorsal horn after strong thermal (50°C) or chemical (carrageenan) noxious stimulation showed that 5-HT depletion promotes synaptic sensitization. Even more striking differences between LV-shTPH2 injected rats and paired controls were observed in case of inflammatory (formalin) or neuropathic (sciatic nerve ligation) pain. However, 5-HT depletion-induced changes differed under both conditions since hypoalgesia was noted in case of inflammatory pain, whereas neuropathic pain-evoked hyperalgesia was enhanced in 5-HT depleted, LV-shTPH2-injected rats. Because such opposite modulations might have been underlain by distinct serotoninergic pathways (i.e. from the RMg versus the LPGi for instance) and/or distinct 5-HT receptors, we decided, within the time remaining for achieving my PhD work, to perform a third step, focused on the 5-HT7 receptor type. Using pharmacological approaches, we could obtain data showing that exacerbated hyperalgesia in 5-HT-depleted neuropathic rats resulted from loss of tonic 5-HT7 receptor activation by endogenous 5-HT. Altogether, our data clearly demonstrate that bulbospinal serotoninergic projections are involved in the physiological control of pain signaling at spinal cord level. Further identification of underlying neuronal pathways and receptors might open novel therapeutic perspectives.

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Sabe-se que, na superfície ventrolateral do bulbo, existem pelo menos três regiões relevantes ao controle cardiovascular: região rostroventrolateral (RVL), região caudoventrolateral (CVL) e a área pressora caudal (APC). A região RVL tem importante função na manutenção do tônus vasomotor e a região CVL interfere na regulação da pressão arterial (PA) por modular a atividade da região RVL. Além disso, essas duas regiões participam na interação de reflexos cardiovasculares, que incluem a participação de outra estrutura bulbar (Núcleos do Trato Solitário - NTS) como primeira sinapse de fibras aferentes reflexas. A APC foi recentemente descoberta e interfere na regulação da PA por modular a atividade dos neurônios das regiões RVL e CVL. Desse modo, o presente estudo procurou investigar a participação do NTS (região comissural e intermediária) nas respostas produzidas pela estimulação ou inibição da APC. Foram utilizados ratos Holtzman (280-350 g; n = 6-8) anestesiados com uretana (1,2 g/kg, i.v.). Um cateter foi inserido na artéria e veia femoral desses animais para registro de pressão arterial, freqüência cardíaca e injeção de drogas. Em alguns animais, foi registrada a atividade elétrica do nervo esplâncnico e do nervo frênico. Os animais foram adaptados a um aparelho estereotáxico e submetidos a uma craniotomia parcial para injeções de drogas. Num primeiro grupo experimental, os animais foram submetidos a lesão fictícia ou eletrolítica (1 mA x 10s) do NTS comissural (NTScom). A injeção unilateral do aminoácido excitatório L-glutamato (1 mM - 100 nl) na APC produziu resposta pressora (D = +28 ± 3 mmHg, vs. controle: D = +2 ± 2 mmHg, p<0,05) e taquicárdica (D = +20 ± 1 bpm, vs. controle: D = +3 ± 3 bpm, p<0,05). As respostas pressora e taquicárdica promovidas pela injeção unilateral de L-glutamato na APC foram abolidas 10 (D = +5 ± 7 mmHg e D = +4 ± 3 bpm, respectivamente), 30 (D = +7 ± 3 mmHg e D = +6 ± 3 bpm, respectivamente) e 60 minutos (D = +11 ± 3 mmHg e D = +5 ± 1 bpm, respectivamente) após a lesão eletrolítica do NTScom. Da mesma maneira, no grupo de animais que recebeu a injeção do agonista GABA-A muscimol no NTScom, as respostas pressora e taquicárdica promovidas pela injeção unilateral de L-glutamato na APC foram abolidas 10 (D = +5 ± 5 mmHg e D = +5 ± 3 bpm, respectivamente), 30 (D = +8 ± 5 mmHg e D = +7 ± 2 bpm, respectivamente) e 60 minutos (D = +11 ± 6 mmHg e D = +5 ± 2 bpm, respectivamente) após a injeção de muscimol. Por outro lado, as respostas pressora e taquicárdica promovidas pela injeção unilateral de L-glutamato na APC não foram modificadas 10 (D = +11 ± 2 mmHg e D = +30 ± 12 bpm, respectivamente), 30 (D = +27 ± 4 mmHg e D = +32 ± 15 bpm, respectivamente) e 60 minutos (D = +24 ± 7 mmHg e D = +24 ± 8 bpm, respectivamente) após as injeções bilaterais de muscimol no NTS intermediário. Dessa forma, as repostas de estimulação da APC parecem depender da integridade dos neurônios localizados no NTScom. Sendo assim, será que a integridade da APC é importante para as respostas de estimulação do NTScom? Apenas as injeções bilaterais do agonista GABAérgico muscimol (2 mM - 100 nl) na APC promoveu queda de PAM (D = -18 ± 6 mmHg, p<0,05) e FC (D = - 21 ± 8 bpm, p<0,05). As respostas depressora e bradicárdica promovidas pela injeção unilateral de L-glutamato no NTScom foram abolidas 10 (D = -5 ± 3 mmHg e D = +8 ± 9 bpm, respectivamente), 30 (D = -5 ± 2 mmHg e D = +7 ± 4 bpm, respectivamente) e 60 minutos (D = -6 ± 4 mmHg e D = +10 ± 6 bpm, respectivamente) após as injeções bilaterais de muscimol na APC. Da mesma maneira do ocorrido com as respostas de estimulação da APC, as respostas depressora e bradicárdica promovidas pela injeção unilateral de L-glutamato no NTS intermediário não foram modificadas 10 (D = -41 ± 9 mmHg e D = -67 ± 26 bpm, respectivamente), 30 (D = -31 ± 12 mmHg e D = -23 ± 4 bpm, respectivamente) e 60 minutos (D = -32 ± 8 mmHg e D = -21 ± 3 bpm, respectivamente) após as injeções bilaterais de muscimol na APC. Nossa próxima questão era saber se a inibição da APC promoveria alterações nos reflexos cardiovasculares. A curva do barorreflexo foi construída com injeções endovenosas de uma dose depressora de nitroprussiato de sódio (30 mg/kg) e com a inflação de um balão na aorta torácica. A relação de atividade simpática e PAM (curva do barorreflexo) não revelou nenhum efeito significativo alterado após as injeções bilaterais de muscimol na APC. Após a inibição da APC o barorreflexo continuou operando nos mesmos valores de PAM50 quando comparado ao grupo controle. Os valores de platô superior e inferior, bem como o ganho também não tiveram diferença quando comparados com o grupo controle. A ativação do quimiorreflexo foi realizada com injeções endovenosas de cianeto de sódio (NaCN – 50 mg/kg). A ativação do quimiorreflexo com NaCN produziu resposta pressora (D = +16 ± 4 mmHg, vs. salina D = +2 ± 2 mmHg, p<0,05), aumento da atividade simpática do nervo esplâncnico (D = +236 ± 11% em relação ao controle, p<0,01) e aumento da atividade do nervo frênico. Muscimol injetado bilateralmente na APC promoveu uma redução da resposta pressora (D = +9 ± 2 mmHg, vs. salina D = +18 ± 4 mmHg, p<0,05), da resposta simpatoexcitatória (D = +88 ± 18%, vs. salina D = +217 ± 33 %, p<0,01) e do aumento da atividade do nervo frênico produzido pela ativação dos quimiorreceptores periféricos com NaCN. As aferências dos quimiorreceptores periféricos terminam predominantemente no NTScom. Para corroborar a interação existente entre os neurônios do NTScom e a APC, o próximo experimento foi realizado para testar se os neurônios localizados no NTS ou na APC, ativados por hipóxia, são predominantemente glutamatérgicos ou gabaérgicos. Os animais foram expostos a situações de hipóxia (8% O2, n = 5) ou normóxia (ar ambiente, n = 4). A imunorretividade para a proteína Fos foi utilizada para identificação dos neurônios ativados por hipóxia. Os neurônios glutamatérgicos ou gabaérgicos foram definidos devido à expressão, via hibridzação in situ, de VGLUT2 mRNA ou GAD67 mRNA, respectivamente. A maioria dos neurônios que expressam Fos após hipóxia são glutamatérgicos na região do NTScom (64 ± 13%) e NTS intermediário (41 ± 9%). Na região da APC, dos neurônios que expressam Fos após hipóxia, somente uma pequena parcela (26 ± 9%) são glutamatérgicos. Apenas uma pequena quantidade de neurônios que expressam Fos também expressam GAD67 mRNA na região do NTScom (7 ± 4%), na região do NTS intermediário (16 ± 9%) e na APC (5 ± 3%). A imunorreatividade para a proteína Fos foi praticamente inexistente nos animais que foram expostos ao ar ambiente. Diante disso, os nossos resultados são os primeiros a mostrar a existência da interação entre a região comissural do NTS e a APC no que diz respeito ao controle cardiovascular. Sabe-se que a região do NTScom contém neurônios de segunda ordem que recebem as aferências dos quimiorreceptores periféricos e que as respostas de estimulação do NTScom parecem depender da integridade da APC. Logo, os resultados do presente estudo também mostraram que a inibição da APC foi capaz de reduzir as respostas simpatoexcitatórias e respiratórias após a estimulação dos quimiorreceptores periféricos. Por outro lado, a inibição da APC não foi capaz de reduzir as respostas de ativação do barorreflexo. / Cardiovascular responses are integrated at different levels of the central nervous system (CNS). In the brainstem, there are different areas related to the cardiovascular control. It is well known that in the ventrolateral medulla there are, at least, three important regions involved with cardiovascular control: the rostral ventrolateral medulla (RVLM), the caudal ventrolateral medulla (CVLM) and the caudal pressor area (CPA). The RVLM is the main source of excitatory input to sympathetic preganglionic neurons playing a crucial role for tonic and reflex control of the cardiovascular system. The caudal ventrolateral medulla (CVLM) contains the GABAergic sympathoinhibitory neurons that project to RVLM. Besides these two regions, the NTS is the site of the first synapse of the viscerosensory afferent fibers in the brainstem including those related to cardiovascular and respiratory afferents. Besides the circuitry described above, more recent studies have also shown a new site, the CPA, located in the caudal end of the ventrolateral medulla, which provides excitatory signals that affect sympathetic activity to the cardiovascular system in rats. Therefore, the aim of the present study was to investigate the involvement of the NTS (commissural and/or intermediate regions) on the stimulation or inhibition of the CPA. Male Holtzman rats (280-350 g; n = 6-8) anesthetized with urethane (1.2 g/kg, i.v.) were used. Unilateral microinjection of L-glutamate (1 mM - 100 nL) into the CPA resulted in an increase in mean arterial pressure (MAP, D = +28 ± 3 mmHg, vs. controle: D = +2 ± 2 mmHg, p<0.05) and heart rate (HR, D = +20 ± 1 bpm, vs. controle: D = +3 ± 3 bpm, p<0.05). Electrolytic lesions of the commissural NTS (commNTS) (1 mA x 10s) abolished the pressor and tachycardic responses at 10 (D = +5 ± 7 mmHg and D = +4 ± 3 bpm), 30 (D = +7 ± 3 mmHg and D = +6 ± 3 bpm) and 60 minutes (D = +11 ± 3 mmHg and D = +5 ± 1 bpm) produced by injection of L-glutamate into the CPA. In the same way, muscimol (GABA-A receptor agonist) (2 mM - 60 nL) injected into the commNTS abolished the pressor and tachycardic responses at 10 (D = +5 ± 5 mmHg and D = +5 ± 3 bpm), 30 (D = +8 ± 5 mmHg and D = +7 ± 2 bpm) and 60 minutes (D = +11 ± 6 mmHg and D = +5 ± 2 bpm) produced by injection of L-glutamate into the CPA. On the other hand, the injection of Lglutamate unilaterally into the CPA 10, 30 and 60 minutes after the injection of muscimol into the intermediate NTS produced no change on MAP increase (D = +11± 2, +27 ± 4 and +24 ± 7 mmHg, respectively) and HR (D = +30 ± 12, +32 ± 15 and +24 ± 8 bpm, respectively). It seems that the activation of the CPA depends on the integrity of the commNTS neurons. Does the CPA integrity depend on NTS activation? Bilateral injection of muscimol (GABA-A agonist, 2 mM – 60 nl) into the CPA produced a decrease in MAP (D = -18 ± 2 mmHg, p<0.05) and HR (D = -21 ± 6 bpm, p<0.05). The depressor and bradycardia responses produced by L-glutamate into the commNTS was abolished at 10 (D = -5 ± 3 mmHg and D = +8 ± 9 bpm), 30 (D = -5 ± 2 mmHg and D = +7 ± 4 bpm) and 60 minutes (D = -6 ± 4 mmHg and D = +10 ± 6 bpm) after muscimol injection into the CPA. On the other hand, the depressor and bradicardic responses produced by L-glutamate into the intermediate NTS was not changed at 10 (D = -41 ± 9 mmHg and D = -67 ± 26 bpm), 30 (D = -31 ± 12 mmHg and D = -23 ± 4 bpm) and 60 minutes (D = -32 ± 8 mmHg and D = -21 ± 3 bpm) after muscimol injection into the CPA. Our next question was to know if the inhibition of the CPA will change the cardiovascular reflexes. Baroreflex curves were generated by lowering MAP with sodium nitroprusside (30 mg/kg) and increasing MAP by constricting an abdominal aortic snare. The relationship between MAP and sympathetic nerve discharge (SND) (baroreflex curves) revealed no change after muscimol injection into the CPA. After inhibition of the CPA, the baroreflex operated around a comparable MAP (MAP50) in all groups of rats. The lower and upper plateau, as well the baroreflex range was not different from the control group. The chemoreflex was actvated by i.v. injections of sodium cyanide (NaCN – 50 mg/kg). The activation of chemoreflex with NaCN produced a rise in MAP (D = +16 ± 4 mmHg, vs. saline D = +2 ± 2 mmHg, p<0.05), an increase in SND (D = +236 ± 11% of resting, p<0.01) and an increase in phrenic nerve discharge (PND). Muscimol injection into the CPA reduced the pressor (D = +9 ± 2 mmHg, vs. saline D = +18 ± 4 mmHg, p<0.05), sympathoexcitatory (D = +88 ± 18%, vs. saline D = +217 ± 33 %, p<0.01) and the increase in PND produced by chemoreflex activation with NaCN. Carotid chemoreceptor afferents terminate predominantly in commNTS. The next experiment was designed to test and to confirm the interaction between the commNTS and the CPA neurons by anatomical approaches. We tested whether glutamatergic or GABAergic. The rats were exposed to hypoxia (8% O2, n = 5) or to normal air (n = 4). Fos-immunoreactivity was used to identify commNTS neurons that were activated by hypoxia. NTS or CPA neurons were classified as glutamatergic or GABAergic based on whether they contained VGLUT2 mRNA or GAD67 mRNA. The vast majority of the commNTS (64 ± 13%), intermediate NTS (41 ± 9%) and CPA (26 ± 9%) neurons that were immunoreactive for Fos contained VGLUT2 mRNA, whereas only a small proportion of the same class of neurons contained GAD-67 mRNA (commNTS: 7 ± 4%; intermediate NTS: 16 ± 9% and CPA: 5 ± 3%). Therefore, our results are the first to show the existence of an interaction between the commNTS and CPA in terms of cardiovascular control. However we know that commNTS neurons receive inputs from peripheral chemoreceptors and the stimulation of commNTS depends on CPA integrity. These data suggest that CPA contributes to resting MAP, sSND and to the sympathoexcitatory effect during stimulation of peripheral chemoreceptors. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações