Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2008

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Tese de doutoramento. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2005

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos. / Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.

La holoenzima proteína quinasa A (PKA) es un tetrámero que consiste en dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, se encuentra en forma ubicua fosforilando un gran número de proteínas celulares y participa en la regulación de vías metabólicas y otros procesos (transporte de membrana, motilidad celular, expresión génica, apoptosis, aprendizaje y memoria). Las proteínas quinasas no solamente se encuentran en el interior de las células, sino además se observa la "exportación" hacia la superficie de la cara externa de la membrana plasmática de las células (Redegeld, F.A et al., 1999). Este fenómeno de exportación de las proteína quinasas hacia la superficie de la cara externa de las células en cultivo se denomina "ectoquinasas." El objetivo del presente trabajo es estudiar la exportación de la proteína quinasa dependiente del AMPc sobrexpresada en células humanas en cultivo a nivel intracelular o endógeno, a nivel ectópico o en la membrana plasmática, y libre en el líquido extracelular o proteína exógeno. En la presente Tesis se utilizó dos líneas celulares llamadas HEK293T y HELA, realizándose la técnica de transfección por lipofectamina para introducir en estas células la proteína PKA, específicamente el vector (pcDNA3-HA) con el inserto que contiene el gen de la subunidad catalítica con el epítope anti-HA.

Es una guía de prácticas de laboratorio del curso de Biología General (MA155) que corresponde al ciclo 2014-2. Este curso es una asignatura destinada al estudio de la célula, los componentes celulares, la fisiología y su relación con el medio ambiente.

Trabalhos recentes na literatura demonstraram que proteínas do citoesqueleto, mais especificamente os microfilamentos de actina, estão correlacionadas com a promoção e manutenção do estresse oxidativo, bem como modulação de processos mitocondriais. Trabalhos do nosso grupo caracterizaram que o tratamento com retinol (vitamina A) em células de Sertoli cultivadas era capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, com conseqüente promoção de estresse oxidativo. Radicais livres produzidos pelo tratamento com retinol, também foram capazes de induzir uma transformação pré-neoplásica, modulação de eventos recombinatórios, modulação de enzimas envolvidas na divisão celular como ornitina decarboxilase (ODC), progressão de ciclo celular e apoptose. O tratamento com retinol também foi capaz de, por uma via radical livre dependente, induzir a divisão de células de Sertoli terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, com a conseqüente formação de focos proliferativos. Uma vez que o citoesqueleto participa de muitos dos processos relatados (proliferação, transformação e apoptose), e trabalhos recentes na literatura correlacionam estresse oxidativo com proteínas do citoesqueleto, nós decidimos avaliar a influencia do citoesqueleto e suas proteínas na produção e manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. O primeiro capítulo dessa dissertação caracteriza uma modulação radical livre dependente do citoesqueleto das células de Sertoli tratadas com retinol, onde uma proteção/adaptação do citoesqueleto foi observada frente ao ambiente pró oxidativo gerado pelo retinol. Neste primeiro capítulo nós também sugerimos que a adaptação observada poderia ser relacionada com um possível papel de condução de elétrons pelos filamentos de actina. O segundo capítulo dessa dissertação demonstra uma dependência da correta organização dos filamentos de actina para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. Juntamente, o segundo capítulo apresenta uma explicação para a teoria de condução de elétrons pelos filamentos de actina, onde é descrito como esse fenômeno poderia ocorrer. Os resultados apresentados nessa dissertação sugerem que os microfilamentos de actina são essenciais para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol, e que essa dependência pode ser explicada por uma nova função fisiológica de biocondutor de elétrons. / Recent works presented in the literature have shown that cytoskeleton proteins, specifically actin microfilaments, are correlated with promotion and maintenance of oxidative stress, and mitocondrial functions modulations. Works of our research group have characterized that retinol treatment in cultived Sertoli cells was able to induce reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity imbalance, resulting in oxidative stress production. Free radicals produced by retinol treatment, were also able to induce pre neoplasic transformation, modulation of recombinatory events, modulation of enzymes involved in cell division such as ornitina decarboxilase (ODC), cell cycle progression and apoptosis. Retinol treatment was also able by a free radical-dependent way, induce the division of terminate differentiated and non proliferative Sertoli cells, resulting in proliferative focus formation. Once cytoskeleton participates of many of the related process (proliferation, transformation and apoptosis), and recent works presented in the literature correlated oxidative stress with cytoskeleton proteins, we decided evaluated the cytoskeleton influence in the production and maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. The first chapter presented in this manuscript characterizes a cytoskeleton modulation free radical-dependent in the Sertoli cells treated with retinol, where a cytoskeleton adaptation/protection was observed in response to a pro oxidative environment produced by retinol. In this first chapter we also suggested that the adaptation observed could be related with a possible function of electrons conductions through actin microfilaments. The second chapter of this manuscript shows an actin microfilaments dependence to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. Together, the second chapter shows an explanation of the electron conduction theory through actin microfilaments, where a description of the electron conduction process is presented. The results presented in this manuscript suggest that actin microfilaments are essential to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment, and that this dependence could be explained by a new physiologic function of electron bioconductor.

Células a combustível são considerados dispositivos para geração de energia limpa, já que usam hidrogênio como combustível, sendo o produto da reação, energia elétrica, água e calor. Além disso, algumas células de combustível operam a baixas temperaturas; tratando-se deste caso, um dos maiores desafios relacionado à transferência da tecnologia é o desenvolvimento das membranas. Nesse sentido, desenvolveu-se um sistema umidificador e separador de CO2 para aplicação em um protótipo de célula a combustível de membrana alcalina baseada em celulose. Os dois principais problemas desse tipo de célula quando operam com ar são: i) o envenenamento da célula pelo CO2 presente no ar, e ii) a desidratação da membrana celulósica que suporta a solução aquosa de KOH (eletrólito). O objetivo desse trabalho foi desenvolver um sistema para resolver esses dois problemas. Dessa forma, testou-se uma possível configuração de umidificador capaz de absorver o CO2 do ar. O desempenho da célula a combustível alcalina foi avaliado a partir de curvas de polarização e curvas de potência. A separação do CO2 mostrou-se necessária desde a primeira fase de operação da célula, a qual apresentou efeitos do envenenamento por CO2 desde o início da operação. O efeito do umidificador também pode ser observado ao longo do tempo de funcionamento da célula, quando a membrana começou a sofrer desidratação dificultando a mobilidade dos íons OH-. De um modo geral, o sistema proposto no presente estudo mostrou-se promissor tendo sido observado um aumento no desempenho na ordem de 100%, comparativamente ao protótipo sem o umidificador e separador de CO2. / Fuel cells are held as devices for clean energy generation, since they use hydrogen as fuel, generating electricity, water and heat. Furthermore, some fuel cells operate at low temperatures, where one of the greatest challenges is the development of membranes. In this context, this study has developed a humidifier system and CO2 separator for use in a cellulose based prototype of an alkaline membrane fuel cell. The two main problems with this type of cell when operating in air are: i) the cell poisoning by the CO2 present in the air, and ii) dehydration of the cellulosic membrane that supports the aqueous KOH solution (electrolyte). The objective of this study was to develop a system that solves these two problems. Thus, it was tested a possible configuration of humidifier which could be capable of absorbing the CO2 present in the air. The performance of the alkaline fuel cell was evaluated from polarization curves and power curves. The CO2 separation proved to be necessary from the beginning of the cell operation, which showed effects of CO2 poisoning still in the early operating stages. The effect of the humidifier can also be observed over time during the cell operation, whereupon the membrane began to undergo dehydration hindering the mobility of the OH- ions. Generally the system proposed in the present study has shown itself as promising, since it showed a performance increase of approximately 100% when compared to the prototype without CO2 separator and humidifier.