A mesura que l'esperança de vida augmenta, augmenta la incidència i prevalença dels malalts grans amb càncer. El càncer de pulmó està associat amb l'edat(1). Malgrat que quasi la meitat dels nous casos es donen en gent gran, baix és el percentatge de malalts grans inclòs en assaig clínic(2). La principal característica de l'envelliment és la seva heterogeneïtat. Per identificar millor el malalt gran, la geriatria ha desenvolupat eines d'aproximació a la població gran. Aquestes s'anomenen avaluació geriàtrica global(CGA). La CGA contribueix amb l'oncologia aportant informació addicional, que permet estratificar els malalts en funció del seu risc de deteriorament funcional front a situacions d'estrès, com ara una neoplàsia(2). Detecta aquells malalts que es beneficiarien d'una intervenció geriàtrica prèvia a una intervenció/tractament oncològic(2-4). L'ús de la CGA en oncologia és molt limitat. Per tal de descriure la població gran amb càncer de pulmó de la nostra consulta, apliquem de manera prospectiva instruments d'avaluació geriàtrica. L'objectiu del treball va ser la implementació d'aquestes eines en la pràctica diària. Es tracta d'un estudi epidemiològic descriptiu del malalt gran amb càncer de pulmó del Departament 14.Resultats: de Gener de 2006 a Febrer del 2008, 83 malalts van ser avaluats prospectivament. El 97,6% eren homes, amb una mitjana d'edat de 77 anys (70-91). El 96,4% tenien història de tabaquisme; 72,5% exfumadors. La relació entre hàbit tabàquic i supervivència va mostrar tendència a la significació estadística. El tabaquisme es va relacionar significativament amb la histologia. Un 21,7% tenien antecedents d'altres neoplàsies i forta història de tabaquisme a la família. L'estadi es va relacionar amb la supervivència. El 61,3% tenien histologia epidermoide, relacionada significativament amb la supervivència. 84% estaven simptomàtics al diagnòstic. Alguns dels símptomes es van relacionar amb la supervivència. El 70% presentaven PS 0-1 al diagnòstic, associat significativament amb la supervivència. Pel que fa a les variables geriàtriques, els malalts van presentar un ampli espectre de dependències en ADL i IADL. El 51,8% eren independents per ADL mentre sòls el 30,1% ho era per IADL. Destaca comorbiditat elevada, no relacionada amb la supervivència. El 26,4% tenien criteris de demència i 31,3% de depressió. El 41,4% pèrdua de pes al diagnòstic i 34,9% albúmina baixa. Els malalts presentaven un fort recolzament social, per part de la família. Un 48,2% tenia algun síndrome geriàtric i el 72,3% complia criteris de fragilitat. Respecte la informació, el 73,5% dels malalts sol·licitava informació activa. Un 56,6% acceptaria com a objectiu del tractament l'augment de la supervivència. En el moment de l'anàlisi, el 70,1% dels malalts havien mort. La supervivència global fou de 326 dies. La principal causa de mort fou la progressió tumoral. Els factors relacionats amb la supervivència foren principalment els tumorals: estadi (p<0,001), PS (p:0,0003), histologia escamós (p:0,003), alguns símptomes al diagnòstic (pèrdua de pes; astènia, anorèxia, dolor) (p<0,05). Alguns dels paràmetres geriàtrics es van relacionar significativament amb la supervivència: IADL (p<0,001), demència (p:0,02), depressió (p:0,0006), deliri (p:0,04) incontinència (p:0,04). Els criteris de fragilitat o la comorbiditat no es van relacionar amb la supervivència. Cap d'aquests paràmetres estava relacionat de manera significativa amb l'edat. L'edat no es va relacionar amb la supervivència.Conclusions: l'aplicació d'una aproximació geriàtrica és factible en la pràctica diària. Aquesta, aporta informació addicional, no detectada per l'avaluació oncològica. Tot i que alguns paràmetres de l'envelliment es van relacionar amb pitjor supervivència; el mal pronòstic del càncer de pulmó va ser superior al pronòstic intrínsec a l'envelliment. La principal causa de mort en el malalt gran amb càncer de pulmó del nostre treball fou la tumoral. La col·laboració conjunta de la geriatria i l'oncologia ens ha d'ajudar a optimitzar la balança risc/benefici en el tractament d'aquesta població heterogènia. / As a result of an increasing life expectancy, incidence and prevalence of elderly cancer patients rises. Lung cancer is one of the most elderly related neoplasms. Despite almost 50% of new diagnoses of lung cancer occur in the elderly; elderly are underrepresented at clinical trials. Aging is a highly individualized process and all the changes that occur cannot be predicted on the basis of chronological age. A much more thorough method, such a comprehensive geriatric assessment (CGA), has been developed by geriatricians to be used when evaluating elderly cancer patients. The CGA has the ability to detect health problems in elderly patients, helping oncologist. It can identify patients that potentially benefit from an extensive evaluation. CGA use in oncology is limited; the best form of CGA for cancer patients remains to be defined. To describe oncology and geriatric profile of elderly lung cancer patients, we prospectively applied an evaluation form. The ultimate goal was to know if the application was feasible in an oncology outpatient unit. This is an epidemiologyc descriptive study of elderly lung cancer patients at Department 14.Results: Between January 2006 and February 2008, 83 patients > 70 years of age underwent prospectively assessment in our Department. 81 patients (97.6%) males. Median age 77 years (range 70-91). 96.4% had smoking history; 72.5% ex-smokers. Neither smoking habit (former versus exsmoker versus nonsmoker) was correlated with survival. 18 patients (21.7%) had a previous diagnosis of neoplastic disease. Staging: 19 patients (22.9%) had localized disease, 34 had regional spreading (41%) and 43 (36.1%) disseminated stage. The stage at diagnosis significantly correlated with survival (logrank p<0.001). 61.3% had squamous histologic type; significantly related with survival. 84% were symptomatic at diagnosis; some symptoms were related to survival. 70% had PS 0-1 at diagnosis; significantly correlated with survival. Roughly half of the patients (40; 48.2%) had ADL and 58 (69.9%) had IADL dependency. High comorbidity index, measured by Charlson and SCS scores weren't related to survival. Cognitive deficits were found in 22 (26.4%) patients and 26 (31.3%) had depression. An unintentional weight loss of more than 8.2% (range 1-21%) total body weight over the previous three months (range 1-8 months) was reported by 37 patients (44.6%). Mean albuminemia was 2.6 g/dl (range 2-5.9 g/dl). Albuminemia levels were below normal reference limits in 35% of patients. Almost all patients reported social support (98.8%) by family members. At least one geriatric syndrome was found in 40 (48.2%) patients. 72.3% had frailty criteria. 73.5% wanted to have diagnosis information. 56.6% if treated, shown their desire of improve survival.At the end of the study (December 2008), 59 patients had died (70.1%). Mean survival was 326 days (10.8 months; CI 95% 259-393). The main cause of death was lung cancer disease progression (69.5%, 57 patients), with 20 patients (25%) dying of other non-neoplastic causes. Neoplasic factors related to survival were: stage (p<0.001), PS (p:0.0003), squamous histologic type (p:0.003), some symptoms (weight loss , astenia, anorexia, pain) (p<0.05). some geriatric items were related to survival: IADL (p<0.001), cognitive deficit (p:0.02), depression (p:0.0006), delirium (p:0.04), incontinence (p:0.04). Items related to survival weren't related to age. Conclusions: A geriatric assessment could be applied to elderly lung cancer patients attended at an outpatient oncology department. Although most of the patients are frail, it seems that lung cancer prognosis is superior than aging factors. We have applied CGA and it seems that aging does not worsen the prognosis of lung cancer, except for certain aging-related parameters. Only by working together (medical oncologists, geriatrists) can we hope to offer a quality assistance in this increasing population.

La punció aspirativa guiada per ultrasonografia endobronquial (PA-USEB) ha demostrat ser per a l’estadiatge del càncer de pulmó. L’objectiu d’aquesta tesi és estudiar la utilitat d’aquesta tècnica no només en l’estadiatge del càncer de pulmó, sinó també com a eina de diagnòstic inicial en pacients amb ocupació mediastínica, i també la possibilitat de detecció mutacions de l’epidermal growth factor receptor (EGFR) en mostres obtingudes mitjançant aquesta tècnica en pacients amb adenocarcinoma de pulmó, o carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP). També es va investigar la seguretat de la tècnica, I la disminució de mediastinoscòpies que comportava la seva utilització. Aquesta tesi es base en tres treballs, que són: - Garcia-Olivé I, Monsó E, Andreo F, et al. Sensitivity of linear endobronchial ultrasonography and guided transbronchial needle aspiration for the identification of nodal metastasis in lung cancer staging. Ultrasound in Medicine and Biology 2009;35:1271-77. - Garcia-Olivé I, Valverde EX, Andreo F et al. La ultrasonografía endobronquial lineal como instrumento de diagnóstico inicial en el paciente con ocupación mediastínica. Arch Bronconeumol 2009;45:266-70. - Garcia-Olivé I, Monsó E, F Andreo F, et al. Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for identifying EGFR mutations. Eur Resp J 2010;35:391-5. La finalitat del primer estudi va ser determinar la sensibilitat de la PA-USEB en l’estadiatge del càncer de pulmó. Es varen mesurar els diàmetres major i menor durant els procediments en aquells pacients que havien estat remesos per a estadificació, i es va determinar la sensibilitat de la USEB per a la detecció de malignitat als ganglis. Es varen realitzar 315 puncions ganglionars en 161 pacients, i en 87 d’aquests pacients es va confirmar metàstasis a N2/N3, amb la qual cosa es va fer innecessària la pràctica d’una mediastinoscòpia. La mediana dels diàmetres menors (rang interquartílic) dels ganglis mediastínics i hiliars va ser, respectivament d’11 (8-15) i 8 (7-12) mm. La punció va proporcionar mostres satisfactòries en 269 ganglis (85.4%), i es va assolir una sensibilitat del 100% per a la identificació de ganglis malignes en la citologia de la punció (agafant com a referència el resultat de la citologia de la punció) per a aquells ganglis amb diàmetre menor de més de 5 mm i aquells amb un quocient diàmetre menor/diàmetre major per sobre de 0.5. La probabilitat que un gangli fos maligne era superior al 90% per ganglis amb un diàmetre menor de més de 20 mm, i del 55% per a ganglis rodons (quocient d’1). En 18 dels 50 pacients amb mediastí normal a la TC, la ultrasonografia endobronquial va identificar ganglis augmentats de mida (36%), especialment a regió subcarinal, i la punció en va confirmar la malignitat en 5 (10%). La PA-USEB obté mostres ganglionars satisfactòries en gairebé el 90% dels casos i millora la identificació de ganglis augmentats de tamany en pacients en què la TC mostra un mediastí normal. Si s’agafa com a patró de referència el resultat de la citologia de la punció, el fet de tenir un diàmetre menor ≥ 5 mm i un quocient ≥ 0.5 detecta la malignitat d’un gangli amb una sensibilitat del 100%. L’objectiu del segon treball va ser determinar la utilitat de la tècnica com a instrument diagnòstic en el pacient amb ocupació mediastínica de causa desconeguda després d’obtenir mostres amb exploracions no invasives i amb broncoscòpia amb llum blanca. Es varen incloure a l’estudi tots els pacients explorats per PA guiada per USEB lineal per al diagnòstic de massa i/o adenopatia/es mediastinica/ques. Es consideraren diagnòstics finals aquells obtinguts amb PA guiada per USEB lineal i els assolits amb qualsevol altra tècnica quirúrgica realitzada posteriorment a la USEB, quan aquesta no havia estat diagnòstica. Es varen estudiar 128 pacients (edat mitja ± desviació estàndard: 62.0 ± 11.2 anys) als quals es va realitzar 294 PA sobre 12 masses i 282 ganglis. A les masses mediastíniques es varen obtenir mostres valorables en 11 casos (91.7%) i als ganglis, en 233 casos (82.6%). La PA dirigida per USEB lineal va ser l’eina diagnòstica i va evitar la mediastinoscòpia en 115 pacients (sensibilitat diagnòstica: 89.8%). La tècnica va confirmar el diagnòstic en 85 dels 94% amb neoplàsia (90.4%), en 8 dels 10 amb tuberculosi (80.0%), i als 5 amb sarcoïdosi (100%). La PA guiada per USEB lineal és una eina de diagnòstic útil en els pacients amb afectació mediastínica, el diagnòstic anatomopatològic dels quals no s’assoleix mitjançant exploracions no invasives ni broncoscòpia amb llum blanca. Al tercer treball es va estudiar la utilitat de la USEB per obtenir mostres de ganglis malignes en les quals es pogués detectar mutacions de l’EGFR. Es varen incloure tots aquells pacients amb adenocarcinoma pulmonar o CPCNP remesos per a estadificació mitjançant USEB. Es varen prendre mostres de tots aquells ganglis amb diàmetre menor de més de 5 mm, i es va obtenir DNA genòmic de cèl·lules tumorals per a analitzar els exons 19 i 21. Es va estudiar l’impacte dels resultats en el maneig del pacient. L’anàlisi del gen de l’EGFR en mostres obtingudes per PTB-USEB va ser possible en 26 (72.2%) dels 36 pacients amb metàstasis ganglionars mediastíniques. Es varen detectar mutacions somàtiques del gen de l’EGFR en teixit obtingut per USEB en 2 (10%) dels 20 pacients amb adenocarcinoma pulmonar metastàtic. Les mostres de teixit maligne obtingudes per USEB dels pacients amb metàstasis ganglionars de CPCNP són útils per a la detecció de mutacions de l’EGFR en la majoria dels casos, i aquesta tècnica evidencia la presència de cèl·lules neoplàsiques mutades en una desena part dels pacients amb adenocarcinoma, als qual no va caldre fer-los una mediastinoscòpia No varen haver-hi complicacions derivades de la tècnica durant la realització de la mateixa o en les 48 hores posteriors en cap dels pacients inclosos als estudis. Com a conclusions, la PA-USEB ha demostrat ser útil i segura a l’hora d’estudiar masses i ganglis mediastínics i/o hiliars en pacients amb càncer de pulmó, fins i tot els que tenen TC normal. També pot ser útil com a eina diagnòstica en pacients amb afectació mediastínica sense diagnòstic. També permet obtenir mostres en què és possible detectar mutacions del gen de l’EGFR en pacients amb CPCNP. / Linear endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration (EBUS-TBNA) has proven useful for staging lung cancer. The objective of this thesis is to assess the usefulness of this technique not only in lung cancer staging but also as a diagnostic tool in patients with mediastinal disease, and the possibility of detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in samples obtained through this technique in patients with lung adenocarcinoma or non small cell lung cancer (NSCLC). The safety of the technique and the decrease in the need for mediastinoscopy were also assessed. This thesis is based on three studies, which are: - Garcia-Olivé I, Monsó E, Andreo F, et al. Sensitivity of linear endobronchial ultrasonography and guided transbronchial needle aspiration for the identification of nodal metastasis in lung cancer staging. Ultrasound in Medicine and Biology 2009;35:1271-77. - Garcia-Olivé I, Valverde EX, Andreo F et al. La ultrasonografía endobronquial lineal como instrumento de diagnóstico inicial en el paciente con ocupación mediastínica. Arch Bronconeumol 2009;45:266-70. - Garcia-Olivé I, Monsó E, F Andreo F, et al. Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for identifying EGFR mutations. Eur Resp J 2010;35:391-5. The aim of the first study was to determine the sensitivity of EBUS-TBNA in lung cancer staging. Short- and long-axis node diameters were measured during EBUS in patients referred for lung cancer staging and sensitivities for the identification of nodal malignancy at TBNA determined. Three hundred fifteen real-time EBUS-guided TBNA nodal sampling procedures were performed in 161 patients and in 87 of them, N2/N3 metastasis was confirmed (50.9%), eliminating the need for mediastinoscopy. The median (interquartile range [IQR]) short-axis diameters of the sampled mediastinal and lobar nodes were 11 (8–15) and 8 (7–12) mm, respectively. TBNA provided satisfactory samples from 269 nodes (85.4%) and a sensitivity of 100% for the identification of malignant TBNA samples was reached for a short-axis diameter cut-off of 5mmand a short- to long-axis ratio of 0.5. The probability of malignancy was over 90% for nodes with a short-axis diameter .20 mm and 55% for round nodes (short- to long-axis ratio of 1). In 18 out of 50 patients with a normal mediastinal computed tomography (CT) scan, EBUS identified enlarged nodes in the mediastinum (36%), mainly in the subcarinal region and confirmed mediastinal malignancy in 5 (10%). Real-time EBUS-guided TBNA obtains satisfactory node samples in almost 90% of cases and improves the identification of enlarged nodes in patients with a normal mediastinum at CT. If sampling all nodes with a short-axis diameter of >5 mm and a short- to long-axis ratio >0.5, a sensitivity of 100% for the cytological identification of malignant nodes can be expected. The aim of the second study was to assess the usefulness of this diagnostic tool in patients with indications of mediastinal disease that could not be diagnosed by non invasive methods or white light bronchoscopy. All patients undergoing linear EBUS for the diagnosis of mediastinal masses and/or adenopathy at our endoscopy unit were included in the study. Diagnoses obtained by linear EBUS or any surgical technique performed alter a non diagnostic EBUS were considered as final. In the study population of 128 patients with a mean (SD) age of 62.0 (11.2) years, a total of 294 TBNAs were performed on 12 masses and 282 nodes. Satisfactory samples were obtained in 11cases (91.7%) from masses and in 233 cases (82.6%) from nodes. Linear EBUS was diagnostic, obviating the need for mediastinoscopy in 115 patients (diagnostic sensitivity, 89.8%). The technique confirmed the diagnosis in 85 of the 94 patients with cancer (90.4%), in 8 of the 10 patients with tuberculosis (80.0%), and in the 5 patients with sarcoidosis. The usefulness EBUS for the detection of EGFR mutations in cells recovered from malignant mediastinal nodes in patients with NSCLC was assessed in the third article. All patients with lung adenocarcinoma or NSCLC referred for staging with EBUS were included. Nodes with a short-axis diameter of 5 mm were sampled, and genomic DNA from metastatic tumour cells was obtained for analysis of exons 19 and 21. The impact of sampling on management was assessed. EGFR gene analysis of the EBUS-TBNA sample was feasible in 26 (72.2%) out of the 36 patients with lymph node metastasis. Somatic mutations of the EGFR gene were detected in tissue obtained through EBUS-TBNA in two (10%) out of 20 patients with metastasic lung adenocarcinoma, eliminating the need for mediastinoscopy in these patients. Malignant tissue samples obtained by EBUS-TBNA from patients with nodal metastasis of NSCLC are suitable for the detection of EGFR mutations in most cases, and this technique demonstrates mutated neoplastic cells in a tenth of patients with adenocarcinoma. No complications related to the procedure developed during its performance or in the following 48 hours in any of the patients included in any of the three studies. To conclude, EBUS-TBNA has shown to be useful and safe in detecting metastatic mediastinal and/or hilar lymph nodes in patients with lung cancer, even in those with radiologically normal mediastinum. It can also be useful as a diagnostic tool in other mediastinal diseases. It is possible to detect EGFR gene mutations in samples obtained with this technique from patients with NSCLC.

1) Hipòtesi El càncer de pulmó és la neoplàsia més freqüent en el moment actual i és la primera causa de mort per càncer en el món. Aproximadament el 85 % dels pacients presenten CPCNP. Inclús els casos identificats en estadis precoços i en què es pot realitzar un tractament quirúrgic curatiu, tenen un risc de recaiguda global del 60%. A pesar dels avenços en el tractament de la malaltia realitzats durant els darrers anys, la supervivència global continua essent molt baixa, al voltant del 15 % als 5 anys. És per aquest motiu que es fa necessària la troballa de biomarcadors que puguin predir el risc de recaiguda, una vegada realitzada la resecció quirúrgica. Aquests biomarcadors ens permetrien estratificar els pacients pel seu risc i individualitzar el seguiment i el tractament de la malaltia, especialment en els pacients en estadi I que no reben cap tractament adjuvant. La majoria de pacients amb CPNCP són fumadors i durant els últims anys s’ha observat que variants polimòrfiques d’enzims relacionats amb la metabolització de carcinògens del tabac, en gens de reparació del DNA o en gens relacionats amb l’expulsió de carcinògens de la cèl•lula s’han associat a un risc augmentat de càncer de pulmó. No obstant, l’impacte d’aquests SNPs en la recaiguda del CPCNP no ha estat establert. Si tenim en compte que els SNPs són característiques innates dels individus, podríem pensar que la seva presència podria tenir un efecte també en la recaiguda de pacients fumadors que han desenvolupat un càncer de pulmó, ja que les diferencies genotípiques es podrien traduir en diferències en el procés de malignització mediat pel tabac. Aquests SNPs doncs podrien seleccionar-nos individus que han tingut un risc incrementat de càncer de pulmó i que, una vegada realitzat un tractament local quirúrgic, podrien tenir un risc augmentat de recidivar. Per altre banda recentment els miRNAs han esdevingut com a elements claus en el procés de carcinogènesi. Els miRNAs són molècules que controlen la diferenciació i el creixement cel•lular i en diferents tipus tumorals s’associen a l’evolució de la malaltia. Polimorfismes en gens relacionats amb miRNAs implicats en càncer o en els propis miRNAs poden jugar un paper en la progressió tumoral. Més concretament, polimorfismes en gens de la via de processament dels miRNAs o en la seqüència del pri-miRNA o pre-miRNA poden afectar als nivells finals de determinats miRNAs. A més, polimorfismes en les seqüències d’anclatge de miRNAs poden reprimir la inhibició dels gens diana per aquests i per tant, afectar la seva funció. En definitiva, polimorfismes relacionats amb els miRNAs podrien modificar el risc de recaiguda després de la cirurgia en pacients amb CPCNP. Basant-nos en aquestes hipòtesis ens plantegem els següents objectius: 2) Objectiu general Trobar biomarcadors de recaiguda i supervivència global en pacients quirúrgics de CPCNP basant-nos en l’estudi de les variants polimòrfiques del DNA. 3) Objectius específics 1. Analitzar, en una sèrie retrospectiva de pacients amb CPCNP quirúrgics, polimorfismes en gens relacionats amb el metabolisme del tabac (fase I i fase II), gens de reparació del DNA i en el gen MDR1/ABCB1 en pacients amb hàbit tabàquic. 2. Analitzar polimorfismes presents en regions del DNA codificants per miRNAs relacionats amb proliferació, apoptosi, angiogènesi i cicle cel•lular en una sèrie retrospectiva de pacients amb CPCNP quirúrgics. 3. Analitzar polimorfismes presents en els gens que intervenen en el procés de maduració dels miRNAs en una sèrie retrospectiva de pacients amb CPCNP quirúrgics. 4. Analitzar polimorfismes localitzats al lloc d’anclatge del miRNA al mRNA en una sèrie retrospectiva de pacients amb CPCNP quirúrgics. 5. Establir si existeix relació entre els diferents genotips i el temps a la recaiguda o la supervivència global.

Introducció: El carcinoma de pulmó és un dels problemes de salut prioritari de la societat actual, amb una major presència en homes entre els 55 i 65 anys. És una neoplàsia molt agressiva i malgrat els esforços de crear noves teràpies de QT amb diferents combinacions de fàrmacs, o RT i QT conjuntament, s'han millorat poc les taxes de supervivència d'aquesta malaltia. Sabem, per altre banda, que el cicle cel·lular amb les seves diferents fases són objecte d'una regulació bioquímica molt complexa. En aquesta tesi ens vam centrar en l'estudi d'unes quantes proteïnes implicades en el cicle (PCNA, Ki-67, p53, ciclines D1 i E) i veure quin paper tenien. Objectius de la tesi: 1) Determinar mitjançant tècniques de citometria de flux (CMF) l'índex de DNA, la fase S i el percentatge de cèl·lules PCNA positives i també el grau d'heterogeneïtat per a cadascuna en el carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPNCP), tant en els tumors primaris com en les seves metàstasis ganglionars. 2) Investigar si existeix un patró o patrons d'índexs de DNA i/o de fase S i/o de percentatge de PCNA relacionables amb el fenomen metastàtic. 3) Determinar l'expressió de l'antígen de proliferació cel·lular PCNA a les diferents fases del cicle cel·lular i avaluar si hi ha alguna relació estadística amb altres paràmetres estudiats. 4) Quantificar per mitja de tècniques d'immunohistoquímica el grau d'expressió de marcadors de proliferació cel·lular (PCNA, Ki-67), els reguladors negatius (p53) i les ciclines (D i E). 5) Avaluar les possibles relacions entre les variables següents: clíniques, anatomopatològiques, variables de CMF i variables immunohistoquímiques. 6) Analitzar estadísticament les variables que puguin ser valorades com a factor pronòstic independent. Material i mètodes: Es varen seleccionar 99 mostres de CPCNP entre 1993-1997, 89 homes i 10 dones. Es van recollir 4 tipus de dades diferents i per separat, per garantir l'objectivitat en l'obtenció de les variables. dades clíniques, anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de citometria de flux. Les dades clíniques es van recollir per calcular la supervivència lliure i la global de la malaltia. Les dades anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de CMF s'obtingueren de les anàlisis de les recessions quirúrgiques remeses al laboratori durant la intervenció dels malalts. Cada mostra fou dividida en dues parts: una per a CMF per l'estudi del cicle cel·lular i expressió de l'antígen PCNA a les diferents fases del cicle i l'altre per a l'estudi histològic rutinari i per l'anàlisi amb tècniques d'immunohistoquímica. Resultats: Un 70% dels adenocarcinomes es van diagnosticar a l'estadi IIIA. Ki-67, PCNA i ciclina E estaven relacionades amb el tipus histològic de carcinoma indiferenciat de cèl·lula gran (CICG). La ciclina E també estava relacionada amb el CE. La ciclina D1 amb el grau de diferenciació. PCNA i ciclina E també estaven relacionades significativament amb Ki-67. A l'anàlisi univariable en relació amb la supervivència global de la malaltia, l'estadi, CV de l'íDNA i de la fase S assoleixen la significació estadística, com a variables relacionades amb l'evolució de la malaltia. Finalment a l'anàlisi multivariable per la supervivència global de la malaltia, l'estadi i el CV de la fase S assoleixen un valor pronòstic independent. Conclusions: Hi ha una relació directa entre l'estadi i la supervivència global dels malalts. Les variables determinades per immunohistoquímica no tenen implicacions pronostiques. Hi ha una relació entre el CICG i l'expressió augmentada de marcadors de proliferació. La sobreexpressió de ciclina D1 es relaciona directament amb els CPNCP pobrament diferenciats. La fase S es relaciona amb l'expressió augmentada del PCNA per CMF. L'heterogeneïtat en l'expressió del PCNA per CMF es relaciona amb el grau d'heterogeneïtat de l'íDNA i fase S. / Introduction: Lung carcinoma is one of the priority health problems in our society. It shows mainly in men from 55 to 65 years. Is a very aggressive neoplasm and in spite of the efforts done in chemotherapy or combined with radiotherapy, the survival rate has not improved much. On the other hand, we know that the cellular cycle with its different phases is object of a very complex biochemical regulation. In this thesis we pay attention to the study of some cell cycle proteins (PCNA, KI-67, P53, cyclin D1 and E) and to try to see their functions. Objects of thesis: 1) To determine by flow cytometry (FCM) DNA index, S phase, percentage of positive PCNA cells and the heterogeneity degree of every one in non-small-cell-lung carcinomas (NSCLC), in primary tumors and ganglionary metastases. 2) To research the existence of a model or models of DNA index and/or S phase and/or a percentage of PCNA related with metastatic phenomenon. 3) To determine the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression during the cell cycle and to evaluate if there are any other statistic relation with other study parameters. 4) To calculate by immunohistochemistry the degree of expression of cellular proliferating markers (PCNA, Ki-67), negative regulators (p53) and cyclins (D and E). 5) To assess the potential relations between the following values: clinics, anatomopathologics, FCM and immunohistochemistry. 6) To analyze statistically the values that might be important as an independent prognostic factor. Material and methods: We colleted 99 samples of NSCLC from 1993 to 1997, 89 men and 10 women. We collected four different types of data, in order to guarantee the objectivity when we obtain the values: clinical data, anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data. The clinical data was obtained to calculate the free survival and global survival of disease. The anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data was obtained by the analysis of surgically resected lung carcinomas that were sent to laboratory. Every sample was divided in two parts: one to study cell cycle and PCNA expression in different phases of cycle by FCM and the other to study the sample by histological study and immunohistochemical techniques. Results: 70% of adenocarcinomas were diagnosed as stage IIIA. Ki-67, PCNA and cyclin E were related with large cell carcinoma histological type, cyclin E was related too with squamous cell carcinoma type. Cyclin D1 was related with the degree of cell differentiation. PCNA and cyclin E were significantly correlated with Ki-67. A univariate analysis of global survival showed that study, variation coeficient of DNA index and variation coeficient of S phase were the most significant prognostic factors as variables related with disease evolution. Finally in a multivariate analysis to global survival disease, study and variability of S phase showed an independent prognostic value. Conclusions: There is a direct relationship between study and global survival of patients. The variables detected immunohistochemically do not have prognostic factors. There is a relationship between large cell carcinoma and high value of proliferative markers. Cyclin D1 over-expression is directly related with poorly differentiated NSCLC. S phase is related with a high PCNA expression by flow cytometry. Heterogeneity in PCNA expression by flow cytometry is related with heterogeneity degree of DNA index and S phase.

El cáncer de pulmón no célula pequeña es la neoplasia más frecuente en la actualidad en los países industrializados, siendo la primera causa de mortalidad por cáncer en el varón. Su incidencia continúa aumentando progresivamente, y su tratamiento, pese a los esfuerzos de investigación de los últimos años, sigue siendo poco efectivo en la mayor parte de los casos, situándose la supervivencia global a los cinco años alrededor del 13%. La alta tasa de recaída, incluso en estadios iniciales susceptibles de cirugías radicales, justifica el interés de estudiar marcadores pronósticos de supervivencia y recaída. Esto nos ayudaría a distinguir grupos de riesgo, cuyo interés radica en ayudarnos a conocer la necesidad y efecto de los tratamientos adyuvantes, con quimioterapia y radioterapia así como abrir la puerta a posibles nuevas armas terapéuticas. Dada la alta incidencia de alteraciones en la vía de p53 en el cáncer de pulmón no célula pequeña, y su probable valor pronóstico, nuestra hipótesis es que existen alteraciones en los niveles de expresión de los miRNAs directamente regulados por p53, así como en los reguladores intermedios de la función de p53, con posible valor pronóstico en recaída y supervivencia de pacientes operados de cáncer de pulmón no célula pequeña o no microcítico(CPNCP). Tratamos pues de identificar el papel que juegan los miRNAs como marcadores útiles en el pronóstico del CPNCP en estadios iniciales, tras cirugía radical. De forma más específica determinar el posible papel pronóstico en recaída y en supervivencia de los miRNAs de la familia de miR-34: miR-34a, miR-34b y miR-34c, cuya transcripción es activada por p53. También definir el posible papel pronóstico en recaída y en supervivencia de los miRNAs miR-16 y miR-143, cuyos niveles finales en la célula, están modulados por p53. Así como, conocer si existen posibles interacciones entre miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-16 y miR-143 a nivel pronóstico. Para ello, hemos planteado un estudio retrospectivo, con las muestras de tejido tumoral y normal pareado de 70 pacientes, diagnosticados y tratado, de cáncer de pulmón no microcítico estadios I-III, entre Febrero de 1996 y Septiembre de 2002, en el Hospital Clínic de Barcelona. Se realizaron la extracción y cuantificación de RNA. Determinación de los niveles de los microRNAs mencionados. Determinación del estado de metilación de la región promotora del gen MIR34A. Determinación de la presencia de mutaciones de P53 entre los exones 5-8. Tras estos estudios los resultado obtenidos se han publicado en dos artículos. El primero de ellos en la revista “Carcinogenesis” y el segundo en la revista “Journal of Surgical Oncology”. En el primer artículo, titulado “miR-34a as a prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer”, relacionamos los niveles de miR-34a con la recaída tumoral, estableciendo tres grupos en función de esta tasa de recaída: el grupo con niveles bajos de miR34a, con un 67% de recaída, los que tenían niveles altos, con un 43% de recaída y los que tenían los niveles más altos con un 0% de recaída. Además, en el análisis univariado para riesgo de recaída, el estado mutacional de P53, los niveles de miR-34a y el estadio IA vs el resto, se correlacionaron con probabilidad de recaída. Se realizaron dos análisis mutilvariados, incluyendo o no el estado mutacional de P53, permaneciendo en ambos análisis la expresión de miR-34a, como factor independiente para recaída tumoral. Se observó que los pacientes con mutaciones de P53 presentaban una media de expresión de miR-34a más baja. Se observó que el subgrupo de pacientes en el que los niveles de expresión de miR-34a baja coincidían con presencia de mutaciones de P53, presentaban una alta tasa de recaída. En los pacientes sin mutaciones de de P53, existe una diferencia significativa en los niveles de expresión de miR-34a entre los pacientes que presentaban la región promotora de MIR34A metilada vs los que no. Por todo esto, encontramos que miR-34a se demuestra como un nuevo marcador biológico con significación en el pronóstico de la recaída de pacientes sometidos a cirugía del CPNCP, abriendo la posibilidad de una futura herramienta en el algoritmo de decisiones terapéuticas. En el segundo artículo, titulado “Prognostic Implications of miR-16 Expression Levels in Resected Non-Small-Cell Lung Cancer”, desde la hipótesis de que P53 activa la transcripción de la familia de miRNAs de miR-34 y regula la maduración de miR-16 y miR143, se estudiaron los niveles de expresión de miR-143 y miR-16 en el tejido normal y tumoral pareado de cada paciente de la serie, antes mencionada, de 70 pacientes. Así los pacientes se clasificaron de acuerdo a los niveles de expresión de miR-16(alto, normal y bajo). Aquellos pacientes con niveles normales tuvieron la mejor evolución, mientras que aquellos con niveles más altos tuvieron la peor. La supervivencia libre de enfermedad (SLE) era de 22,4 meses para los pacientes con niveles altos de miR-16, 71,8 meses para los de niveles normales y de 55,8 meses para los de niveles bajos. La supervivencia global (SG) fue de 23,9 meses para los que tenían niveles altos de miR-16, de 97,6 meses para los que tenían niveles normales y 63,5 meses para aquellos con niveles bajos. No se observó correlación entre los niveles de miR-143 y la evolución clínica de los pacientes. El análisis multivariado mostró a miR-16 como factor pronóstico independiente de SLE Y SG. En un análisis secundario, examinamos la correlación potencial entre la expresión de miR-16 y miR-34a y el estado mutacional de P53.No hubo correlación entre el estado mutacional de P53 y miR-16, pero si se observó una interacción entre miR-16 y miR-34a. En los pacientes con niveles altos de miR-34a, se observaron diferencias entre SLE Y SG, de acuerdo a los niveles de expresión de miR-16, mientras que en los pacientes con niveles bajos de miR-34a presentaban un pobre pronóstico, independientemente de los niveles de expresión de miR-16. Estos resultados nos indican el posible valor pronóstico de miR-16 en pacientes intervenidos de CPNCP, además del posible sinergismo entre miR-34a y miR16. / Non small cell lung cancer is more common today, in industrialized countries and is the leading cause of cancer death in men. Its incidence continues to increase gradually, and their treatment, despite the research efforts of recent years, it remains ineffective in most cases, putting the overall survival at five years about 13%. The high rate of relapse, even in early stages susceptible to radical surgery, justifies the interest in studying prognostic markers of survival and relapse. This would help us distinguish risk groups, whose interest lies in helping to meet the need and effect of adjuvant treatment with chemotherapy and radiotherapy as well as opening the door to possible new therapeutic tools. Given the high incidence of alterations in the p53 pathway in non small cell lung cancer, and likely its prognostic role, our hypothesis is that there are alterations in the expression levels of miRNAs directly regulated by p53, as well as in intermediate regulators of p53 function with potential prognostic value on relapse and survival of patients undergoing non small cell lung cancer (NSCLC). Then, we try to identify the role of miRNAs as useful markers for the prognosis of NSCLC in initial stages, after radical surgery. More specifically determine the possible prognostic role in relapse and survival of the family miRNAs miR-34: miR-34a, miR-34b and miR-34c, whose transcription is activated by p53. Also define the possible prognostic role in relapse and survival of the miRNAs miR-16 and miR-143, whose final levels in the cell are modulated by p53. And, determine whether there are possible interactions between miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-16 and miR-143 as regards prognosis. To do this, we have proposed a retrospective study, with the tumor tissue and paired normal in 70 patients, diagnosed and treated of non small cell lung cancer stages I-III, between February 1996 and September 2002, at the Hospital Clínic, in Barcelona. We performed RNA extraction and quantification. Determining levels of microRNAs mentioned. Determining the status of methylation of the promoter region of the gene MIR34A. Determining the presence of p53 mutations between exons 5-8. Following, the results obtained from these studies have been published in two articles. The first in the journal "Carcinogenesis" and the second in the "Journal of Surgical Oncology." In the first article, entitled "miR-34a as a Prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer", we relate the levels of miR-34a with the tumor relapse, establishing three groups according to the rate of relapse: the group with low levels of miR34a, with 67% relapse, those with high levels, with 43% relapse and those with the highest levels with a 0% relapse. Furthermore, in univariate analysis for risk of relapse, the mutational status of p53, the levels of miR-34a and stage IA vs the rest, were correlated with likelihood of relapse. Two multivariate analyzes were performed, including or not the P53 mutational status, remaining in both analyzes the expression of miR-34a, as an independent factor for tumor relapse. It was observed that patients with p53 mutations had a mean expression of miR-34a lower. It was noted that the subgroup of patients in which the expression levels of miR-34a low coincided with the presence of p53 mutations, had a high rate of relapse. In patients without mutations of p53, there is a significant difference in expression levels of miR-34a between the patients with the methylated promoter region MIR34A vs. those without. For all this, we found that miR-34a is shown as a novel biomarker with prognostic significance in patients relapsed NSCLC undergoing surgery, opening the possibility of a future tool in the therapeutic decision algorithm. In the second article, entitled "Prognostic Implications of miR-16 Expression Levels in Resected Non-Small-Cell Lung Cancer", from the hypothesis that p53 activates transcription of the family of miRNAs miR-34 and regulates the maturation of miR-16 to miR-143, we studied the expression levels of miR-143 and miR-16 in the paired normal and tumor tissue of each patient in the series, mentioned above, in 70 patients. So patients were classified according to the expression levels of miR-16 (high, normal and low). Patients with normal levels had the best clinical course, while those with higher levels had the worst. The disease-free survival (DFS) was 22.4 months for patients with high levels of miR-16, 71.8 months for normal levels of 55.8 months for low levels. Overall survival (OS) was 23.9 months for those with high levels of miR-16, from 97.6 months for those with normal levels and 63.5 months for those with low levels. No correlation was observed between the levels of miR-143 and the clinical course of patients. Multivariate analysis showed miR-16 as an independent prognostic factor for DFS and OS. In a secondary analysis, we examined the potential correlation between the expression of miR-16 and miR-34a and the mutational status of P53. There was no correlation between p53 mutational status and miR-16, but observed an interaction between miR-16 and miR-34a. In patients with high levels of miR-34a, there were differences between DFS and OS, according to the expression levels of miR-16, whereas in patients with low levels of miR-34a had a poor prognosis, regardless of expression levels of miR-16. These results indicate the possible prognostic value of miR-16 in patients operated for NSCLC, as well as possible synergism between miR-34a and miR16

La ultrasonografía endoscópica (USE) combina la endoscopia con la ecografía para conseguir imágenes ecográficas de 360º desde el interior del tubo digestivo. Ello permite una muy buena visualización de las diferentes capas de la pared y de las estructuras de vecindad. Por otro lado, existe un ecoendoscopio sectorial que permite introducir una aguja por el canal operativo y realizar la punción con aguja fina guiada por USE en tiempo real desde el interior del tubo digestivo y obtener material citológico para el diagnóstico (USE-PAAF). Asi pues, la USE y la USE-PAAF constituyen unas técnicas idóneas para estudiar el engrosamiento de los pliegues gástricos, explorar tanto las lesiones focales como la patología difusa del páncreas, y realizar la estadificación locoregional de los tumores digestivos asi como para la obtención de material para el diagnóstico citológico. A pesar de la conocida utilidad de la USE y USE-PAAF en Oncología, existen patologías de difícil manejo clínico en los que el rendimiento de esta técnica no ha sido evaluado adecuadamente. Además, tampoco se han analizado cuáles son las circunstancias que permiten obtener un mayor rendimiento de la USE-PAAF. Por otro lado, la combinación de una técnica diagnóstica novedosa como es la USE-PAAF con los métodos de biología molecular podría suponer un verdadero avance en el diagnóstico de las neoplasias digestivas y pulmonares.La presente Tesis Doctoral está constituida por cuatro trabajos originales encaminados a resolver estas cuestiones y cuyos resultados permiten extraer las siguientes conclusiones:1. El engrosamiento de las capas profundas de la pared gástrica (submucosa y/o muscular) es el único criterio endosonográfico independiente predictivo de malignidad en pacientes con pliegues gástricos engrosados y biopsias negativas. 2. Utilizando este criterio, la USE es una técnica muy precisa y con un importante impacto clínico en el manejo de este grupo de pacientes. 3. En los pacientes referidos para USE-PAAF, esta técnica aumenta significativamente el porcentaje de diagnósticos correctos en cuanto a benignidad y malignidad con respecto a la USE, en especial en adenopatías y lesiones quísticas. 4. La localización intraparietal de la lesión es el único factor asociado a una mayor probabilidad de obtener un diagnóstico incorrecto por USE-PAAF. 5. La presencia de un patólogo en la sala de exploración aumenta el rendimiento de la USE-PAAF al reducir el número de pases necesarios para obtener un diagnóstico correcto y es una estrategia coste-eficaz.6. Es posible efectuar el análisis mutacional del gen KRAS en el material obtenido por USE-PAAF, con una elevada rentabilidad. 7. La citología convencional es la estrategia más precisa para el diagnóstico del cáncer de páncreas, pudiendo el análisis molecular incrementar su rendimiento en los pocos casos en los que la primera no es diagnóstica. 8. Es posible detectar la presencia de micrometástasis ganglionares mediante determinación de patrones de metilación aberrante en material obtenido por USE-PAAF.9. La combinación de este análisis con la citología convencional puede ser una aproximación útil en el diagnóstico de extensión de los pacientes con neoplasias digestivas y pulmonares. / Endoscopic ultrasound (EUS) consists in a high-frequency transducer placed at the tip of an endoscope. This technique permits to obtain high-resolution transmural sonographic images of the intestinal wall and surrounding structures. Moreover, it is possible to obtain cytological material from lesions located around the intestinal wall by means of FNA guided by EUS. EUS and EUS-FNA have become well-established procedures for diagnosing and staging both gastrointestinal and lung cancer as well as to study the pancreas. The aims of the present Doctoral Thesis were:1) to assess the predictive variables of malignancy in EUS, and the impact of EUS in patients with large gastric folds at endoscopy and endoscopic biopsies negative for malignancy; 2) To evaluate factors that permit to obtain a correct diagnosis by EUS-FNA and to establish the usefulness of disposing of an attendant pathologist; 3) To establish the usefulness of KRAS mutational analysis in the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma by comparing this technique with conventional cytology in aspirates obtained by means of EUS-FNA; and, 4) to evaluate whether hypermethylation gene promoter analysis was feasible on samples obtained by EUS-FNA from lymph nodes, as well as to establish the usefulness of this strategy for the detection of micrometastases in patients with gastrointestinal and non-small cell lung cancer.Results obtained permitted to conclude that: 1) the enlargement of deep layers is the only independent predictive factor for malignancy in patients with large gastric folds at endoscopy and biopsies negative for malignancy and that EUS has a high clinical impact in these patients; 2) The availability of an attendant pathologist seems to increase the diagnostic yield of the FNA, minimizing the number of passes and resulting in a cost-effective strategy. In absence of on-site evaluation the number of passes to perform should be 3 to 4 depending on the type of lesion; 3) Cytology from aspirates obtained by EUS-FNA is the most precise single technique for the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma. However, when adequate specimens are not available to reach a cytological diagnosis, the addition of KRAS mutational analysis represents the best strategy; and, 4) It is feasible to detect occult neoplastic cells in EUS-FNA samples by hypermethylation gene promoter analysis. Moreover, addition of methylation analysis to conventional cytology may increase its sensitivity at the expenses of a decrease in its specificity.

Existeix certa controvèrsia sobre els efectes del b-carotè com a promotor o protector del càncer de pulmó. A més, el b-carotè, com a precursor de l'àcid retinoic, podria estimular la termogènesi i regular l'adipositat corporal. La fura representa un bon model per estudiar els efectes de la ingesta de b-carotè ja que l'absorbeix de manera pràcticament intacta (semblant als humans). Hem demostrat que el b-carotè ingerit amb altres antioxidants no sembla tenir efectes inductors del càncer ja que no augmenta la proliferació cel·lular al pulmó i a més prevé els efectes del carcinogen benzo[a]pirè. D'altra banda, dosis farmacològiques de b-carotè fan a la fura efectes contraris als de l'àcid retinoic, ja que augmenten l'adipositat i resulten en una menor capacitat termogènica, principalment al teixit adipós retroperitoneal que, a la fura, presenta certes característiques de teixit adipós marró, ja que té un percentatge considerable d'adipòcits multiloculars i expressa quantitats significatives d'UCP1. / Existe controversia sobre los efectos del b-caroteno como promotor o protector del cáncer de pulmón. Además, el b-caroteno, como precursor del ácido retinoico, podría estimular la termogénesis y regular la adiposidad corporal. El hurón representa un buen modelo para estudiar los efectos de la ingesta de b-caroteno pues lo absorbe de manera prácticamente intacta (similar a los humanos). Hemos demostrado que el b-caroteno ingerido con otros antioxidantes no parece tener efectos inductores del cáncer puesto que no aumenta la proliferación celular del pulmón y además previene los efectos del carcinógeno benzo[a]pireno. Por otra parte, dosis farmacológicas de b-caroteno producen en el hurón efectos contrarios a los del ácido retinoico, ya que aumentan la adiposidad y reducen la capacidad termogénica, principalmente del tejido adiposo retroperitoneal que, en el hurón, presenta ciertas características de tejido adiposo marrón, al contener un porcentaje considerable de adipocitos multiloculares y expresar cantidades significativas de UCP1. / The effects of b-carotene promoting or protecting against lung cancer are unclear. Furthermore, b-carotene, as retinoic acid precursor, could induce thermogenesis and regulate body adiposity. The ferret represents a good model to study the effects of oral administration of b-carotene because it absorbs it almost intact (similarly to humans). We have shown that the intake of b-carotene together with other antioxidants does not seem to inducecancer as it does not increase cellular proliferation in lung and prevents the effects of the carcinogen benzo[a]pyrene. In addition, pharmacological b-carotene doses in ferrets have different effects from retinoic acid, increasing adiposity and decreasing thermogenic capacity, especially in the retroperitoneal adipose tissue which, in ferrets, resembles brown adipose tissue, since it has an important percentage of multilocular adipocytes and expresses significant amount of UCP1.