El càncer de pàncreas és la quarta causa de mortalitat en el món industrialitzat. Per tant cal avançar cap a la recerca de noves aproximacions terapèutiques que ens permetin millorar aquest pronòstic. Actualment la gemcitabina és el fàrmac d'elecció, tot i que els resultats són clarament insuficients. En aquest marc s'ha desenvolupat aquest treball amb l'objectiu de millorar els efectes de la gemcitabina emprant estratègies de teràpia gènica en models in vitro i in vivo de càncer de pàncreas humà.La primera aproximació ha consistit en la reintroducció dels transportadors de nucleòsids hCNT1 i hENT1 mitjançant vectors adenovirals defectius. Els resultats obtinguts ha posat de manifest que la sobrexpressió del transportador de nucleòsids equilibratiu hENT1 mitjançada per adenovirus permet assolir un augment significatiu del transport sensible a NBTI en línies cel·lulars amb un transport basal baix, alhora que indueix un arrest a la fase G2 del cicle cel·lular i redueix l'expressió d'enzims implicats en el metabolisme dels àcids nuclèics. Per altra banda, la combinació terapèutica de la introducció del transportador hENT1 i el fàrmac gemcitabina indueix, sorprenentment, quimioresistència en un model in vitro. Tanmateix, la transferència del transportador in vivo combinada amb el fàrmac afavoreix la inhibició del creixement tumoral. La introducció per infecció adenoviral del transportador hCNT1 provoca un augment del transport sodi-dependent i indueix un arrest a la fase S del cicle cel·lular en cèl·lules tumorals. La sobrexpressió de hCNT1 indueix mort cel·lular per necrosi i inhibeix eficientment el creixement de tumors al teixit subcutani de ratolins atímics. Al mateix temps, la combinació terapèutica amb la gemcitabina provoca una major inhibició del creixement tumoral.La segona aproximació s'ha basat en la determinació de la implicació de la comunicació intercel·lular en els efectes citotòxics de la gemcitabina. Així com, la modulació d'aquesta citotoxicitat per sobrexpressió de connexina 26 tant in vitro com in vivo. Els resultats obtinguts han mostrat que els nivells de comunicació intercel·lular mitjançats per unions gap determinen l'eficàcia citotòxica de la gemcitabina. Aquesta correlació posa de manifest que la resposta citotòxica a aquest fàrmac pot amplificar-se per efecte adjacent. L'augment de comunicació cel·lular per sobrexpressió de connexina 26 corrobora l'existència d'efecte adjacent in vitro i millora la resposta antitumoral in vivo.En la tercera aproximació hem unit la teràpia gènica amb p53 amb la replicació viral en el que s'anomena viroteràpia gènica amb la finalitat de potenciar els resultats previs descrits amb aquestes dues estratègies per separat. Per això, s'han generat adenovirus replicatius armats amb el transgèn de p53 i tatp53 sota el control del promotor de fase tardana (MLP) del virus i s'han caracteritzat els seus efectes en models in vitro i in vivo de càncer de pàncreas humà. El conjunt de resultats ha posat de manifest que l'expressió de p53 en la fase tardana de la replicació adenoviral millora l'acció antitumoral de l'adenovirus quan aquest és injectat intratumoralment.En l'últim bloc s'ha dut a terme l'establiment i estandarització de xenoimplants ortotòpics a partir de tumors subcutanis de cèl·lules tumorals i de nous models ortotòpics procedents directament de fragments quirúrgics d'adenocarcinomes pancreàtics humans amb la finalitat de poder validar diferents combinacions terapèutiques. L'estandarització i caracterització d'aquests models ortotòpics ha evidenciat que les característiques histològiques i genètiques, així com el patró de disseminació metastàtica dels tumors d'origen es mantenen estables al llarg de, com a mínim, 3 generacions. / Pancreatic cancer is the fourth leading cause of mortality in the industrialized world. Therefore, the research of new therapeutic approaches is essential to improve this negative prognosis. Nowadays, gemcitabine is the standard first line treatment drug, even though results are clearly insufficient. In this framework, the aim of this work has been to improve the effects of gemcitabine by means of gene therapy strategies in in vitro and in vivo models of human pancreatic cancer.The first approach consists of overexpressing nucleoside transporters hCNT1 and hENT1 through defective adenoviral vectors. Overexpression of hENT1 allows a moderate increase on nucleoside transport activity NBTI-sensitive and is associated with cell cycle arrest. Furthermore, therapeutic combination of hENT1 introduction and gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth. Introduction of hCNT1 provokes an increase in sodium-dependent transport activity and induces an S-phase cell cycle arrest. hCNT1 overexpression induces necrosis and efficiently inhibit tumour growth. Besides, combination of hCNT1 with gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth.The second approach is based on the analysis of intercellular comunication involvement on gemcitabine cytotoxicity and the modulation by connexin 26 overexpression. Results show that gap junctions determine gemcitabine cytotoxicity. This correlation reveals that cytotoxic response to this drug could be magnified by bystander effect. The increase in cellular comunication by connexin 26 overexpression confirms the existence of bystander effect in vitro and improves antitumoral response in vivo.In the third approach, p53 gene therapy and viral replication have been joined to perform gene virotherapy. Replicative adenoviruses armed with p53 or tatp53 under the adenoviral major late promoter (MLP) control have been generated. Their effects have been characterized in vitro and in vivo. The results show that later p53 expression in replicative adenovirus improves antitumoral action of adenovirus when is intratumourally injected.The last point consists of the establishment and characterization of orthotopic xenografts developed from tumour cells and new orthotopic models obtained directly from surgical human pancreatic adenocarcinoma fragments. These orthotopic models retain histologic and genetic characteristics. Dissemination patterns are stable for at least three generations as well.

Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA).La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies.L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats.L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna.La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat.La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades.Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.

La ultrasonografía endoscópica (USE) combina la endoscopia con la ecografía para conseguir imágenes ecográficas de 360º desde el interior del tubo digestivo. Ello permite una muy buena visualización de las diferentes capas de la pared y de las estructuras de vecindad. Por otro lado, existe un ecoendoscopio sectorial que permite introducir una aguja por el canal operativo y realizar la punción con aguja fina guiada por USE en tiempo real desde el interior del tubo digestivo y obtener material citológico para el diagnóstico (USE-PAAF). Asi pues, la USE y la USE-PAAF constituyen unas técnicas idóneas para estudiar el engrosamiento de los pliegues gástricos, explorar tanto las lesiones focales como la patología difusa del páncreas, y realizar la estadificación locoregional de los tumores digestivos asi como para la obtención de material para el diagnóstico citológico. A pesar de la conocida utilidad de la USE y USE-PAAF en Oncología, existen patologías de difícil manejo clínico en los que el rendimiento de esta técnica no ha sido evaluado adecuadamente. Además, tampoco se han analizado cuáles son las circunstancias que permiten obtener un mayor rendimiento de la USE-PAAF. Por otro lado, la combinación de una técnica diagnóstica novedosa como es la USE-PAAF con los métodos de biología molecular podría suponer un verdadero avance en el diagnóstico de las neoplasias digestivas y pulmonares.La presente Tesis Doctoral está constituida por cuatro trabajos originales encaminados a resolver estas cuestiones y cuyos resultados permiten extraer las siguientes conclusiones:1. El engrosamiento de las capas profundas de la pared gástrica (submucosa y/o muscular) es el único criterio endosonográfico independiente predictivo de malignidad en pacientes con pliegues gástricos engrosados y biopsias negativas. 2. Utilizando este criterio, la USE es una técnica muy precisa y con un importante impacto clínico en el manejo de este grupo de pacientes. 3. En los pacientes referidos para USE-PAAF, esta técnica aumenta significativamente el porcentaje de diagnósticos correctos en cuanto a benignidad y malignidad con respecto a la USE, en especial en adenopatías y lesiones quísticas. 4. La localización intraparietal de la lesión es el único factor asociado a una mayor probabilidad de obtener un diagnóstico incorrecto por USE-PAAF. 5. La presencia de un patólogo en la sala de exploración aumenta el rendimiento de la USE-PAAF al reducir el número de pases necesarios para obtener un diagnóstico correcto y es una estrategia coste-eficaz.6. Es posible efectuar el análisis mutacional del gen KRAS en el material obtenido por USE-PAAF, con una elevada rentabilidad. 7. La citología convencional es la estrategia más precisa para el diagnóstico del cáncer de páncreas, pudiendo el análisis molecular incrementar su rendimiento en los pocos casos en los que la primera no es diagnóstica. 8. Es posible detectar la presencia de micrometástasis ganglionares mediante determinación de patrones de metilación aberrante en material obtenido por USE-PAAF.9. La combinación de este análisis con la citología convencional puede ser una aproximación útil en el diagnóstico de extensión de los pacientes con neoplasias digestivas y pulmonares. / Endoscopic ultrasound (EUS) consists in a high-frequency transducer placed at the tip of an endoscope. This technique permits to obtain high-resolution transmural sonographic images of the intestinal wall and surrounding structures. Moreover, it is possible to obtain cytological material from lesions located around the intestinal wall by means of FNA guided by EUS. EUS and EUS-FNA have become well-established procedures for diagnosing and staging both gastrointestinal and lung cancer as well as to study the pancreas. The aims of the present Doctoral Thesis were:1) to assess the predictive variables of malignancy in EUS, and the impact of EUS in patients with large gastric folds at endoscopy and endoscopic biopsies negative for malignancy; 2) To evaluate factors that permit to obtain a correct diagnosis by EUS-FNA and to establish the usefulness of disposing of an attendant pathologist; 3) To establish the usefulness of KRAS mutational analysis in the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma by comparing this technique with conventional cytology in aspirates obtained by means of EUS-FNA; and, 4) to evaluate whether hypermethylation gene promoter analysis was feasible on samples obtained by EUS-FNA from lymph nodes, as well as to establish the usefulness of this strategy for the detection of micrometastases in patients with gastrointestinal and non-small cell lung cancer.Results obtained permitted to conclude that: 1) the enlargement of deep layers is the only independent predictive factor for malignancy in patients with large gastric folds at endoscopy and biopsies negative for malignancy and that EUS has a high clinical impact in these patients; 2) The availability of an attendant pathologist seems to increase the diagnostic yield of the FNA, minimizing the number of passes and resulting in a cost-effective strategy. In absence of on-site evaluation the number of passes to perform should be 3 to 4 depending on the type of lesion; 3) Cytology from aspirates obtained by EUS-FNA is the most precise single technique for the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma. However, when adequate specimens are not available to reach a cytological diagnosis, the addition of KRAS mutational analysis represents the best strategy; and, 4) It is feasible to detect occult neoplastic cells in EUS-FNA samples by hypermethylation gene promoter analysis. Moreover, addition of methylation analysis to conventional cytology may increase its sensitivity at the expenses of a decrease in its specificity.