Spelling suggestions: "subject:"ribonucleasa"" "subject:"ribonucleasas""
1 |
Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteicTorrent i Mas, Joan 26 July 2000 (has links)
A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A. / Para analizar la contribución de la región C-terminal propuesta como iniciadora del plegamiento (CFIS 106-118) en la estabilidad de la RNasa A, los residuos alifáticos de esta región fueron sustituidos, mediante mutagénesis dirigida, por otros residuos en los cuales la cadena lateral alifática era progresivamente recortada. La mayor parte de las sustituciones proyectadas suponían deleciones no disruptivas de grupos metilo(eno). Además, se reemplazó la Tyr115 por un Trp, de forma que, potencialmente, se introducía una única sonda fluorescente, no desestabilizadora, para seguir los cambios conformacionales que se pudieran generar en la región durante el proceso de plegamiento/desplegamiento de la proteína. Tanto los parámetros cinéticos, como los espectros de FTIR y CD, determinados para cada una de las ribonucleasas variantes, indican que las sustituciones aminoacídicas efectuadas presentan, en general, poco o ningún efecto en la estructura nativa y en la actividad de la enzima. Se utilizó la espectroscopia de absorción ultravioleta de cuarta derivada, la fluorescencia (para la variante con Trp) y la espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, para seguir y caracterizar, en condiciones de equilibrio, las transiciones conformacionales de cada variante en función de la presión y de la temperatura. Los resultados se compararon con los que se obtuvieron por la proteína salvaje. Para determinar más a fondo las características del proceso de desplegamiento de la variante Y115W, las transiciones de desnaturalización inducidas por urea de esta variante y de la proteína salvaje, fueron examinadas mediante electroforesis en gradiente de urea y espectroscopia de fluorescencia. Curiosamente, los cambios conformacionales que resultan de la desnaturalización por presión son muy parecidas a los que se obtuvieron por temperatura. Enfrente de un aumento gradual tanto de presión como de temperatura, la estructura terciaria i los elementos de estructura secundaria de las proteínas estudiadas se pierden de forma conjunta y reversible. Estas variaciones estructurales que se promueven describen un proceso de desplegamiento muy cooperativo y en dos estados. Dado que las dos técnicas (UV y FTIR) utilizan cada una un régimen de concentración proteica muy diferente, los resultados indican que el proceso de desplegamiento por presión y por temperatura es intramolecular. Los resultados obtenidos sugieren que la hidrofobicidad y el volumen de las cadenas laterales del CFIS, junto con las interacciones de van der Waals entre elementos de estructura secundaria intervienen de forma muy notable en la estabilización de la proteína. Entre los diferentes aminoácidos alifáticos que pertenecen al CFIS C-terminal, la Val108 es el residuo más importante para preservar la integridad estructural del estado nativo. Las sustituciones en esta posición causan pequeñas alteraciones conformacionales y una gran desestabilización de la proteína (por ejemplo, el punto medio de la transición de desnaturalización por presión y por temperatura de la variante V108G disminuye unos 592 MPa y 25ºC, respectivamente, respecto a la proteína salvaje). De acuerdo con los resultados obtenidos, la variante Y115W ofrece una sonda útil para seguir la cinética de plegamiento/desplegamiento de la RNasa A. / To analyze the contribution of the postulated carboxy terminal chain-folding initiation site (CFIS 106-118) on ribonuclease A stability, the aliphatic side chains in this region were progressively truncated using site-directed mutagenesis. Most amino acid substitutions were designed to be non-disruptive deletions of methyl and methylene groups. In addition, replacement of Tyr 115 with Trp was designed for its potential as a unique and non-destabilizing fluorescent label of conformational changes local to the region. Steady-state kinetic parameters for the enzyme reaction, FTIR and CD spectra of each RNase A variant indicate that amino acid replacements performed in this region have, in general, little or no effect on the native structure and function of the enzyme. Fourth derivative UV absorbance, fluorescence (for the Trp variant) and Fourier transform infrared spectroscopy were used to detect and characterize the conformational transitions of each variant, as a function of both pressure and temperature. The results were compared with those presented for the wild-type protein. To further determine the unfolding properties of the Y115W variant, the unfolding transitions induced by urea of RNase A wild-type and Y115W variant, were examined by urea gradient gel electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Interestingly, conformational changes resulting from pressure denaturation do not differ considerably from those obtained during temperature treatment. Simple two- state, reversible unfolding transitions were observed, suggesting that the disruption of tertiary and secondary structure of each protein at high pressure or temperature is strongly cooperative. Spectral changes occur at about the same values using both low- and high-protein concentration regime techniques, indicating that the observed unfolding events are intramolecular, and that breakdown of the tertiary and secondary structures occurs concomitantly. The results obtained reveal that hydrophobicity and volume of the CFIS side chains, together with van der Waals interactions between secondary structural elements play an important role in stabilizing the protein. Among the aliphatic amino acids belonging to the C-terminal CFIS, V108 is the most critical residue. Replacements performed in this site cause small conformational differences in the native state, and a dramatic destabilization of the protein (i.e. the pressure and temperature midpoint denaturation values of the V108G variant decrease by 592 MPa and by 25ºC, respectively, relative to the wild-type RNase A). According to the results obtained in the current study, the Y115W labeled variant offers a useful probe for the folding/unfolding kinetics.
|
2 |
Determinación de la actividad ribonucleasa en aislados chilenos del virus diarrea viral bovinaDevia Ulloa, Natalia Andrea January 2014 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Diarrea Viral Bovina (VDVB) es un patógeno de gran importancia, puesto que es responsable de importantes pérdidas económicas en la industria del bovino, debido a que causa disminución en la producción, trastornos reproductivos y, en algunos casos, puede provocar la muerte del animal.
El VDVB pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Es un virus cuyo genoma es un ARN de hebra simple y polaridad positiva, que presenta dos regiones no codificantes en sus extremos (5’NCR y 3’NCR) y una única región codificante entre ambas, la cual codifica para una poliproteína que contiene todas las proteínas virales. Una de estas proteínas es la glicoproteína Erns, que posee actividad RNasa. Esta actividad enzimática no es necesaria para la multiplicación del virus y se reconoce como un factor de virulencia, dado que su inhibición produce atenuación de los signos clínicos en el hospedero.
En la presente memoria se midió la actividad RNasa de cuatro aislados nacionales del VDVB, pertenecientes a los subgenotipos 1b (CH/113 y CH/1025) y 1j (CH/511 y CH/1087), los subgenotipos más predominantes en el país; y la cepa de referencia internacional, NADL, perteneciente al subgenotipo 1a. Ambos virus del subgenotipo 1j presentan una mutación en el sitio activo de la actividad RNasa de la glicoproteína Erns, correspondiente a la sustitución del aminoácido Histidina por Tirosina, mientras que los otros virus estudiados poseen la secuencia silvestre del VDVB.
Los resultados obtenidos muestran que los virus del subgenotipo 1j presentan una baja ostensible de su actividad RNasa. Por el contrario, las cepas del subgenotipo 1b presentan niveles de actividad RNasa comparables a los de la cepa de referencia NADL. Al comparar las diferencias en actividad enzimática entre las cepas que presentaron o no la mutación, utilizando el método de Scheffé, se determinó que estas diferencias son estadísticamente significativas. / Proyecto Fondecyt 1060581
|
3 |
Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiquesBosch i Grau, Montserrat 18 December 2003 (has links)
Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI.L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques.Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació.Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal.Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI.Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització. / The main objective of this thesis is to study the molecular bases of the cytotoxicity of certain ribonucleases. With the final aim to obtain cytotoxic variants derived from human pancreatic ribonuclease. For this purpose, we created variants derived from HP-RNase by using two different strategies. In the first, variants of the enzyme that were resistant to the action of the protein inhibitor of the ribonuclease (RI) were generated, replacing residues involved in the contact interfase between the ribonuclease and RI. In the second, RGD motifs were added to the surface of the proteins involved in the formation of the RI complex, with the aim of promoting their interaction with the cell plasmatic membrane, whilst at the same time decreasing the variant's affinity for RI. We showed that only variants carrying multiple substitutions acquired the capacity to resist the RI.The study of the percentage of inhibition of protein synthesis in incubated cells using each of the variants showed that only two variants had acquired cytotoxic properties. The highest level of cytotoxicity found in a non-resistant variant to RI had a value that was only 5 and 25 times lower than those registered by Onconase®. This result shows that RI sensitivity is not a limiting factor for the cytotoxicity of the ribonuclease. None of the variants which contained RGD motifs showed any sign of toxicity, suggesting that for this reason it is not effective in giving pancreatic ribonuclease cytotoxic properties.The cytotoxic molecular bases of the most cytotoxic variant were studied. Firstly by the analysis of the internalisation of this particular variant by radioactive marking in relation to Onconase and other non-cytotoxic variants of HP-RNase, which showed that only Onconase was effectively internalised. Thus the possibility that the cytotoxic action of the enzyme under observation was a result of a more efficient endocytosis was ruled out. It was also shown that the addition of the RGD motif was unable to encourage the internalisation of the proteins more effectively. Using confocal microscopy, the human variants only began to be noted inside the cell after 24 hours incubation.All the variants that were created retained a catalytic efficiency that was never less than 50 % of the catalytic activity achieved by the parent protein PM5. This suggests that the structure within the active centre had not been affected in any serious way by the introduction of the substitutions. However a decrease in thermostabilty was noted across the board with regards to PM5. This result indicates that the correlation mentioned in the bibliography between the increase of thermostability and the increase of cytotoxicity of the ribonuclease does not always exist.Using a confocal microscope, we confirmed that both the most cytotoxic protein, such as a non-cytotoxic variant resistant to RI, and the parent protein, followed the same lysosomal pathway of degradation. This outcome was unaffected by the addition of drugs which can change retrograde transit pathways (monensine and brefeldine A), but was effected by the addition of bafilomicine A1 a drug which neutralises endosomal pH and which in this case acted by slowing down the movement of proteins to lysosomes. In accordance with these results, the cytotoxicity values of the variants were significantly increased only by the presence bafilomicine A1 suggesting that the ribonuclease translocate into the cytoplasm starting from a point somewhere along the endosomal transit pathway.We confirmed that the behaviour of the most cytotoxic variant was due to the fact that the addition of a second motif of 3 Arg in PE5 endowed the protein with a nuclear transport signal. The division of the enzyme that translocates into the cytoplasm (from somewhere along the endosomal transit path before the lysosomes) is rapidly moved towards the core of the cell via the conventional mechanism for nucleus transport. Due to its affinity for rRNA, the enzyme gathers in the nucleolus, where it probably carries out its catalytic activity. On the other hand, the interaction of this variant with nucleocytoplasmatic receptors will prevent the RI from inhibiting the enzyme.These results offer a new strategy for the design of cytotoxic ribonuclease, based on the addition of NLS motifs, with the aim of encouraging the nuclear transport of enzymes. This strategy could allow one to overcome limitations that up until now have been the down-side to the cytotoxicity of pancreatic ribonuclease, such as a sensitivity for RI or the limited efficiency of internalisation.
|
4 |
El virus de l'hepatitis C i la ribonucleasa Phumana: aspectes biològics i terapèuticsNadal i Matamala, Anna 26 January 2004 (has links)
El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix. S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes. / Hepatitis C virus is a human pathogen causing chronic liver disease in 170 million people worldwide. The virus is classified within the family Flaviviridae. The RNA genome is single-stranded and functions as the sole mRNA species for translation. It comprises a 5'-untranslated region, which functions as an internal ribosome entry site, and a long open reading frame, which encodes a polyprotein precursor of about 3010 amino acids, that is cleaved into structural (core, envelope 1, envelope 2 and p7) and non-structural (NS-2, NS-3, NS-4 and NS-5) proteins; followed by a 3' non-coding region. Analyzing significant numbers of cDNA clones of hepatitis C virus (HCV) from single isolates provides unquestionable proof that the viral genome cannot be defined by a single sequence, but rather by a population of variant sequences closely related to one another. In the infected patient, a master (the most frequently represented sequence) and a spectrum of mutant sequences may be isolated at any given time during chronic infection. This manner of organizing genetic information, which characterizes most RNA viruses, is referred to as quasispecies. HCV resistance to treatment (either alone or in combination with ribavirin) is one of the most important clinical implications predicted by the quasispecies model suggesting the necessity to seek new therapies. HCV therapeutic strategies based on ribozyme cleavage are leading candidates. The ribozyme activity of Ribonuclease P (RNase P) is among proposed antiviral agents. RNase P is a ubiquitous cellular endonuclease and one of the most abundant and efficient enzymes in the cell. This enzyme is a ribonucleoprotein complex that catalyzes a hydrolysis reaction to remove the leader sequence of precursor tRNA to generate the mature tRNA. Substrate recognition by the RNase P ribozyme does not rely on sequence requirements but on structural features of the RNA substrate. Custom-designed ribo-oligonucleotides, which hybridize with the target, called external guide sequences (EGSs), may provide the RNA structure which RNase P recognizes and cleaves in the hybridized complex. Recognition of structures instead of sequences may represent a great advantage in the fight against variable viruses because single or even double mutations in the target may be tolerated for RNase P recognition. One of the major aims of this work is to cleave HCV RNA using the RNase P ribozyme guided by EGS. To expand investigation of targeting in the HCV genome we assessed accessibility and low potential of variation of the target RNA since it is described that are crucial requirements for ribozyme therapy against viral infections. In the hepatitis C virus, the sequence of the 5' non coding region is conserved but the highly folded RNA structure severely limits the number of accessible sites. We have considered an internal genomic region whose sequence variation has been widely investigated. We have first mapped the accessibility of the genomic RNA to complementary DNAs within an internal genomic region. We performed a kinetic and thermodynamic study. Accordingly, we have designed and assayed four RNase P ribozymes targeted to the selected sites. Considerations on RNA structural accessibility and sequence variation indicate that several target sites should be defined for simultaneous attack. While performing targeting experiments on HCV RNA transcripts with RNase P we have found that, surprisingly, purified RNase P (peak activity) from HeLa cells cleaved HCV genomic RNA efficiently at two sites in the absence of EGSs. We report the techniques used to prove that the cleavage is specific to human RNase P (indirect methods: immunoprecipitation and competitive inhibition), and to show where cleavage occurs (direct method: RNA fingerprinting). We have confirmed that human RNase P is responsible for HCV RNA processing and that the two cleavages sites are in the IRES HCV domain, close to AUG initiator triplet, and in the E2/NS2 junction fragment (between structural and non structural coding region). To define cleavage by RNase P as a general property of HCV, viral sequences obtained from different patients were compared for RNase P cleavage accessibility. Cleavage was consistently observed in all sequences tested although with different efficiencies. Since RNase P recognizes and cleaves tRNA-like structures, we believe that such recognition by RNase P is an indication for the presence of two possible tRNA-like structures in the HCV genome. Comparison of such results at the two HCV RNase P cleavage sites should help us to understand in greater detail HCV substrate structure, tRNA mimicry, rules underlying recognition by human RNase P, and, in the particular case of the IRES motif, possible participation in translation. Whatever the role of such tRNA-like structures, such a strong tendency to maintain them might be important in the development of therapeutic strategies against the virus because they can represent highly susceptible targets for RNase P.
|
5 |
Glicosilació aberrant en proteïnes de secreció com a marcadors tumoralsTabarés Carreras, Glòria 19 March 2004 (has links)
Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA).La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies.L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats.L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna.La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat.La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades.Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.
|
6 |
Characterization of cytotoxic ribonucleases: from the internalization pathway to the importance of dimeric structuresRodríguez Maynou, Montserrat 15 December 2006 (has links)
En aquesta tesi s'ha caracteritzat la ruta d'internalització de l'onconasa, una RNasa citotòxica. Els resultats indiquen que l'onconasa entra a les cèl·lules per la via dependent de clatrina i del complex AP-2. Seguidament es dirigeix als endosomes de reciclatge i es a través d'aquesta ruta que la proteïna exerceix la citotoxicitat. Per altra banda, els resultats d'aquest treball demostren que PE5, una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), interacciona amb la importina  mitjançant diferents residus que tot i que no són seqüencials, es troben propers en l'estructura tridimensional d'aquesta proteïna. PM8 és una HP-RNasa amb estructura cristal·logràfica dimèrica constituïda per intercanvi de dominis N-terminals. En aquesta tesi s'han establert les condicions per estabilitzar aquest dimer en solució i també es proposa un mecanisme per la dimerització. / In this thesis it has been characterized the internalization pathway of onconase, which is a cytotoxic ribonuclease. The results show that onconase enters cells using AP-2/clathrin mediated pathway and then is routed to the recycling endosomes. In addition, the results show that this is the route used by onconase to perform its cytotoxicity. On the other hand, the results indicate that PE5, a cytotoxic human pancreatic ribonuclease (HP-RNase), interacts with importin α using different residues that although they are scattered along the sequence, they are close in the three-dimensional structure of the protein. PM8 constitutes a crystallographic dimer by the exchange of the N-terminal domains. In this thesis it has been investigated the solution conditions that favour the dimeric form and it is proposed a dimerization process of this variant. Finally, the pattern of substrate cleavage is studied by HP-RNase.
|
7 |
Paper del nucli hidrofòbic principal de la RNasa A en el plegament i desplegament induïts per pressió i temperaturaFont i Sadurní, Josep 02 June 2006 (has links)
Utilitzant temperatura i pressió com a agents desnaturalitzants s'ha explorat la contribució a l'estabilitat de diferents residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A. Aquests resutats suggereixen que el principal nucli hidrofòbic d'aquest enzim, està fortament empaquetat i ha revelat l'existència de reordenacions en l'interior de la proteïna.El mètode dels valors , han permès estudiar el paper de les interaccions hidrofòbiques establertes pels residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A en el seu estat de transició induït per pressió. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'estat de transició de la RNasa A, s'assemblaria a un glòbul col·lapsat amb una cadena estructurada però amb un debilitat nucli hidrofòbic.S'ha explorat també, el paisatge energètic del plegament/desplegament proteic de la variant Y115W de la RNasa A. L'estat de transició sembla interaccionar fortament amb la capa d'hidratació d'aquest estat, tal i com indiquen els resultats en presència de glicerol. / Using temperature and pressure as denaturants we have explored the contributions to stability of the hydrophobic core residues of RNase A. These results are consistent with an exquisite tight core packing and the existence of rearrangements in the protein interior.The role of hydrophobic interactions established by the residues of the main hydrophobic core of RNase A in its pressure-folding transition state, was investigated using the -value method. Altogether the results suggest that the pressure-folding transition state of RNase A, looks like a collapsed globule with some secondary structure and a weakened hydrophobic core. Pressure-jump induced relaxation kinetics was used to explore the energy landscape of protein folding/unfolding of Y115W variant of RNase A. The transition state appears to interact strongly with the hydration shell, as indicated by results in the presence of glycerol.
|
8 |
Detecció de la Ribonucleasa 1 anòmalament glicosilada en sèrums humans: possible ús com a marcador tumoral del càncer de pàncreasBarrabés Vera, Sílvia 08 October 2007 (has links)
L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes. / Pancreatic adenocarcinoma has one of the highest mortality rates of all neoplasias and it has no specific markers. In this work, possible alterations in the glycan structures of human pancreatic ribonuclease (RNase 1) present in serum are investigated with the aim of determining its diagnostic utility. Serum and endothelial RNase 1 glycan structures have been described and an increase of biantennary structures with Fc in serum RNasen 1 from pancreatic cancer patients could be observed, what can be of diagnosis utility. Also, due to the high similarity between serum RNase 1 and endothelial RNase 1 glycan structures, it was concluded that endothelium can be the main producer of serum RNase 1. RNase 1 was also evaluated by two-dimensional electrophoresis and a correlation between the sialic acid content and the observed pI decrease could be establish, what may be very significant for understanding and interpreting two-dimensional maps from other glycoproteins.
|
9 |
A human pancreatic ribonuclease variant kills cancer cells by apoptosis and reduces the expression of P-glycoprotein in MDR cell linesCastro Gallegos, Jessica 26 October 2010 (has links)
En aquesta tesi s'han estudiat les propietats antitumorals d'una variant de la ribonucleasa pancreàtica humana anomenada PE5 que incorpora un senyal de localització nuclear. Aquest estudi mostra que PE5 indueix l'apoptosi de les cèl·lules tractades i que aquesta mort és independent de l'activitat de p53. A més, l'efecte citotòxic no es veu afectat per un fenotip de resistència a múltiples drogues. Les dades també mostren que l'activitat citotòxica de PE5 és selectiva per a cèl·lules tumorals in vitro i que la capacitat citotòxica de les dues ribonucleases és semblant. S'ha estudiat l'efecte d'aquestes dues ribonucleases sobre el cicle cel·lular, l'activació de diferents caspases i l'expressió de proteïnes relacionades amb l'apoptosi i el cicle cel·lular. Els resultats indiquen que PE5 i l'onconasa maten les cèl·lules a través de mecanismes diferents. A més, PE5 però no l'onconasa, redueix l'acumulació de glicoproteïna-P en dues línies cel·lulars resistents a múltiples drogues. / In this thesis the antitumor properties of PE5, a variant of human pancreatic ribonuclease carrying a nuclear localization signal, have been investigated. This study shows that the cytotoxicity of PE5 is produced through apoptosis and that this ribonuclease does not require the activity of p53 to trigger the cell death. In addition, the cytotoxic effect is not prevented by a multiple drug resistance phenotype. The data also show that in vitro PE5 is selective for tumor cells and that PE5 and onconase induce cell death to the same extent. Effects of both ribonucleases on the cell cycle, on the activation of different caspases and on the expression of different apoptosis- and cell cycle-related proteins have been investigated. The results show that PE5 and onconase kill the cells through mechanisms with significant differences. In addition, PE5 but not onconase, reduces the accumulation of P-glycoprotein in two different multidrug-resistant cell lines.
|
Page generated in 0.2473 seconds