Infectious bronchitis virus (IBV) is the causative agent of an economically important disease of poultry. In Brazil this disease causes respiratory, renal and reproductive problems in birds of all ages, despite constant vaccination with the Massachusetts strain H120. This lack of immunological protection is known to be due the genetic variation in the spike glycoprotein of IBV, which is involved in host cell attachment, neutralization and the induction of protective immunity. Brazilian IBV variants resulting of this genetic variation are present since the 80s and this study aimed to epidemiologicaly analyze and molecularly characterize the existing variants during 2010-2015 and perform a bioinformatics analysis of the available sequences of IBV variants in a 40 year period. Of the 453 samples tested, 61.4% were positive for IBV and 75.9% of them were considered variants and were detected in birds of all ages, distributed in all five Brazilian regions. A fragment of 559-566 bp was obtained from 12 isolates, where BR-I was the predominant variant while only one isolate belonged to the BR-II genotype. Bioinformatics analysis of the sequences of 40 years of Brazilian IBV variants was performed and the ratio of non-synonymous substitutions per non-synonymous site (dn) to synonymous substitutions per synonymous site (ds) dN/dS was calculated. It revealed a predominance of codons with non-synonymous substitutions in the first third of the S1 gene and a dN/dS ratio of 0.6757, indicating that this portion of the gene was under negative selection. Additionally prediction of N-glycosilation sites showed that most of the BR-I variants (from 2003 to early 2014) present an extra site at animoacid position 20, while the newest ones lack this feature.Together these results suggest that IBV Brazilian variants had probably suffered drastic mutations in some points between the years 1983 to 2003 and after achieving an antigenic structure effective enough for invasion and replication in their hosts, the selection processes became silent. / O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) é o agente causador de uma doença aviária economicamente importante. No Brasil, esta doença ocasiona problemas respiratórios, renais e reprodutivos em aves de todas as idades, apesar da vacinação constante com a cepa Massachusetts H120. Esta falha na proteção conferida pela vacina é ocasionada por mutações nos nucleotídeos do gene da glicoproteína da espícula, a qual está envolvida no processo de interação comas células do hospedeiro, a neutralização e a indução de imunidade protetora. As variantes brasileiras resultantes dessa mutação genética estão presentes desde os anos 80 e este estudo teve como objetivo analisar epidemiologicamente e caracterizar molecularmente os vírus variantes existentes durante 2010-2015 e realizar uma análise bioinformática das sequências disponíveis no GenBank em um período de 40 anos. Das 453 amostras analisadas, 61,4% foram positivas para IBV e 75,9% delas foram consideradas variantes e foram detectados em aves de todas as idades, distribuídos em todas as 5 regiões do Brasil. Um fragmento de 559-566 pb foi obtido a partir de 12 isolados, onde BR-I foi a variante predominante ao contrario que apenas um isolado pertencia ao genótipo BR-II. Análise bioinformática de 40 anos de variantes do IBV brasileiros revelou uma predominância de codões com as substituições não sinónimos no primeiro terço do gene S1 e uma relação dN / dS de 0,6757, indicando que esta porção do gene estava sob selecção negativa. Além disso a previsão de pontos de de N-glicosilação mostrou que a maioria das amostras variantes BR-I (entre o 2003 e início de 2014) apresentam um ponto adicional na posição 20, enquanto as variantes mais novas não apresentam esse ponto de nglicosilação. Estes resultados sugerem que as variantes brasileiras teriam sofrido mutações provavelmente drásticas em alguns pontos do genoma, entre os anos de 1983 a 2003 e depois de atingir uma estrutura antigênica eficaz o suficiente para a invasão e replicação em seus hospedeiros, o processo de seleção mudou para seleção negativa.

Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA).La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies.L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats.L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna.La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat.La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades.Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.

Infectious bronchitis virus (IBV) is the causative agent of an economically important disease of poultry. In Brazil this disease causes respiratory, renal and reproductive problems in birds of all ages, despite constant vaccination with the Massachusetts strain H120. This lack of immunological protection is known to be due the genetic variation in the spike glycoprotein of IBV, which is involved in host cell attachment, neutralization and the induction of protective immunity. Brazilian IBV variants resulting of this genetic variation are present since the 80s and this study aimed to epidemiologicaly analyze and molecularly characterize the existing variants during 2010-2015 and perform a bioinformatics analysis of the available sequences of IBV variants in a 40 year period. Of the 453 samples tested, 61.4% were positive for IBV and 75.9% of them were considered variants and were detected in birds of all ages, distributed in all five Brazilian regions. A fragment of 559-566 bp was obtained from 12 isolates, where BR-I was the predominant variant while only one isolate belonged to the BR-II genotype. Bioinformatics analysis of the sequences of 40 years of Brazilian IBV variants was performed and the ratio of non-synonymous substitutions per non-synonymous site (dn) to synonymous substitutions per synonymous site (ds) dN/dS was calculated. It revealed a predominance of codons with non-synonymous substitutions in the first third of the S1 gene and a dN/dS ratio of 0.6757, indicating that this portion of the gene was under negative selection. Additionally prediction of N-glycosilation sites showed that most of the BR-I variants (from 2003 to early 2014) present an extra site at animoacid position 20, while the newest ones lack this feature.Together these results suggest that IBV Brazilian variants had probably suffered drastic mutations in some points between the years 1983 to 2003 and after achieving an antigenic structure effective enough for invasion and replication in their hosts, the selection processes became silent. / O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) é o agente causador de uma doença aviária economicamente importante. No Brasil, esta doença ocasiona problemas respiratórios, renais e reprodutivos em aves de todas as idades, apesar da vacinação constante com a cepa Massachusetts H120. Esta falha na proteção conferida pela vacina é ocasionada por mutações nos nucleotídeos do gene da glicoproteína da espícula, a qual está envolvida no processo de interação comas células do hospedeiro, a neutralização e a indução de imunidade protetora. As variantes brasileiras resultantes dessa mutação genética estão presentes desde os anos 80 e este estudo teve como objetivo analisar epidemiologicamente e caracterizar molecularmente os vírus variantes existentes durante 2010-2015 e realizar uma análise bioinformática das sequências disponíveis no GenBank em um período de 40 anos. Das 453 amostras analisadas, 61,4% foram positivas para IBV e 75,9% delas foram consideradas variantes e foram detectados em aves de todas as idades, distribuídos em todas as 5 regiões do Brasil. Um fragmento de 559-566 pb foi obtido a partir de 12 isolados, onde BR-I foi a variante predominante ao contrario que apenas um isolado pertencia ao genótipo BR-II. Análise bioinformática de 40 anos de variantes do IBV brasileiros revelou uma predominância de codões com as substituições não sinónimos no primeiro terço do gene S1 e uma relação dN / dS de 0,6757, indicando que esta porção do gene estava sob selecção negativa. Além disso a previsão de pontos de de N-glicosilação mostrou que a maioria das amostras variantes BR-I (entre o 2003 e início de 2014) apresentam um ponto adicional na posição 20, enquanto as variantes mais novas não apresentam esse ponto de nglicosilação. Estes resultados sugerem que as variantes brasileiras teriam sofrido mutações provavelmente drásticas em alguns pontos do genoma, entre os anos de 1983 a 2003 e depois de atingir uma estrutura antigênica eficaz o suficiente para a invasão e replicação em seus hospedeiros, o processo de seleção mudou para seleção negativa.

Thesis (MSc (Medical Virology )--University of Stellenbosch, 2004. / 150 leaves printed on single pages, preliminary pages i-vii and numberd pages 1-143. Includes bibliography and figures digitized at 300 dpi grayscale and 300 dpi 24-bit Color to pdf format (OCR), using a Hp Scanjet 8250 Scanner and digitized at 600 dpi grayscale to pdf format (OCR), using a Bizhub 250 Konica Minolta Scanner. / ENGLISH ABSTRACT: The first episode of HIV-1 in South Africa was documented in 1982. Homosexual transmission of the virus was the predominate mode of transmission in an epidemic of mainly HIV-1 subtype Band D infections. To date, no full-length sequences of Subtype D strains from South Africa has been reported. Here we describe the characterization and some of the unique features of the Tygerberg HIV-1 subtype D strains. A near full-length 9 kb fragment was obtained through a one step PCR using high molecular weight DNA. Cloning was done successfully with the pCR-XLTapa cloning kit. Large quantities of plasmid DNA was grown and sequenced on both strands of the DNA. ORF determination and subtyping was followed by standard phylogenetic methods to construct evolutionary phylogenetic trees. Subtyping and similarity plots revealed that the sequences from Tygerberg are pure subtype D. All the Tygerberg strains had intact genes with no premature stop codons. At the tip of the V3 loop, the Tygerberg strains have the GOGO motif. R214 has a more variable vpu gene than the rest of the Tygerberg strains, but is still subtype D in this region. No premature stop codons have been observed in the tat gene and the glycosilation of the strains are less than the subtype D consensus. We are the first to report full-length sequences of HIV-1 subtype D strains from South Africa. The sequences represent non-mosaic genomes of subtype D. Our results confirm that the subtype D sequences from the beginning of the HIV-1 epidemic differ from the Subtype D sequences from recent isolates. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die eerste episode van HIV-1 infeksie in Suid Afrika is in 1982 gedokumenteer. Die epidemie het hoofsaaklik uit subtipe B en D bestaan en was deur homoseksuele kontak oorgedra. Geen vollengte subtipe D DNS volgordes van Suid-Afrika is tans beskryf nie. Hier beskryf ons die karakterisering van vollengte subtipe D stamme asook sommige van die unieke eienskappe van die virusse. Die vollengte 9 kb genoom volgorde was verkry deur 'n eenstap PKR reaksie met hoë molekulêre gewig DNS uit te voer. Die 9 kb fragment was suksesvol gekloneer met behulp van die peR-Xl-TOPO klonerings toetsstel. Groot hoeveelhede plasmied DNS was opgegroei en die nukleotied volgorde bepaal op beide stringe van die genoom. Die stamme was gesubtipeer en filogenetiese analise was uitgevoer met standaard metodes. Die volledige DNS volgordes was bepaal en subtipering het daarop gedui dat die stamme van Tygerberg suiwer subtipe D is. Geen premature stop kodons is in die nukleotied volgordes van die Tygerberg stamme gevind nie. By die draai van die varieerbare deel (V3) het al die Tygerberg stamme die GQGQ motief gehad. R214 het 'n meer varieerbare vpu geen, maar behoort steeds tot die subtipe D groep in die gedeelte. Daar was geen premature stop kodons in die tat geen gevind nie en die glikosilasie van die stamme is minder as die van die konsensus subtipe D stam. Ons is die eerste groep om vollengte subtipe D stamme van Suid-Afrika te karakteriseer. Die DNS volgordes verteenwoordig suiwer subtipe D genome. Ons resultate bevestig die van ander dat die nukleotied volgordes van die ouer subtipe D stamme verskil van die nuwer stamme.