Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:10Z : No. of bitstreams: 1 000844099.pdf: 1423355 bytes, checksum: 8649e82cdb205c9cea62cc32e42d5564 (MD5) / Os processos de reparo da polpa dentária frente a procedimentos conservadores passam, em geral, pelo confronto entre possíveis microrganismos presentes na área da exposição e as células responsáveis pela diferenciação e produção de tecido mineralizado. Entretanto, a literatura ainda necessita de informações sobre o efeito direto de produtos bacterianos sobre este processo. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano (E. coli) sobre células progenitoras da polpa dental, utilizando-se condições basais e com mineralização préinduzida por meio osteogênico. Para isso, células progenitoras caracterizadas foram submetidas a diferentes concentrações de LPS bacteriano (com ou sem indutor da mineralização [lM]), para observação da atividade de fosfatase alcalina (ALP). A concentração mínima de 200 ng/ml, para se verificar alteração de atividade enzimática de ALP, foi usada para se observar os efeitos funcionais de mineralização (pelo alizarin vermelho - ARS), expressão das citocinas IL-1β e TNF-α, além da expressão dos genes DSPP e DMP-1. Os dados quantitativos foram analisados por ANOVA e teste de Tukey. As células em meio osteogênico com as diferentes concentrações de LPS apresentaram baixa atividade da ALP no curto prazo, comparadas às tratadas com meio α-MEM. Estas apresentaram alta atividade, comparadas ao controle. 200 ng/ml do LPS afetaram o processo de mineralização ao longo do tempo, reduzindo a ação de mineralização dos grupos que o associaram ao indutor de mineralização. Houve expressão de IL-1β e TNF-α para todos os grupos em todos os tempos, além disso, para a IL-1β, o grupo que associou os 200ng/ml de LPS com o meio indutor após 7 dias apresentou maior expressão. Houve expressão do gene DMP-1 e não expressão de DSPP e ocorreu uma maior expressão gênica nos grupos tratados com meio indutor da mineralização no gene DMP-1 . Esses achados / Dental pulp repair processes due to conservative procedures are, in general, affected by the conflicts between possible microorganisms at the area of exposure and cells responsible for differentiation and production of mineralized tissue. However, the literature still lacks information on how bacterial products affect these processes directly. The purpose of this study was to evaluate the bacterial lipopolysaccharide (E. coli LPS) effects on dental pulp progenitor cells, regarding the expression of differentiation genes and function of mineralization, using basal conditions and pre-induced mineralization by osteogenic media. Characterized progenitor cells was initially submitted to different LPS concentrations (with or without osteogenic medium [lM]), to observe alkaline phosphatase activity (ALP). The minimal concentration (200 ng/ml) to observe phosphatase enzymatic activity was used to assess the functional mineralization effects (by alizarin red staining - ARS), cytokine production (IL-1β e TNF-α), besides the gene expression for odontoblast differentiation markers (DSPP and DMP-1). Quantitative data will be statistically analyzed by ANOVA and Tukey's test. Cells in osteogenic medium with different concentrations of LPS showed low ALP activity shortterm compared to those treated with α-MEM. These showed high activity, compared to control. 200 ng/ml of LPS did affect the mineralization process over time, reducing the action of mineralization of the groups that have associated LPS with the IM. There was expression of IL-1β and TNF-α for all groups at all times, additionally, IL-1β for the group that has associated 200 ng/ml of LPS with osteogenic media after 7 days showed higher expression. There was expression of DMP-1 and DSPP genes and the expression in groups treated with IM was greater in DMP-1. These findings suggest that the inflammatory potential of LPS on the pulp progenitor cells contribute to an early mineralization ...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-16T18:13:55Z No. of bitstreams: 1 2018_TeresaRaquelTavaresSerejo.pdf: 8267656 bytes, checksum: 096393c0bba7e29dac264b73bc2ffeac (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-17T17:58:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_TeresaRaquelTavaresSerejo.pdf: 8267656 bytes, checksum: 096393c0bba7e29dac264b73bc2ffeac (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-17T17:58:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_TeresaRaquelTavaresSerejo.pdf: 8267656 bytes, checksum: 096393c0bba7e29dac264b73bc2ffeac (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 / As células-tronco mesenquimais (CTMs) desempenham importante função imunorregulatória, o que as tornam promissoras para o tratamento de situações em que o sistema imunológico apresenta-se com resposta exacerbada. Entretanto, os estudos in vivo em que se utilizam CTMs para controlar a resposta imune revelam resultados heterogêneos, impedindo uma conclusão clara e definitiva quanto ao uso clínico dessas células. Foi demostrado em modelo murino que o INF-ɣ é capaz de ativar as CTMs realçando a sua capacidade de suprimir a resposta imunológica. Alguns estudos mostram que as propriedades das CTMs parecem ser influenciadas por receptores do tipo toll (RTT), especialmente RTT 3, que pode polarizar essas células para um estado anti-inflamatório. Outro ponto que tem recebido atenção da comunidade cientifica é o risco de efeito adverso proveniente da infusão das CTMs. Diante do exposto, esse estudo teve por objetivo investigar através de um modelo livre de células, se INF-γ e a sinalização de RTT 3, por uso de Poly (I:C), são capazes de realçar o potencial supressivo de CTMs de lipoaspirado. Para isso, inicialmente, testamos o efeito de INF-γ e Poly (I:C) na capacidade imunossupressiva das CTMs, através de um cocultivo dessas células com células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Em seguida, foi investigado o efeito desses tratamentos sobre a proliferação, potencial migratório e expressão gênica das CTMs. Utilizando um modelo livre de células, investigamos o potencial imunossupressivo do sobrenadante e das microvesículas obtidas de CTMs sobre CMSP. O tratamento dessas células com INF-γ realçou o seu potencial imunossupressivo, o que foi acompanhado por aumento na expressão de IDO e da molécula de adesão ICAM – dois fatores imunorregulatórios. Entretanto, no modelo livre de células, em que utilizamos sobrenadante total ou microvesículas celulares, os produtos obtidos de CTMs tratadas com INF-γ e Poly (I:C) não exerceram maior imunossupressão sobre os linfócitos T, quando comparados aos produtos provenientes das CTMs não tratadas. De modo geral, os resultados obtidos nesse estudo podem nortear caminhos para as novas estratégias terapêuticas livre de células, em que os efeitos benéficos das CTMs são preservados e os riscos oriundos da administração dessas células evitados. Além disso, os nossos resultados também podem servir de base para abordagens que tenham como objetivo realçar as propriedades fundamentais das CTMs, como a propriedade imunorregulatória. / Mesenchymal stem cells (MSCs) have important immunoregulatory roles, which makes them promising for the treatment of conditions in which the immune response is exacerbated. However, in vivo studies that use MSCs to control the immune response reveal heterogeneous results, and compromise any clear and definitive conclusion regarding the clinical use of these cells. In murine models, it has been demonstrated that INF-ɣ is able to promote MSCs activation and enhance their ability to suppress the immune response. Some studies show that MSC’s properties appear to be influenced by toll-like receptors (TLRs), especially TLR3, which can polarize these cells towards an anti-inflammatory state. Another point that has received attention from the scientific community is the adverse effect risk coming from the infusion of MSCs. In this context, the aim of this study was to investigate whether INF-γ and TLR3 signaling by Poly (I:C) are capable of enhancing the immunosuppressive potential of MSCs and their secretome. We initially tested the effects of INF-γ and Poly (I:C) treatments over the immunosuppressive capacity of MSCs in a coculture system of these cells with peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Then, the effect of INF-γ and Poly (I:C) treatments over the proliferation, migration and transcriptional profile of MSCs was investigated. We also investigated the suppressive potential of the MSC-conditioned media and MSC-derived microvesicles over PBMC. Our data indicates that the treatment of MSCs with INF-γ enhanced their immunosuppressive potential, supported by the increased expression of IDO and the adhesion molecule ICAM - two immunoregulatory factors. However, the conditioned media obtained from INF-γ and Poly (I:C) treated MSCs did not exert greater immunosuppression over T lymphocytes, when compared to the supernatant of untreated MSCs. In general, the results obtained in this study may pave the way to new cellfree therapeutic strategies, in which the beneficial effects of MSCs are preserved, and the risks from the administration of these cells are avoided. In addition, our results may also serve as a basis for novel approaches that aim to highlight the fundamental properties of MSCs, such as their immunoregulatory property.

Células tronco são células que possuem a capacidade de originar diferentes tipos celulares maduros. Podem ser classificadas como células tronco embrionárias (células ES), quando isoladas de embriões em estágios iniciais do desenvolvimento; ou como células tronco adultas, quando isoladas de diferentes tecidos de indivíduos adultos. Por outro lado, as células tronco podem ser classificadas conforme o seu potencial de diferenciação celular. Assim, podem ser denominadas como totipotentes, isoladas do embrião, quando este possui até oito células. Células tronco totipotentes possuem a capacidade de gerar todos os tipos celulares oriundos dos três folhetos embrionários, e também podem dar origem aos tecidos formadores dos anexos embrionários. Somente as células totipotentes possuem esta capacidade, e por isso, somente estas, podem gerar um novo indivíduo completo. As células tronco pluripotentes, isoladas de blastocistos ou de carcinomas embrionários, possuem a capacidade de se diferenciar em todos os cerca de 200 tipos de tecidos especializados, que compõem o indivíduo adulto. Contudo, vale ressaltar que as células tronco pluripotentes jamais poderão originar um novo indivíduo. Por fim, existe ainda a classificação de células tronco multipotentes, que possuem a característica de gerar alguns tipos celulares e apresentam uma menor capacidade de multiplicação in vitro, quando comparadas com os outros tipos de células tronco. Estas células podem ser encontradas em diferentes órgãos de indivíduos adultos, como por exemplo, medula óssea, sangue de cordão umbilical, cérebro, fígado e outros. No presente trabalho, visamos o estabelecimento da rotina de manutenção de células tronco embrionárias de camundongo in vitro. Sob a forma indiferenciada e no sistema de indução de diferenciação celular. Para tanto, utilizamos a linhagem de células tronco embrionárias de camundongos, denominada R1. Seguindo protocolos específicos, direcionamos o processo de diferenciação celular para a geração majoritária de células cardíacas e nervosas. Os resultados da diferenciação celular das células tronco embrionárias de camundongos foram analisados a partir da morfologia celular e através da utilização de técnicas de biologia molecular. A obtenção de culturas de células tronco embrionárias enriquecidas em células cardíacas e nervosas comprovou, através do presente trabalho, que os objetivos propostos foram atingidos. Tendo sido estabelecidas, como rotina, em nossa Universidade, as técnicas de cultivo de células ES em estado indiferenciado, e através do método de indução de diferenciação celular in vitro para células cardíacas e nervosas. Os resultados obtidos confirmam os dados descritos na literatura, o que indica que a técnica foi implantada de forma adequada. Assim, adquirimos o domínio das técnicas necessárias para a utilização das ES in vitro como uma nova ferramenta de trabalho podendo ser utilizada em diferentes projetos de pesquisa. / Stem cells are able to originate different cell types. Stem cells can be classified as embryonic stem cells (ES cells) wich can be isolated from pre-implantation embryos; or as adult stem cells wich can be obtained from different adult tissues. On the other hand, stem cells can be classified considering their ability to differentiate into different cell types. Firstly, stem cells can be named as totipotent when isolated from 8 cell stage embryos. Totipotent stem cells are capable to differentiate into all cell types from the three germ layers. Additionally, the totipotent cells can generate the embryonic acessories. This characteristic promotes this cell type as the only cell group able to generate an entire individual. Pluripotent stem cells, isolated from the blastocyst or from embryonic carcinoma (EC), presents the capacity to generate all the 200 cell types that compound the adult individual. It is important to note that the pluripotent stem cells cannot generate a new complete individual. Finally, there is the multipotent stem cells, which can generate some cell types and presents a reduced ability to replicate in vitro when compared with another stem cell types. Multipotent stem cells can be isolated from different adults tissues and organs, for example, bone marrow, umbilical blood cord, brain, liver and others. In the present experiment, we established the routine of in vitro mice embryonic cell culture techniques. On the undifferentiated and into differentiation system. For that we worked with R1 mice stem cell line. Based on described protocols for induction of differentiation system direct to cardiogenesis and neurogenesis. The obtained results from the induction of differentiation were detected by morphological and molecular analyses. The goals of the present study can be verified by the establishment of the ES cell culture system and with the obtained ES culture cells enriched with cardiac and neuronal cells. In this way, we can notice the establishment of the ES cells described techniques by our research group in our University. Our results confirm the described literature data ensuring the well establishment of the ES cell culture system. With this work we acquire the ability to perform in vitro experiments with mice embryonic stem cells, so our group can use these cells as a new research toll which can be applied in different science projects.

As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

Resumo não diponível.

Para produção de vetores virais utiliza-se uma linhagem celular empacotadora (packaging cell line – PCL), que é transfectada com os vetores componentes do sistema. As partículas virais produzidas são, posteriormente, liberadas no sobrenadante de cultura, que é processado, aliquotado e estocado. À exceção de sistemas oncovirais, baseados no vírus da leucemia murina (MLV), não existem PCLs estáveis disponíveis para emprego de vetores baseados em HIV em nível clínico. Desse modo, a transfecção transiente tem sido explorada com o intuito de maximizar a produção de vírus e de minimizar os riscos envolvendo a metodologia. Para tal finalidade, outras linhagens celulares estão sendo testadas como PCL, e variações nos protocolos de transfecção têm sido propostas. Dentro desse contexto, a avaliação da possibilidade de produção de vetores virais em linhagem de célula tronco mesenquimal murina, produzida em nosso laboratório, contribui para a investigação da aplicação potencial dessas células em terapia gênica. Os resultados mostraram que essa linhagem produz vírus em quantidades equivalentes às tradicionais PCL empregadas, sem apresentar aparente efeito sinsicial oriundo da toxicidade de proteínas virais. Tal característica permite que o período de coletas seja expandido, sem comprometimento significativo dos títulos, dentro das normas de biossegurança. Infere-se a partir dessas observações que essa linhagem possa ser uma alternativa interessante como PCL estável. Além dessas características, a sensibilidade à infecção pelos vírus recombinantes sugere que a mesma possa ser também utilizada nos processos de titulação viral. Perspectivas futuras incluem a comparação direta com uma linhagem de célula tronco mesenquimal humana e a caracterização detalhada dos vírus produzidos em ambas linhagens. / The production of viral vectors is done with packaging cell lines (PCL), which are transfected with the vectors composing the viral system. The viral particles produced are liberated in the cell culture medium which is then harvested, processed and stored. Stable PCLs are available for the production, in clinical level, of oncoviral vectors based on Moloney Leukemia Virus; this is not the case, however, for HIV-based vectors. Transient transfection has, thus, been explored with the objective of maximizing virus production and minimizing the risks concerning this methodology. Different cell lines are being tested as PCL and variations in transfection protocols are being proposed. This work aimed at the evaluation of the potential presented by a murine mesenchymal stem cell line, produced in our laboratory, to be employed as PCL for the production of viral vectors. Our results showed that this cell line produces titers as high as the traditional PCL based on 293T cells, and do not present the synsycial effects caused by toxic viral proteins which limits the use of other cell lines. This has allowed extended periods of harvesting, without compromising viral titers. This cell lineage may represent an interesting alternative as stable PCL to be used in retroviral-mediated gene therapy. Besides these aspects, the sensibility to lentivirus infection suggests that it may be used in titering process as well. Future perspectives include the comparison with a human mesenchymal stem cell line and the full characterization of the viruses produced in both lineages.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-17T17:33:43Z No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-31T15:58:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-31T15:58:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) desempenham importante função imunorregulatória, por escapar do reconhecimento imune e suprimir a resposta imunológica. A infusão de CTMs é útil para o tratamento de situações em que o sistema imunológico apresenta resposta exacerbada, como na doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Entretanto, o elevado número de células necessário para a obtenção do efeito terapêutico desejado constitui um grande limitante para o uso clínico dessas células. Para realçar o potencial supressivo das CTMs, duas estratégias têm sido realizadas: o condicionamento (licenciamento) e a terapia combinada de CTMs com imunossupressores. A catelicidina (LL- 37) é um peptídeo antimicrobiano que exerce diversas funções modulatórias sobre a resposta imune, estimulando, em alguns contextos a produção de fatores anti-inflamatórios, como IL-10 e, em outros, estimulando mediadores pró-inflamatórios. Com base nesse contexto, avaliamos, in vitro, se o condicionamento de CTMs pelo peptídeo LL-37 realça o potencial supressivo dessas células e se esse peptídeo poderia ser utilizado como adjuvante das CTMs na supressão de linfócitos T. Além disso, investigamos se esse peptídeo exerce efeito sobre a proliferação e potencial migratório das dessas células. Por fim, investigamos a influência de LL-37 na expressão do receptor tipo toll-3 (RTT3) e no perfil de expressão gênica das CTMs. O condicionamento das CTMs com peptídeo LL-37 não influenciou o potencial supressivo dessas células, entretanto, quando usado como adjuvante, LL-37 aumenta o efeito supressor das CTMs. A catelicidina LL-37 não influenciou a capacidade proliferativa das CTMs, mas quando usada como adjuvante realçou o potencial migratório dessas células. Por fim, investigamos mecanismos moleculares que poderiam sustentar os efeitos funcionais observados. LL-37 induziu aumento da expressão do RTT3 nas CTMs e a hiperexpressão de genes anti-inflamatórios, o que, em parte, pode explicar os efeitos observados. De modo geral, os resultados obtidos nesse estudo, podem servir de base para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras que tenham por objetivo realçar propriedades fundamentais das CTMs, como o efeito imunossupressivo e o potencial migratório, garantindo, ao mesmo tempo, efeito contra microrganismos oportunistas. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Mesenchymal stem cells (MSCs) play an important immunoregulatory function, to escape immune recognition and suppress the immune response. Infusion of MSCs is useful for treatment of conditions where the immune system has exacerbated response, as in graftversus- host disease (GVHD). However, the large number of cells needed to achieve the desired therapeutic effect is a major limitation to the clinical use of these cells. To enhance the suppressive potential of MSCs, two strategies have been carried out: the conditioning (licensing) and combination MSCs therapy with immunosuppressants. The cathelicidin (LL- 37) is an antimicrobial peptide that exerts various modulatory functions on the immune response, stimulating, in some contexts the production of anti-inflammatory factors, such as IL-10, and others, stimulating proinflammatory mediators. Within this context, evaluated in vitro as MSCs conditioning the LL-37 peptide enhances the suppressive potential of these cells and this peptide could be used as adjuvant of MSCs in suppression of T lymphocytes. Furthermore, we investigated whether this peptide has an effect on the proliferation and migration potential of these cells. Finally, we investigated the influence of LL-37 in the toll-like receptor type 3 expression (TLR3) and gene expression profile of MSCs. The conditioning of MSCs with LL-37 peptide did not affect the suppressive potential of these cells, however, when used as adjuvant, LL-37 increases the suppressive effect of MSCs. The LL-37 cathelicidin did not affect the proliferative capacity of MSCs, but when used as an adjuvant enhanced the migration potential of these cells. Finally, we investigate molecular mechanisms that could sustain the observed functional effects. LL-37 induced increased expression in MSCs TLR3 and overexpression of anti-inflammatory genes, which in part may explain the observed effects. In general, the results obtained in this study could serve as the basis for the development of innovative therapeutic approaches which aim to enhance the fundamental properties of MSCs as immunosuppressive effect and migration potential, ensuring at the same time, effect against opportunistic microorganisms.

Orientador: Mauricio Barbanti Duarte José / Coorientador: Lawrence Charles Smith / Banca: Fabiana Fernandes Bressan / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: José Antonio Visintin / Banca: Eveline dos Santos Zanetti / Resumo: Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida ("induced pluripotent stem cells" - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Deer have been enduring pressures on their natural habitat, which causes segregation between populations and reduced genetic diversity. Although cryopreservation and storage of gamete and embryos can be used as a strategy for the preservation of wild populations, few studies have been successful due to difficulties to recover these materials. Recent studies in mice and humans have shown that induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from somatic cells can be differentiated into germ cells, oocytes, and spermatozoa. Thus, we hypothesize that viable gametes could also be obtained from somatic cells in deer. To date, iPSC cells have not been derived in cervids and therefore our main goal is to establish protocols to obtain stable iPSC lines from deer somatic cells. The process of reprogramming somatic cells into iPSC cells is facilitated by the use of adult stem cells that still have the multipotent capacity. As little is known about multipotent stem cells in deer, the first objective of this study was to obtain biopsies from various tissues with multipotent differentiation capacity. Among these tissues are the stem cells from adipose tissue, antler, and skin. Once primary cultures were established, cells from each tissue were evaluated for doubling time and then induced in vitro to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes lineages in order to assess their plasticity. Moreover, the expression of molecular markers was characterized by immunocytochemistry (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) and RT-PCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). The second objective of this study was to derive iPSC lineages from multipotent stem cells in deer. The derivation of iPSC lines was tested by transfection with four transcription factors (c-Myc, Klf4, Oct4, and Sox2) using nucleofection, lipofection or lentiviral re... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Bruno Das Neves Cavalcanti / Banca: Cláudio Antonio Talge Carvalho / Banca: Aletéia Massula de Melo Fernandes / Resumo: Os processos de reparo da polpa dentária frente a procedimentos conservadores passam, em geral, pelo confronto entre possíveis microrganismos presentes na área da exposição e as células responsáveis pela diferenciação e produção de tecido mineralizado. Entretanto, a literatura ainda necessita de informações sobre o efeito direto de produtos bacterianos sobre este processo. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano (E. coli) sobre células progenitoras da polpa dental, utilizando-se condições basais e com mineralização préinduzida por meio osteogênico. Para isso, células progenitoras caracterizadas foram submetidas a diferentes concentrações de LPS bacteriano (com ou sem indutor da mineralização [lM]), para observação da atividade de fosfatase alcalina (ALP). A concentração mínima de 200 ng/ml, para se verificar alteração de atividade enzimática de ALP, foi usada para se observar os efeitos funcionais de mineralização (pelo alizarin vermelho - ARS), expressão das citocinas IL-1β e TNF-α, além da expressão dos genes DSPP e DMP-1. Os dados quantitativos foram analisados por ANOVA e teste de Tukey. As células em meio osteogênico com as diferentes concentrações de LPS apresentaram baixa atividade da ALP no curto prazo, comparadas às tratadas com meio α-MEM. Estas apresentaram alta atividade, comparadas ao controle. 200 ng/ml do LPS afetaram o processo de mineralização ao longo do tempo, reduzindo a ação de mineralização dos grupos que o associaram ao indutor de mineralização. Houve expressão de IL-1β e TNF-α para todos os grupos em todos os tempos, além disso, para a IL-1β, o grupo que associou os 200ng/ml de LPS com o meio indutor após 7 dias apresentou maior expressão. Houve expressão do gene DMP-1 e não expressão de DSPP e ocorreu uma maior expressão gênica nos grupos tratados com meio indutor da mineralização no gene DMP-1 . Esses achados / Abstract: Dental pulp repair processes due to conservative procedures are, in general, affected by the conflicts between possible microorganisms at the area of exposure and cells responsible for differentiation and production of mineralized tissue. However, the literature still lacks information on how bacterial products affect these processes directly. The purpose of this study was to evaluate the bacterial lipopolysaccharide (E. coli LPS) effects on dental pulp progenitor cells, regarding the expression of differentiation genes and function of mineralization, using basal conditions and pre-induced mineralization by osteogenic media. Characterized progenitor cells was initially submitted to different LPS concentrations (with or without osteogenic medium [lM]), to observe alkaline phosphatase activity (ALP). The minimal concentration (200 ng/ml) to observe phosphatase enzymatic activity was used to assess the functional mineralization effects (by alizarin red staining - ARS), cytokine production (IL-1β e TNF-α), besides the gene expression for odontoblast differentiation markers (DSPP and DMP-1). Quantitative data will be statistically analyzed by ANOVA and Tukey's test. Cells in osteogenic medium with different concentrations of LPS showed low ALP activity shortterm compared to those treated with α-MEM. These showed high activity, compared to control. 200 ng/ml of LPS did affect the mineralization process over time, reducing the action of mineralization of the groups that have associated LPS with the IM. There was expression of IL-1β and TNF-α for all groups at all times, additionally, IL-1β for the group that has associated 200 ng/ml of LPS with osteogenic media after 7 days showed higher expression. There was expression of DMP-1 and DSPP genes and the expression in groups treated with IM was greater in DMP-1. These findings suggest that the inflammatory potential of LPS on the pulp progenitor cells contribute to an early mineralization ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T18:57:04Z : No. of bitstreams: 1 santinoni_cs_me_araca_parcial.pdf: 217418 bytes, checksum: c2320ac05362883a971d3134049288f9 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-07-02T12:36:05Z: santinoni_cs_me_araca_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-02T12:37:29Z : No. of bitstreams: 1 000696925_20200101.pdf: 218230 bytes, checksum: 32560a67e9778b2825cc4d3b11ab4887 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O propósito deste estudo foi avaliar, histologicamente e histometricamente, o processo de cicatrização óssea em defeitos de tamanho crítico (DTC), criados cirurgicamente em calvárias de ratos e tratados com aspirado de medula óssea (AMO), laser em baixa intensidade (LLLT) ou a associação de ambas as terapias. 40 ratos foram divididos em 4 grupos: C (controle), AMO, LLLT e AMO/LLLT. Um DTC de 5 mm de diâmetro foi criado na calvária de cada animal. No Grupo C, o defeito foi preenchido com coágulo sangüíneo somente. No Grupo AMO, o defeito foi preenchido com AMO. Nos grupos LLLT e AMO/LLLT, o defeito recebeu aplicação da LLLT (InGaAlP laser), foi preenchido com coágulo sanguíneo e AMO, respectivamente, e recebeu novamente a aplicação da LLLT. Todos os animais foram submetidos à eutanásia aos 30 dias pós-operatórios. Análises histomorfométrica, usando software de análise de imagem, e histológica foram realizadas. A Área de Osso Neoformado (AON) foi calculada como uma porcentagem da área total do defeito original. Os dados foram analisados estatisticamente (ANOVA, Tukey, p<0,05). O Grupo AMO/LLLT (38,92 ± 7,12%) apresentou AON significativamente maior que os grupos C (13,75 ± 4,32%), AMO (28,71 ± 10,42%) e LLLT (18,40 ± 7,41%). O Grupo AMO apresentou AON significativamente maior que o controle. Não foram observadas diferenças significativas na AON dos grupos LLLT e C. Dentro dos limites desse estudo, pode-se concluir que a associação AMO/LLLT produziu formação óssea significativamente maior em DTC cirurgicamente criados em calvárias de ratos quando comparada ao controle ou a cada tratamento isoladamente / The purpose of this study was to analyze, histologically and histometrically, the influence of bone marrow aspirate (BMA), low-level laser therapy (LLLT) or their combination on bone healing in surgically created critical-size defects (CSD) in rat calvaria. 40 rats were divided into 4 groups: C (control), BMA, LLLT and BMA/LLLT. A 5 mm diameter CSD was created in the calvarium of each animal. In Group C, the defect was filled by blood clot only. In Group BMA, the defect was filled with bone marrow aspirate. In groups LLLT and BMA/LLLT, the defect received laser irradiation (InGaAlP laser), was filled with blood clot or BMA respectively, and then irradiated again. All animals were euthanized at 30 days postoperatively. Histometric, using image analysis software, and histologic analyses were performed. Amount of newly formed bone (NFB) was calculated as a percentage of the total area of the original defect. Data were statistically analyzed (ANOVA, Tukey p<0.05). Group BMA/LLLT (38.92 ± 7.12%) had significantly greater NFB than groups C (13.75 ± 4.32%), BMA (28.71 ± 10.42%) and LLLT (18.40 ± 7.41%). Group BMA presented significantly greater NFB than control, while group LLLT did not. Within the limits of this study, it can be concluded that the combination of BMA/LLLT yielded significantly greater bone formation in surgically created CSD in rat calvaria when compared to control, or either treatment alone