Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-10-10T20:16:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT). 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Não existem mecanismos precisos conhecidos sobre como L. amazonensis modula a resposta imunológica para que os macrófagos (MФ) infectados com L. amazonensis se tornem refratários à ativação por células T efetoras. Aqui, nós investigamos o possível mecanismo regulador que Leishmania provavelmente pode induzir em MФ residentes durante a interação precoce, de modo a impedir ativação das células. Neste estudo, analisou-se a expressão de CD39 e CD73, por citometria de fluxo, em MФ peritoneais murinos infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e também a porcentagem dessas células que expressam a CD39 e CD73 foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em 72hrs inativos os MФ tiveram baixa expressão de CD73. Curiosamente, no entanto, ao contrário de MФ tratados com LPS os infectados com L. amazonensis expressaram altos níveis de CD73. Esta informação foi posteriormente validada pelos resultados de estudos no contexto ex-vivo que mostrou igualmente que MФ infectados são predominantemente CD73+. Quando as atividades enzimáticas de CD39 e CD73 foram bloqueadas, tal como pelo uso de DIDS e MAD αβ, tanto a infecção quanto o número de amastigotas diminuiu significativamente após 48 horas de incubação. Da mesma forma, a inibição dos receptores de adenosina A2a e A2b de ZM241385 e MRS1754 também apresentou os mesmos efeitos sobre a sobrevivência do parasito e infectividade. Em estudo posterior, em busca de um possível papel da HIF- 1α na infecção por Leishmania, investigamos os efeitos da FM19G11, inibidor do HIF- 1α, na expressão de CD39 e CD73, bem como na infecção parasitária . Observou-se que, apesar de HIF - 1α poder influenciar na sobrevivência do parasito, os seus efeitos sobre a expressão de CD39 e CD73 não eram visíveis. Também foi avaliada, por PCR em tempo real, a expressão de receptores de adenosina em populações infectadas, nas quais não se observou nenhuma mudança significativa na expressão após 24 horas de infecção. Além disso, também foi avaliada a produção de citocinas, tais como TNF- α e IL-10 a partir da produção de NO nos grupos tratados. Surpreendentemente, não houve variação nos níveis destes mediadores, sugerindo a existência de outros mecanismos independentes da mediação por citocina para produção de Óxido Nítrico, tais como a produção de ROS ou efeitos leishmanacidas independentes do triptofano. Concluindo, nossos dados mostram que a infecção por L. amazonensis regula a expressão CD73 durante 24 horas de infecção e sua sobrevivência depende de atividades enzimáticas, bem como de receptores A2a e A2b. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT:Cutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. amazonensis is characterized by intense immune-suppression and uncontrolled parasite multiplication in experimental models and is usually severe in humans ranging from cutaneous to diffuse cutaneous leishmaniasis. There are no precise mechanisms known how L. amazonensis modulates immune response so that macrophages (MФ) infected with L. amazonensis are refractory to activation by effector T cells. Here, we investigated the possible regulatory mechanism that Leishmania can likely induce in host MФ during early interaction so as to prevent their host cells from activation. In this study, we analyzed the expression of CD39 and CD73, by flow cytometry, in murine peritoneal MФ infected with metacyclic promastigotes of L. amazonensis and percentage of those cells expressing CD39 and CD73 was evaluated. Our results showed that 72hrs rested MФ down regulated CD73 expression. Interestingly, however, unlike LPS treated MФ, L. amazonensis infected MФ up regulated CD73 expression. This data was further validated by the findings from in ex-vivo studies which equally support that infected MФ are predominantly CD73 positive. When CD39 and CD73 enzymatic activities were blocked such as by the use of DIDS and αβ MAD, both infection and amastigote number decreased significantly within 48hrs of incubation. Similarly, inhibition of adenosine receptors A2a and A2b by ZM241385 and MRS1754 also had the same effects on the parasite survival and infection. In another study, in search of a possible role of HIF-1α in Leishmania infection, we investigated the effects of FM19G11, inhibitor of HIF-1α, on expression of CD39 and CD73 as well as parasitic infection. We observed that although HIF-1α can influence in the parasite survival, their effects on CD39 and CD73 expression were not visible. We also evaluated the expression of adenosine receptors in infected population by real time PCR in which we observed no significant change in the expression after 24hrs of infection. Moreover, we also evaluated cytokine production such as TNF-alpha, IL-10 and NO production from the treated groups. Surprisingly, there was no alternation in the levels of these mediators suggesting other mechanisms, independent of cytokine mediated nitric oxide production such as ROS production or tryptophan independent oxygen anti-leishmanacidal effects, involved in it. In conclusion, our data show that L. amazonensis infected up regulates CD73 expression during 24hrs of infection and its survival is dependent on enzyme activities as well as A2a and A2b receptors.

Uma das populações de células imunológicas mais abundantes no útero durante a gestação é a das células Natural Killer uterinas (uNK) que, apesar de apresentarem grânulos citoplasmáticos ricos em perforina e granzimas, não apresentam atividade citotóxica durante uma gestação normal. As células uNK são importantes produtoras de fatores angiogênicos que promovem a dilatação e o remodelamento das artérias uterinas resultando no aumento do fluxo sanguíneo para a unidade feto-placentária em desenvolvimento. A administração sistêmica de Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli em camundongos pode desencadear a ativação de cicloxigenase-2 (COX-2) levando a um aumento nos níveis de prostaglandinas bem como um desbalanço das citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no útero gestante alterando a atividade normal das células imunológicas refletindo em uma alteração na homeostase uterina. O presente trabalho teve como o objetivo avaliar se a administração do inibidor seletivo de COX-2 pode interferir nos efeitos do LPS no útero gestante, nos vasos sanguíneos deciduais, nas células uNK e na quantidade e qualidade da prole; contribuindo assim para a elucidação dos mecanismos da SRIS durante a gestação. A administração de LPS causou excessivo influxo de células uNK imaturas no útero gravídico, além de causar diminuição do número de células uNK maduras concomitante ao aumento de células uNK alteradas. Tais efeitos do LPS foram prevenidos pelo pré-tratamento com Nimesulida. A inibição da COX-2 também impediu a liberação de perforina por essas células bem como a diminuição da expressão de α-actina em vasos sanguíneos uterinos causados pelo LPS. O número de filhotes nascidos de mães tratadas com nimesulida+LPS no período mediano da gestação foi ainda menor do que o número de filhotes que nasceram das mães que receberam apenas LPS no mesmo dia de gestação. A injeção apenas de nimesulida não causou nenhum efeito na prole, levando-nos a acreditar que as alterações fisiológicas após a inflamação induzida por LPS são de fundamental importância para o restabelecimento da homeostase do útero, a fim de manter a gestação a termo. Fator de crescimento placentário (PGF) é um fator de crescimento angiogênico pleiotrópico que se encontra elevado durante a gravidez. Embora os padrões normais e anormais de PGF plasmático materno já estejam descritos na literatura, o papel preciso do PGF na angiogênese útero-placentária são indefinidos. Muitas mulheres que expressam baixos níveis de PGF, sobretudo na metade da gravidez, apresentam progressão para síndromes hipertensivas como a pré-eclâmpsia. Esse tipo de complicação gestacional está relacionada com o aumento da incidência de doenças cardiovasculares (CV) pós-parto tanto para mães quanto para os filhos, entretanto, não se sabe se baixos níveis de PGF aumentam o risco de doenças CV. Para avaliar a hipótese de que a deficiência de PGF limita a adaptação CV durante o período gestacional tardio contribuindo para o aumento do risco de complicações cardiovasculares, foram analisadas a estrutura e função do sistema cardiovascular em camundongos C57BL/6 (Pgf^+/+) e Pgf^-/- no período gestacional. Além disso, estruturas vasculares cerebrais foram analisadas pela técnica de moldagem vascular por perfusão com polímero e os animais dos dois grupos experimentais foram submetidos a testes comportamentais. A avaliação hemodinâmica por radiotelemetria mostrou que as mães, no cruzamento Pgf^-/- x Pgf^-/-, tiveram um declínio maior e mais sustentado na pressão arterial média em meados de gravidez do que as mães do grupo controle, mas a recuperação após a implantação do transmissor era rara. A avaliação hemodinâmica por pletismografia de cauda mostrou que os animais Pgf^-/- apresentaram maior pressão arterial (PA) no início e final da gestação com um maior intervalo de queda da PA após o período da implantação do blastocisto. Menor débito cardíaco materno e volume sistólico foram observados após o meio da gestação dos animais knockout quando comparados com animais controle. Além disso, esses animais não apresentaram o aumento no peso do ventrículo esquerdo (VE) naturalmente observado em Pgf^+/+ no final da gestação. A expressão gênica de Nos3 e Nos2 no VE é maior nos animais Pgf^-/- durante o período mediano da gestação. Foram observadas anomalias estruturais glomerulares e hipertrofia renal em camundongos Pgf^-/- não gestantes, durante a gestação e pós-parto. Assim, a deficiência de PGF limita adaptações fisiológicas e estruturais do sistema CV e Renal durante a gestação de camundongos. Estes resultados podem ter paralelos na gravidez humana e se relacionam com o aumento do risco de complicações CV pós-parto, que são sequelas de gestações de pré-eclâmpsia. A técnica de moldagem vascular com polímero revelou que a estrutura vascular central do cérebro da prole Pgf^-/- é deficiente, e testes comportamentais mostraram que isso tem reflexo em déficit cognitivo. Assim, a deficiência gestacional PGF também prejudica a regulação da pressão arterial materna e desenvolvimento vascular em órgãos essenciais da progênie como o cérebro. / One of the most abundant immunologic cell types in early decidua is the uterine Natural Killer (uNK) cell that despite the presence of cytoplasmic granules rich in perforin and granzymes does not degranulate in normal pregnancy. UNK cells are important producers of angiogenic factors that permit normal dilation of uterine arteries to provide increased blood flow for the growing feto-placental unit. Gram-negative bacteria Lipopolysaccharide (LPS) administration can trigger cyclooxygenase-2 (COX-2) activation leading to an increase in prostaglandin level and an imbalance of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines impairing the normal immune cells activity as well as uterine homeostasis. The present study aimed to evaluate if COX-2 inhibitor can alter the effect of LPS on the pregnant uterus, on blood vessels of the decidua, on uNK cells and on litter size; thus contributing to the elucidation of Systemic Inflammatory Syndrome mechanisms during pregnancy. The LPS administration caused excessive immature uNK cells influx in pregnant uterus as well as a decrease in mature uNK cells number concomitantly with altered uNK cells increasing. Such LPS effects could be prevented by the nimesulide pretreatment. The COX-2 inhibition has also prevented perforin releasing by these cells as well as the α-actin down-regulation in uterine blood vessels caused by LPS. The number of pups born from mothers treated with Nimesulide + LPS in mid-pregnancy was smaller than the number of pups born of mothers who received only LPS on the same gestation day. The injection of nimesulide itself showed no effect in the offspring, leading us to believe that the physiological changes after inflammation induced by LPS are of fundamental importance for the restoration of uterine homeostasis in order to maintain pregnancy to term. / Placental growth factor (PGF) is a pleiotropic angiogenic growth factor elevated during pregnancy. Although normal and abnormal patterns of maternal plasma PGF are well known, the precise roles of PGF in uteroplacental angiogenesis, blood pressure regulation, vasculogenesis, as well as cardiovascular (CV) and renal adaptation are undefined. Many women who express low levels of PGF over mid-pregnancy, progress to the acute, emergency, hypertensive syndrome of preeclampsia (PE). This kind of gestational complication elevate postpartum cardiovascular disease risks for both mothers and offspring. In many pre-eclamptic women, plasma placental growth factor concentrations are lower than normal, however, it is unknown if lower PGF elevates postpartum CV risk. We hypothesized that PGF deficiency limits maternal CV adaptations during mid-late pregnancy and contributes to postpartum maternal CV risk elevation. Cardiovascular function and structure were evaluated in Pgf^-/- and C57BL/6 (B6/Pgf^+/+) mice across pregnancy and postpartum. Furthermore, cerebral vascular structures were analyzed by polymer vascular casting technique and animals from both experimental groups were subjected to behavioral testing. Hemodynamic assessment by radiotelemetry showed Pgf^-/- x Pgf^-/- dams had a larger and more sustained mid-pregnancy decline in mean arterial pressure than controls but recovery post-transmitter implantation was rare. Hemodynamic assessment by tail cuff plethysmography showed that Pgf^-/- mice had higher blood pressure in early and late pregnancy with a longer interval of depressed systolic pressure after implantation. Lower maternal cardiac output and stroke volume were present after mid-gestation versus Pgf^+/+. Pgf^-/- left ventricular (LV) mass was less than in Pgf^+/+ and expected gestational increases in LV mass were observed only in Pgf^ +/+. Nos3 and Nos2 expression were elevated in midgestation Pgf^-/- LV. Structural anomalies were present in virgin Pgf^-/- glomeruli and renal hypertrophy was associated with gestation and postpartum. Thus, PGF deficiency limits physiological and structural adaptations of the mouse maternal CV and renal systems over late pregnancy. These results may have parallels in human pregnancy and relate to the postpartum gains in CV risk that are sequelae to pre-eclamptic gestations. Polymer vascular casting of offspring brains and behavioral testing revealed aberrant central vascular structure and major cognitive deficits in Pgf^-/-. Thus, gestational PGF deficiency additionally impairs regulation of maternal arterial pressure and vascular development in key organs of progeny such as the brain. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O gene KIR2DL4 codifica um importante receptor de células Natural Killer (NK). O único ligante de KIR2DL4 conhecido é a molécula HLA-G, expressa principalmente na placenta, modulando a ação das células NK durante a gestação. O gene KIR2DL4 parece ser bastante variável, quando considerado os bancos de dados que armazenam suas sequências conhecidas, porém não está claro o nível de diversidade deste gene em populações reais e heterogêneas. Polimorfismos presentes no gene KIR2DL4 poderiam influenciar a interação entre KIR2DL4 e HLA-G, modificando a ação das células NK. Neste estudo exploramos a variabilidade genética de KIR2DL4 em 157 indivíduos oriundos do Estado de São Paulo/Brasil. Devido à alta similaridade de sequências entre os genes KIR, erros de genotipagem são esperados quando se utiliza sequenciamento de segunda geração. Por este motivo, desenvolvemos uma abordagem para classificar cada leitura com base em sequências KIR conhecidas, endereçando-as ao gene mais provável. Também utilizamos o painel SNPforID 34-plex para avaliar a ancestralidade dessas amostras. Considerando o segmento completo desse gene, indo da região 5’URR até a 3’UTR, com aproximadamente 13kb, o gene KIR2DL4 se mostrou pouco polimórfico, com 152 pontos de variações identificados (MAF 1%). Esses pontos de variação estão organizados em 32 haplótipos estendidos que codificam 13 proteínas diferentes. Foram encontrados 11 haplótipos na região promotora, sendo que 8 possuem MAF maior que 1%. Na região codif... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: KIR2DL4 is the most unusual Killer Cell Immunoglobulin-Like receptor (KIR) family member in terms of structure, expression, and signaling properties. The only known KIR2DL4 ligand is HLA-G, and polymorphisms might disrupt this interaction. KIR2DL4 variability is not well explored in admixed populations. Here we explored KIR2DL4 exon variability in 157 individuals from the State of São Paulo/Brazil. Because of sequence similarity with other KIR genes, it is expected genotyping errors when using secondgeneration sequencing. We developed an approach to score each read based on known KIR sequences, addressing them to the most likely locus. We evaluated the SNPforID 34-plex panel to assess ancestry. The methodology was applied to survey the variability of a very admixed population, such as Brazilian, counting with 157 samples of São Paulo State. Considering a segment of about 13-kb, KIR2DL4 gene was conserved with few different and frequent sequences. Overall, 152 variable sites were detected, arranged in 32 haplotypes codifying 13 protein. We found 11 promoter haplotypes, 8 with a frequency greater than 1%. In the coding region we detected 70 haplotypes, four of which correspond to 50% of the coding sequences (KIR2DL4 * 0080204, * 008105, * 001, * 005). In the 3'UTR region, 14 haplotypes were identified with MAF greater than 1%. The KIR2DL4 coding region was the most variable segment. We observed that KIR2DL4 variability is strongly influenced by the sample ancestry background. K... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre