Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-26T12:03:49Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Aline Michelle Barbosa Bafica.pdf: 3028179 bytes, checksum: 666e7950c3b0e2cf32d5a4eddeb77dfe (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T12:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Aline Michelle Barbosa Bafica.pdf: 3028179 bytes, checksum: 666e7950c3b0e2cf32d5a4eddeb77dfe (MD5) / Introdução: Neste estudo, nós avaliamos os efeitos de alguns antígenos do S. mansoni sobre a resposta imune induzida pelo antígeno solúvel de Leishmania (SLA) em células de pacientes com LC. Métodos: CMSP foram estimuladas in vitro com SLA e cultivadas na presença ou ausência dos antígenos recombinantes do tegumento do S. mansoni, Sm29 e SmTSP-2 e também do PIII, uma fração do antígenos solúvel do verme adulto do S. mansoni. As citocinas do padrão Th1, Th2 e regulatória foram medidas nos sobrenadantes das culturas, utilizando-se a técnica de ELISA sanduíche. Adicionalmente, CMSP foram marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos para a avaliação do fenótipo destas células, utilizando-se os anticorpos para marcação de CD4, CD8, CD25, CD28, CTLA-4 e Foxp3 em linfócito T e CD14, CD16, HLA-DR, CD80 e CD86 em monócitos. Para tanto se utilizou a técnica de citometria de fluxo e as análises foram feitas pelo programa FlowJo. Resultados: A adição dos antígenos do S. mansoni às culturas de CMSP resultou na redução dos níveis de IFN-γ em 37 a 50% dos pacientes. Embora, em menor extensão, os antígenos também foram capazes de diminuir a produção de TNF. Comparando os grupos de pacientes que tiveram ou não redução na produção de IFN-γ e TNF em culturas estimuladas com SLA, pela presença dos antígenos de S. mansoni, observou-se que não houve diferença significativa no número e tamanho das lesões e nem nos níveis basais de IFN-γ e TNF. Não houve também diferença significativa nos níveis de IL-10 e IL-5 em resposta aos antígenos de S. mansoni entre os grupos que apresentaram ou não redução na produção de IFN-γ e TNF em resposta aos antígenos do S. mansoni. Adicionalmente, foi observado que o uso do rSm29 nas culturas de CMSP de pacientes com LC resultou em diminuição da expressão de HLA-DR em monócitos não-clássicos (CD14+CD16++), no entanto a adição de PIII diminuiu a expressão desta molécula em monócitos clássicos (CD14++CD16-) e intermediários (CD14++CD16+). A adição do PIII e do rSmTSP-2 resultou na regulação da expressão de CD80 em monócitos não-clássicos e da expressão de CD86 em monócitos intermediários, respectivamente. Os antígenos rSmTSP-2 e PIII aumentaram a expressão de CTLA-4 em células TCD4+ e também expandiram a frequência de células regulatórias TCD4+CD25highFoxp3+. Conclusão: Os antígenos usados neste estudo, modularam a resposta pro-inflamatória induzida pelo SLA in vitro em um grupo de pacientes com LC, e os antígenos rSmTSP-2 e PIII foram capazes de diminuir o estado de ativação de monócitos e também aumentar a expressão de moléculas moduladoras em linfócitos T.

Submitted by MARIANA MIZIARA DE ABREU TEODORO null (marimiziara@gmail.com) on 2016-03-21T18:48:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mariana Miziara de Abreu Teodoro.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T20:37:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 teodoro_mma_me_bot.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T20:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 teodoro_mma_me_bot.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Doença de Chagas (DC), cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), tornou-se nos últimos anos um grave problema de saúde pública, mesmo em países não-endêmicos. Um importante desafio para os pesquisadores da doença de Chagas é estabelecer os eventos que levam alguns pacientes a desenvolver a doença crônica assintomática, ou forma indeterminada, enquanto outros evoluem para uma doença severa, com lesões em tecidos cardíacos ou gastrointestinais. Alguns estudos têm sugerido que a ausência de sintomas clínicos em indivíduos com a forma crônica indeterminada está associada a um controle eficaz da resposta imune efetora contra o parasita, que evita uma resposta inflamatória excessiva, o que resultaria em lesão tecidual. Não existem estudos com o objetivo de confirmar este mecanismo em pacientes com a forma digestiva da DC, especialmente em relação ao controle modulador de mecanismos efetores envolvendo células Th17, por células Treg. No presente estudo, nós avaliamos em pacientes com a forma digestiva da DC e em pacientes com a forma indeterminada ou assintomática a taxa de ativação Th17/Treg, através da avaliação da freqüência de células Th17 e Treg por citometria de fluxo; da expressão do mRNA para Rorγt e Foxp3, fatores de transcrição envolvidos na diferenciação dessas células, respectivamente; bem como os níveis de IL-17a e IL-10 em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC’s). Foi demonstrado no presente estudo, que em pacientes com a forma digestiva da DC há um desequilíbrio na taxa de ativação de células Th17/Treg, favorecendo o perfil Th17, enquanto que em pacientes com a forma indeterminada, este desequilíbrio favorece o perfil Treg. Os nossos resultados apoiam a hipótese de que o desequilíbrio na taxa de ativação Th17/Treg observado no grupo de pacientes digestivos, favorecendo Th17 em detrimento de Treg, geraria um ambiente não regulador, que resulta em uma resposta inflamatória exacerbada, responsável pelas lesões dos tecidos gastrointestinais apresentadas por estes pacientes. / Chagas disease (CD) whose etiological agent is the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in recent years became a serious problem of public health even in nonendemic countries. One important challenge for the researchers of Chagas disease is to establish the events that lead some patients to develop asymptomatic or indeterminate chronic disease, while others undergo severe disease with lesions in cardiac or gastrointestinal tissues. Some studies have suggested that absence of clinical symptoms in individuals with the indeterminate chronic form is associated to a fine control of effector immune responses against the parasite that avoid a perpetuated inflammatory process which results in tissue injury. There are no studies aiming to confirm this mechanism in patients with digestive form of the disease, particularly in relation to the modulatory control by Treg cells of effector mechanisms involving Th17. Here, we studied in patients with the digestive form of CD and in those with the indeterminate or asymptomatic form of the disease, the ratio Th17/Treg activation by evaluating the frequency of Th17 and Tregs cells by flow cytometry, mRNA expression for Rorγt and Foxp3, the transcription factors involved in the differentiation of these cells respectively as well as the levels of IL-17a and IL-10 in peripheral blood mononuclear cells culture supernatants. We showed that in patients with digestive form of the disease there is an imbalance in the ratio Th17/Treg cells activation in favor of Th17, while in patients with the indeterminate form, this imbalance favour Treg activation. Our findings support the hypothesis that in contrast with indeterminate patients a non regulatory environment observed in patients with digestive CD, which results in an exacerbated inflammatory response exerted by Th17, due to lower Treg activation, may be responsible for tissue lesions in these patients. / FAPESP: 2013/02223-7

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-12-19T17:52:15Z No. of bitstreams: 2 Tese - Maurício Barcelos Costa - 2014.pdf: 740997 bytes, checksum: fec1f12612ff6a41fbbbee9640600a35 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Júlio, falta o arquivo da tese. on 2016-12-26T12:31:54Z (GMT) / Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-01-02T15:41:57Z No. of bitstreams: 2 Tese - Maurício Barcelos Costa - 2014.pdf: 10731375 bytes, checksum: d59433128feb9bc7facacb81cb311a98 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-03T09:40:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Maurício Barcelos Costa - 2014.pdf: 10731375 bytes, checksum: d59433128feb9bc7facacb81cb311a98 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-03T09:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Maurício Barcelos Costa - 2014.pdf: 10731375 bytes, checksum: d59433128feb9bc7facacb81cb311a98 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Leprosy is a complex, chronic, infectious dermato-neurological disease that affects the skin and peripheral nerves especially during acute immune-inflammatory episodes known as type 1/T1R and type 2/T2R reactions. There is no experimental model for leprosy and leprosy skin lesions have been extensively used to unravel its multifaceted immunopathological mechanisms.This study investigated in situ expression of two distinct cell populations with important immunoregulatory roles: T regulatory (Treg) cells and mast cells (MC) in diverse skin diseases with emphasis on leprosy T1R and T2R. For the Treg cell study, 154 skin biopsies from 114 participants belonging to 3 groups were investigated: 1. Leprosy (n=74), 56 T1R (28-paired biopsies reactionfree/reactional from the same patient, 28 single reactional biopsy), 18 T2R (12 pairedreaction-free/reactional lesions, 6 single reactional biopsy); 2. Dermatoses: (n=29) noninfectious and cutaneous infectious diseases; 3. Normal controls: skin fragment of mammoplasty from healthy females that had cosmetic surgery. Double immunohistochemical detection of Treg cells was performed with automated platform for CD25 and Foxp3 staining. Quantifications of double immunostained Treg cells was performed (values expressed by mm2 ) blinded to the participants’ clinical status. For the mast cell study 80 skin biopsies from 3 groups were investigated: 40 newly diagnosed untreated leprosy patients (18 reaction-free, 11 T1R, 11 T2R), 29 patients with other dermatoses (the same as for Treg study) and 11 normal skins. Toluidine blue stained intact and degranulated MC counts/mm2 ; streptavidin-biotin-peroxidase immunostaining was used to detect tryptase/try+ and chymase/chy+ MCs and their density (median optical density) was evaluated. Results: Treg study: Not one CD25+ Foxp3+ Treg cell was seen in any of the 11 normal skin sections while variable numbers were detected in skin diseases (p<0.0001); the number of double stained cells was higher in infectious compared to non-infectious diseases (p=0.008). Treg cell numbers were comparable between leprosy and other infectious dermatoses (p=0.157) Treg cell counts in reactional lesions were higher than in reaction-free leprosy lesions (p<0.002). Paired biopsies of T1R or T2R reactional/reaction-free lesions showed xxvii increased numbers of Treg during T1R compared to reaction-free lesions from the same patient (p< 0.001). Treg cell median in T1R developed during MDT was slightly higher compared to T1R developed at diagnosis in naïve patients (p=0.047). There was a trend in increasing Treg cell numbers from the tuberculoid to borderline-lepromatous form, which showed the highest median value of Tregs, however this difference was not significant (p>0.8). Mast cell study: Infectious and non-infectious skin lesions showed higher numbers of degranulated than intact MC both for leprosy and other dermatoses, compared to normal skin. The numbers of degranulated MC were higher than intact MC regardless of the leprosy form (from tuberculoid/TT to lepromatous/LL), regardless of the occurrence of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction (T1R/T2R). Try+ MC numbers and density were higher than chy+ MC in leprosy, in reaction-free and reactional lesions, particularly in T2R, but not in other dermatoses. Conclusions: Higher Treg numbers seen in T1R suggest Treg role in suppressing the exacerbated cell-mediated phenomenon that causes T1R. Differential expression/ of try+ and chy+ MC subsets was seen in leprosy compared to other skin diseases and to normal skin. However, neither leprosy form nor leprosy reaction was associated with MC changes in lesions suggesting that the Mycobacterium leprae infectious process per se dictates MC expression in leprosy skin lesions. / A hanseníase é uma complexa doença dermato-neurológica, crônica, de causa infecciosa que afeta a pele e os nervos periféricos, especialmente durante os episódios imunoinflamatórios agudos conhecidos com reações tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2. Não existe modelo experimental para hanseníase e as lesões de pele têm sido extensivamente usadas para desvendar os multifacetados mecanismos imunopatológicos associados com a doença. Este estudo investigou a expressão in situ de duas distintas populações celulares que apresentam importante papel imunorregulatório: células Treg (Treg) e mastócitos (MC) em pele normal e diversas doenças cutâneas com ênfase nas reações hansênicas RT1 e RT2. Para o estudo de Tregs foram utilizadas 154 biópsias cutâneas de 114 participantes de três grupos: 1. Hanseníase (n=74), 56 RT1 (28-biópsias pareadas do mesmo paciente sem reação/durante reação, 28 biópsias únicas de RT1), 18 RT2 (12 biópsias pareadas sem reação/durante reação, 6 biópsias únicas de RT2); 2. Dermatoses: (n=29) doenças cutâneas não infecciosas e infecciosas. Controles Normais: fragmentos de peles obtidos de mamoplastias eletivas em mulheres saudáveis. Imunomarcação dupla CD25+ Foxp3+ de células Treg foi realizada em plataforma automatizada. Quantificação das células Treg duplo positivas foram feitas sem conhecimento da condição clínica do paciente (valores expressos em mm2 ). Para o estudo dos MC 80 biópsias de 3 grupos foram investigadas: 40 pacientes com hanseníase recém diagnosticados não tratados (18 sem reação, 11 RT1, 11 RT2), 29 pacientes com outras dermatoses e 11 biópsias de pele normal. Quantificação de MC intactos e desgranulados corados por azul de toluidina/mm2 ; imunomarcação streptavidina-biotina-peroxidase foi empregada para detectar MC triptase/try+ e chimase/chy+ e a densidade ótica (mediana da densidade ótica) foi avaliada. Resultados: Estudo das Tregs: Nenhuma célula Treg CD25+ Foxp3+ foi identificada em nenhuma das 11 amostras de pele normal, enquanto um número variável de Tregs foi identificado nas diversas doenças cutâneas (p<0.0001); o número de células Treg duplo positivas foi maior nas doenças infecciosas comparado com as não-infecciosas (p=0.008). Medianas de Treg entre hanseníase e outras doenças infecciosas foram semelhantes (p=0.157). Quantificação de Tregs em lesões reacionais foram maiores do que as sem reação (p<0.02). Nas biópsias pareadas de lesões de xxv RT1/sem reação ou RT2/sem reação, números maiores de Treg foram vistos durante a RT1 quando comparados com a não reacional do mesmo paciente (p< 0.001). Mediana de Treg em RT1 desenvolvidas durante MDT foi ligeiramente superior comparada a RT1 desenvolvida em pacientes sem de tratamento (p=0.047). Observou-se uma tendência de aumento no número das Tregs do polo tuberculoide em direção ao lepromatoso, mais especificamente até a forma borderline-lepromatosa que apresentou a maior mediana da quantificação de Treg, entretanto esta diferença não foi estatisticamente significativa (p>0.8). Estudo dos Mastócitos: lesões cutâneas de origem infecciosa e não infecciosa mostraram números aumentados de mastócitos desgranulados do que intactos tanto na hanseníase como nas outras dermatoses quando comparados com pele normal. Os números de mastócitos (MC) desgranulados foram maiores do que intactos, independente da forma de hanseníase (do polo tuberculoide/TT ao lepromatoso/LL), independente da ocorrência de reações hansênicas (lesão reacional/sem reação) e independente do tipo de reação (RT1/RT2). Número e densidade de mastócito triptase positivo (MC try+ ) estão aumentados em relação aos quimase positivo (MC chy+ ) na hanseníase, em pacientes com e sem reação, particularmente na RT2, mas não nas outras dermatoses. Conclusões: aumento nas Treg detectados durante RT1 sugerem papel supressor dessas células em eventos associados à resposta imune celular exacerbada, responsáveis pela RT1. Expressão diferencial das subpopulações de MC try+ e chy+ foi observada na hanseníase em relação a outras doenças cutâneas e pele normal. Entretanto, nem a forma da hanseníase, nem a ocorrência de reação hansênica, estava associada a mudanças nas subpopulações de MC nas lesões sugerindo que o processo infeccioso pelo Mycobacterium leprae per se direciona a expressão de MC nas lesões cutâneas da hanseníase.