As células-tronco mesenquimais (MSCs) da medula óssea compreendem uma população de células multipotentes com propriedades imunorreguladoras e capacidade de secreção de fatores de crescimento, desempenhando um papel fundamental na regulação da hematopoiese. À luz dessas propriedades, alguns estudos fornecem uma análise das relações estabelecidas entre células-tronco hematopoiéticas normais (HSCs) e MSCs quando expostas à cocultura. Jing et al. (Haematologica, 2010) demonstram neste tipo de arranjos de cocultura a geração de três populações distintas de células: células não aderentes (Fração A), células aderidas à superfície de MSCs (Fração B) e células abaixo das MSCs (Fração C). Além disso, dados recentes apontam para a associação da progressão da doença com a evidência de transferência de mitocôndrias funcionais (mt) e espécies reativas de oxigênio (ROS) das MSCs para as células leucêmicas. É teorizado como um mecanismo de MSCs, a fim de reduzir as espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, os desempenhos diferenciais nesses processos de transferência entre MSCs normais e leucêmicas em sistemas de cocultura em cada uma dessas populações de células distintas não foram estabelecidos. As células leucêmicas (CD45+) têm um aumento de quase três vezes na proliferação em todas as três populações após a cocultura com MSCs leucêmicas, mas não após a cocultura com MSCs saudáveis. As células CD45+ da fração A têm uma baixa taxa de proliferação em cocultura com MSCs normais comparadas com as células leucêmicas. Em 5d, as MSCs leucêmicas (CD73+) aumentam 20 vezes a coloração de mitotracker em comparação com 3d, implicando que os blastos AML estimulam MSCs a produzir mais mt, embora os MSCs normais apresentem os mesmos níveis de mitotracker em 3 / 5d. Além disso, os níveis de mtROS diminuem em 10 vezes em 5d em comparação com 3d em leucemia, mas não em MSCs normais, sugerindo uma recuperação mediada por mt em MSCs leucêmicas após a cocultura. Finalmente, o ROS total diminui 2 vezes nas células CD45+ após cocultura com MSCs leucêmicas por 5d, mas não em contrapartida normal. Em essência, esses achados sugerem diferentes mecanismos de doação mitocondrial de MSCs para blastos LMA. Além disso, o estudo fornece um passo importante nacompreensão da natureza complexa do metabolismo do tumor, não apenas na célula maligna, mas também dentro do microambiente que a suporta. / Bone marrow mesenchymal stromal cells (MSCs) comprise a population of multipotent cells with immunoregulatory properties and the capability of secreting growth factors, playing a key role in the regulation of hematopoiesis. In light of these properties, some studies provide analysis of the relations established between normal hematopoietic stem-cells (HSCs) and MSCs when exposed to coculture. Jing et al. (Haematologica, 2010) demonstrate in these kind of coculture arrangements the generation of three distinct cells populations: non-adherent cells (supernatant), phasebright cells (adhered to the surface of MSCs) and phase-dim cells (beneath the MSCs). Furthermore, recent data pointed to the association of disease progression in AML with the evidence of functional mitochondria (mt), and reactive oxygen species (ROS) transference from MSCs to the blasts cells. It is theorized as a mechanism of MSCs in order to reduce the reactive oxygen species (ROS). Nevertheless, the differential performances in these transference process among normal and leukemic-MSCs in coculture systems in each of those distinct cells populations were not established. AML cells (CD45+) have an increase of almost 2.5-fold in proliferation in all of 03 populations after coculture with leukemic-MSCs but not after coculture with a normalMSCs. The CD45+ cells in phase-bright/dim have a low proliferation rate in coculture with normal-MSCs compared with the leukemic cells. In 5d, the leukemic-MSCs (CD73+) increase 20-fold the mitotracker staining compared with 3d, implying that AML blasts stimulate MSCs to produce more mt, albeit the normal-MSCs present the same mitotracker levels in 3/5d. Additionally, the mtROS levels decrease by 10-fold in 5d compared with 3d in leukemic, but not in normal-MSCs, suggesting mt mediated recover in leukemic-MSCs after coculture. Finally, total ROS decrease 2-fold in CD45+ cells after coculture with leukemic-MSCs for 5d, but not in normal counterpart. In essence, these findings suggest different mechanisms of mitochondrial donation from MSCs to AML blats. Moreover, the study provides an important step in the understanding of the complex nature of tumor metabolism, not only in the malignant cell, but also within the microenvironment which supports it.

Diversos estudos tem demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTM) são imbuídas de uma forte atividade imunossupressora in vitro, no entanto, os resultados de imunoterapias utilizando CTM têm sido variáveis até o momento. Nossa hipótese para tal variação são interações que devem ocorrer entre as CTM e fragmentos de patógenos circulantes nos pacientes, resultando na modulação da atividade imunossupressora. Para avaliar a ocorrência deste fenômeno em CTM de medula óssea, inicialmente foi avaliado a presença de diversos TLR através da marcação com anticorpos e posterior quantificação por citometria de fluxo, sendo observada a presença dos TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9. No intuito de avaliar alterações no potencial imunossupressor, linfócitos T ativados e marcados a nível intracelular foram co-cultivados com CTM estimuladas com LPS, POLY IC e oligonucleotídeos com motivos CpG: DSP30, CpG-A e CpG-B, sendo sua proliferação quantificada por citometria de fluxo. Como resultados, foi observado que a estimulação com LPS e DSP30 levaram a perda e acentuação da capacidade supressora, respectivamente, enquanto o estímulo simultâneo com LPS e DSP30 resultou em sua manutenção. Tais modulações na imunossupressão foram corroboradas ao serem avaliadas modulações na expressão gênica, tendo em vista que o estímulo por LPS e DSP30 induziram no aumento da expressão de IL1 e TGF, respectivamente. Em seguida, foi avaliado o efeito das mesmas condições experimentais na indução a proliferação das CTM, ao ser mensurada alterações na quantidade de células em um equipamento de High content Screening (HCS). Como resultados, foi possível observar que somente o tratamento com DSP30 foi capaz de aumentar significativamente a quantidade de células, fenômeno corroborado ao ser mensurada a síntese de DNA, através da utilização de um produto comercial, seguido de análise por citometria de fluxo. No intuito de avaliar possíveis modulações na via NF-B, CTM estimuladas com LPS ou DSP30 foram sujeitas ao ensaio de imunoprecipitação de cromatina, utilizando anticorpos específicos a subunidades de RelA e RelB, sendo o DNA imunoprecipitado sujeito a PCR quantitativo com primers específicos para a regiões promotoras do gene VCAM-1. Como resultados, foi observado que o estímulo com LPS aumentou a atividade do RelA, enquanto não foram observados efeitos após o estímulo com DSP30. No entanto, o estímulo simultâneo com ambos os ligantes levou ao aumento de atividade de RelA e RelB. Ao serem avaliadas estas condições em um ensaio de imunofluorescência analisado em HCS, foi possível observar maiores níveis da proteína RelB no citoplasma das células tratadas com DSP30, sugerindo um aumento da sua formação. Apesar dos mecanismos moleculares subjacentes aos resultados observados ainda necessitarem de maior elucidação, nosso trabalho indica que a estimulação das CTM com DSP30 pode trazer benefícios no sentido de potencializar a imunossupressão e proliferação celular, além de impedir a perda da imunossupressão, decorrente da interação com LPS. Tais resultados poderão servir como diretrizes para o aprimoramento de imunoterapias utilizando CTM de medula óssea, principalmente em casos de pacientes com infecções por patógenos. / Several studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs ) are imbued with a strong immunosuppressive activity in vitro , however , the results of immunotherapies using CTM has been mixed so far. Our hypothesis for this variation are interactions that must occur between the CTM and fragments of circulating pathogens in patients , resulting in the modulation of the immunosuppressive activity. To evaluate the occurrence of this phenomenon in bone marrow MSCs was initially evaluated the presence of various TLR by staining with antibodies and subsequent quantification by flow cytometry , the presence of TLR2 , TLR3 , TLR4 and TLR9 was observed . To assess changes in the immunosuppressive , activated T lymphocytes and labeled intracellularly potential were co-cultured with MSC stimulated with LPS , poly IC and oligonucleotides with CpG motifs : DSP30 , CpG - A and CpG - B , and their proliferation measured by flow cytometry. As a result , it was observed that stimulation with LPS and DSP30 led to loss of stress and suppressing ability , respectively, while simultaneous stimulation with LPS and DSP30 resulted in maintenance. Such modulations in immunosuppression were corroborated when assessing modulations in gene expression , given that the stimulus induced by LPS and DSP30 in increased expression of TGFb and IL1 , respectively. Then , the effect of the same experimental conditions inducing proliferation of MTC to be measured changes in the amount of cells in a High Content Screening equipment (HCS ) was measured . As a result , it was observed that only the DSP30 treatment was able to significantly increase the amount of cells, phenomenon to be measured supported DNA synthesis through the use of a commercial product followed by analysis by flow cytometry . In order to evaluate possible modulations in NF-kB pathway , CTM stimulated with LPS or DSP30 were subjected to chromatin immunoprecipitation assay , using antibodies specific to subunits RelA and RelB , and the immunoprecipitated DNA subjected to quantitative PCR with primers specific to the promoter regions of VCAM-1 gene. As a result , it was observed that stimulation with LPS increased the activity of RelA , while effects were not observed after stimulation with DSP30 . However , simultaneous stimulation with both ligands led to increased activity of RelA and RelB . When these conditions are evaluated in an assay in HCS immunofluorescence analysis , we observed higher levels of RelB protein in the cytoplasm of cells treated with DSP30 , suggesting an increase in their formation. Although the molecular mechanisms underlying the observed results still require further elucidation , our work indicates that stimulation of MSC with DSP30 can bring benefits in terms of enhancing immunosuppression and cell proliferation , and prevent loss of immunosuppression resulting from the interaction with LPS . These results can serve as guidelines for the improvement of immunotherapies using CTM bone marrow , especially in cases of patients with infections caused by pathogens.

As células-tronco mesenquimais derivados do tecido adiposo (ASC) apresentam potencial para uso em terapêuticas para reparação cardíaca e o modelo de suínos recapitula aspectos relevantes dos seres humanos. Nesta dissertação quisemos caracterizar ASC de porcos (pASC), após criopreservação e avaliar a responsividade destas células ao shear stress. Após descongelamento as pASC exibiram 90-95% de viabilidade, não apresentaram alterações morfológicas e nem na expressão de marcadores de superfície (CD29+ 99,74%±0,10; CD90+ 97,84%±1,32; CD44+ 99,39%±0,19, CD31- 1,75%±0,21; média±EPM, n=3). O tempo de dobramento médio foi de 63,51±16,46 horas (média±DP) e o dobramento populacional cumulativo aumentou constantemente até a passagem 10, com pequeno e gradual aumento na senescência (P5 3,25%±0,26 e P10 9,6%±0,29 SA-?-Gal). Além disso, as pASC responderam, in vitro, ao tratamento para diferenciação em adipócitos e osteócitos. Já a exposição ao SS (15 dyn/cm² por 48 hs) não induziu a expressão de marcadores endoteliais (CD31, VE-caderina e FLK-1), mas resultou no acúmulo de VEGF induzido por NO (15 dyn/cm² por 96 hs). Interessantemente, o SS induziu a fosforilação de ERK e AKT e a liberação de NO independente da magnitude do SS (1-30 dyn/cm², por 30 min). No entanto, longos períodos de estímulo (24-48 hs) e diferentes intensidades de shear stress induziram desigualmente a liberação de NO e VEGF (5 dyn/cm² maior do que 10 ou 15 dyn/cm²). Tomados em conjunto, nossos dados promovem evidências de que a viabilidade, morfologia, cinética de crescimento e resposta a estímulos químicos ou físicos de pASC não foram influenciados pela criopreservação. Além disso, a magnitude de SS aplicada a essas células afetou a liberação de NO e VEGF somente após longos períodos de exposição a esse estímulo / Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASC) offer potential regenerative therapeutic application for cardiac repair and the porcine model recapitulates key aspects relevant to humans. In this dissertation we wanted to establish the culture characteristics of pig ASC (pASC), especially after long-term cryopreservation and the effect of shear-stress (SS)-induced phenotypes. Upon thawing, pASC displayed 90-95% viability and no changes in morphological characteristics or in the expression of surface markers (CD29+ 99.74%±0.10; CD90+ 97.84%±1.32; CD44+ 99.39%±0.19, CD31- 1.75%±0.21; mean±SEM, n=3). Mean population doubling time was 63.51±16.46 hours (mean±SD) and cumulative population doubling increased constantly until passage 10 with a small and gradual increase in senescence (P5 3.25%±0.26 and P10 9.6%±0.29 SA--Gal staining). In addition, pASC in vitro responded to adipogenic and osteogenic chemical cues, whereas SS exposure (15 dyn/cm² up to 48 hours) failed to induce endothelial cell (EC) markers (CD31, VE-cadherin and FLK-1), but resulted in nitric oxide (NO)-induced VEGF accumulation (15 dyn/cm² up to 96 hours). Interestingly, SS-induced phosphorylation of ERK and AKT and the release of NO were independent of the magnitude of the stimulus (1-30 dyn/cm², up to 30minutes). In contrast, long term (24-48 hours) SS-induced NO and VEGF release under 5 dyn/cm² were higher than 10 or 15 dyn/cm2. Altogether, we provided evidence that pASC cell viability, morphology, growth characteristics and capacity to respond to chemical or physical cues were not influenced by cryopreservation. Moreover, the magnitude of the SS affected the NO and VEGF release in pASC only during long-term exposure to SS

Um novo método de modificação da superfície de nanopartículas de hidroxiapatita (HAP) por reação com cloreto de lauroíla foi desenvolvido, gerando a nanopartícula funcionalizada por laurato (HAP-CL). A superfície modificada da HAP foi confirmada por infravermelho, termogravimetria, ressonância magnética nuclear e análise elementar. Provamos por testes mecânicos a capacidade de criar compósitos com alto teor de HAP-CL em matrizes poliméricas de poli(L-acido láctico) (PLLA) e poli(succinato de isosorbídeo-b-L-lactídeo) (PLLA-co-PIS) sem perda significativa de propriedades mecânicas. Diferentes quantidades de HAP-CL, HAP enxertado com PLLA (PLLA-g-HAP) e HAP puro foram dispersadas em soluções de PLLA para formar fibras eletrofiadas. Para comparar a dispersão destas nanopartículas nas fibras e a sua morfologia, análise de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão foram empregadas. A HAP-CL exibiu melhor dispersão na matriz polimérica do que o PLLA-g-HAP e HAP, e permitiu a produção de fibras com grande quantidade de HAP-CL (até 30% massa da fase mineral em relação à massa do polímero(mm/mp)), tanto para o PLLA como para o PLLA-co-PIS. Células tronco mesenquimais derivadas de polpa de dente foram cultivadas em fibras de PLLA com alto teor de HAP-CL, resultando em um aumento significativo da atividade de fosfatase alcalina (ALP), nos dias 14 e 21 (p <0,001) quando comparados com conteúdos mais baixos de HAP-CL, assim como um melhor processo de mineralização apresentado pelos teste de vermelho de alizarina depois de 21 dias (p <0,001). As células cultivadas nas fibras de PLLA-co-PIS contendo 30% de HAP-CL (mm/mp) apresentaram maior atividade de ALP após 21 dias (p <0,05), e melhor processo de mineralização, depois de 14 e 21 dias (p <0,05) do que as fibras de PLLA com 30% de HAP-CL (mm/mp). PLLA e PLLA-co-PIS, ambos contendo 30% de HAP-CL (mm/mp) induziram uma maior expressão de osteocalcina e osteopontina, dois marcadores de diferenciação osteoblástica, quando comparados ao PLLA e PLLA-co-PIS (controle). Finalmente, em experimentos in vivo, as fibras de PLLA-co-PIS contendo 30% de HAP-CL (mm/mp) apresentaram um desempenho superior no processo de neoformação óssea do que as fibras de PLLA com o mesmo conteúdo de nanopartículas. Em conclusão, os nossos resultados in vitro demonstraram que os suportes construídos de compósitos de PLLA-co-PIS contendo 30% de HAP-CL (mm/mp) se mostraram superiores tanto na adesão e proliferação quanto na diferenciação de células mesenquimais de polpa de dente em osteoblastos. Além disso, experimentos in vivo confirmaram estes resultados, demonstrando que estes nanocompósitos são excelentes modelos para implantes destinados a regeneração óssea. / A new method of surface modification of hydroxyapatite nanoparticles (HAP) by reaction with lauroyl chloride was developed, producing the laurate functionalized nanoparticle (HAP-CL). The surface modified HAP was confirmed by infrared, thermogravimetric analysis, nuclear magnetic resonance and elemental analysis. We proved by mechanical tests the ability to create composites with high HAP-CL content in poly(L-lactic acid) (PLLA) and poly(isosorbide succinate-b-L-lactide) (PLLA-co-PIS) polymeric matrixes without significant loss of mechanical properties. Different amounts of HAP-CL, HAP grafted with PLLA (PLLA-g-HAP) and HAP were dispersed in pure PLLA solutions to form nanofibers. To compare the dispersion of these nanoparticles in the fibers and their morphology, scanning and transmission electron microscopies were employed. HAP-CL showed better dispersion in the polymer matrix than the PLLA-g-HAP and HAP, and allowed fiber production with large amounts of HAP-CL (up to 30% mineral to polymer weight (wm/wp)) for both PLLA and PLLA-co-PIS. Mesenchymal stem cells derived from dental pulp were cultured in PLLA fibers with high levels of HAP-CL, resulting in a significant increase in alkaline phosphatase activity (ALP), on days 14 and 21 (p <0.001) as compared to those with lower content HAP-CL, as well as a better mineralization process shown by alizarin red test after 21 days (p <0.001). Cells grown in PLLA-co-PIS fibers containing 30% of HAP-CL showed higher ALP activity after 21 days (p <0.05) and a better mineralization process, after 14 and 21 days (p <0.05 ) than fibers of PLLA with 30% HAP-CL. PLLA and PLLA-co-PIS, both containing 30% of HAP-CL (wm/wp) induced a higher expression of osteocalcin and osteopontin, two osteoblast differentiation markers when compared with PLLA and PLLA-co-PIS (control). Finally, in the in vivo experiments, the PLLA-co-PIS fibers containing 30% HAP-CL (wm/wp) outperformed the process of bone formation than PLLA fibers with the same content of nanoparticles. In conclusion, our in vitro results demonstrated that scaffolds from composites of PLLA-co-PIS containing 30% HAP-CL (wm/wp) were superior both in adhesion and in the differentiation and proliferation of dental pulp stem cells in osteoblasts. Furthermore, in vivo experiments confirmed these results, demonstrating that these nanocomposites are excellent models for implants for bone regeneration

INTRODUÇÃO: O objetivo deste estudo foi de avaliar a eficácia de um centrifugado osteogênico de medula óssea para estimular a consolidação de osteotomias da fíbula em coelhos. MÉTODOS: Este estudo experimental envolveu a utilização de dez coelhos machos adultos da raça Nova Zelândia albino. Realizou-se uma osteotomia transversa médio-diafisária da fíbula direita, seguida da adição local de uma esponja de colágeno absorvível embebida em um centrifugado osteogênico, obtido pela centrifugação de aspirado de medula óssea do osso ilíaco ipsilateral. A fíbula esquerda foi utilizada como controle, sendo feita a mesma osteotomia, porém neste caso adicionando-se somente a esponja de colágeno absorvível. O centrifugado de medula óssea elaborado em laboratório foi submetido à contagem do número de células nucleadas e a teste de viabilidade celular antes de ser administrada no local das osteotomias. Após quatro semanas os animais foram sacrificados para estudo dos calos ósseos formados. Os critérios de avaliação foram a mensuração da densidade mineral utilizando-se a densitometria óssea com DEXA, do volume do calo com tomografia computadorizada multi-slice e dos tecidos formados por meio de histomorfometria. RESULTADOS: O método utilizado para a centrifugação dos aspirados de medula óssea resultou em uma concentração média de células nucleadas três vezes maior que o número destas células nos aspirados originais, sem destruição celular significativa. A utilização deste centrifugado osteogênico resultou em um aumento médio na densidade mineral óssea dos calos de 40,3% e da quantidade relativa de tecido ósseo de 9,4%, sem aumento significativo nas quantidades relativas de cartilagem ou fibrose. Não houve aumento significativo no volume dos calos ósseos. CONCLUSÃO: A administração de centrifugado osteogênico de medula óssea utilizado neste estudo favoreceu a consolidação óssea de osteotomias experimentais em coelhos, observando-se uma melhora qualitativa do calo ósseo. / INTRODUTION: The purpose of this study was to evaluate the efficacy of a centrifuged osteogenic bone-marrow aspirate to stimulate rabbit fibular osteotomies healing. METHOD: Ten white New Zeeland rabbits were used. A transverse middle-diaphysis fibular osteotomy was performed at the right fibula, where a collagen absorbable sponge embedded in the osteogenic centrifuged bone marrow aspirate was inserted. The left fibula was used as the control group, where the collagen absorbable sponge was inserted without the osteogenic centrifuged aspirate. The centrifuged bone-marrow aspirate was arranged at the laboratory and submitted to nuclear cell count and cell viability test. The rabbits were killed at four weeks after surgery to evaluate bone callus formation. The results analysis was performed with DEXA bone densitometry to evaluate callus mineral mass, multislice computer tomography to evaluate callus volume and histomorphometry to evaluate the relative rate of tissue formation. RESULTS: The bone-marrow centrifugation technique increased the number of nucleated cells by three compared with the number of that cells in the original bone-marrow aspirates, without significant nucleated cell dead. The apply of centrifuged osteogenic bone-marrow aspirate resulted in an increased callus bone mineral mass by 40,3%, and increased relative rate of bone tissue formation by 9,4%, without increase the relative rate of cartilage or fibrous tissue. There was not increased callus volume. CONCLUSION: This study shows that the centrifuged osteogenic bone-marrow aspirate was able to improve the healing of experimental fibular osteotomies in rabbits by qualitative improve of bone callus.

AA é uma doença grave caracterizada por pancitopenia e hipocelularidade medular, que pode levar a morte. Em casos severos os tratamentos são restritos ao transplante alogênico de MO e/ou uso de imunossupressores. Para isso, deve ser tipado o HLA entre doador e beneficiário. Com isso, as CTM são fontes celulares candidatas para este propósito, pois são praticamente não imunogênicas devido à sua ação parácrina de imunomodulação. Além disso, as CTM possuem um importante papel na hematopoiese. Para induzir AA utilizamos inicialmente ciclofosfamida (n=10) e radiação ionizante a 6 Gy (n=40), que foi o modelo experimental adotado. Após a radiação ocorreram três transplantes de CTIPDh com intervalo de 15 dias via IP. A resposta clínica do transplante foi monitorada pela avaliação da massa corpórea, hemograma e histopatologia da MO. O enxerto das CTIPDh na MO e seu efeito na hematopoiese, também foi verificado. Os resultados demonstraram que os animais irradiados e tratados com CTIPDh apresentaram benefícios clínicos em relação aos animais não tratados. Observamos enxertia das CTIPDh na MO e baço dos camundongos e recuperação dos componentes medulares em comparação aos animais não tratados. Assim, o transplante das CTIPDh são uma fonte terapêutica em potencial. / AA is a several disease characterized by peripheral pancytopenia and bone marrow hypoplasia, which can lead to death. In severe cases, treatments are limited to allogeneic BM transplant and/or immunosuppressants administration. For this purpose, the donor blood must be typed to identify their HLA. Thereby, MSC are appropriate candidates for therapeutic use, because they present low immunogenicity and provide immunomodulation effect in tissue repair. Furthermore, MSC have important role in supporting hematopoiesis. Thus, AA was induced using cyclophosphamide (n = 10) and 6 Gy ionizing radiation (n = 40), which caused BM ablation in mice. Thus ionizing radiation of AA model was selected. After radiation, the mice received three equal doses of hDPSC each 15-day via intraperitoneal injection. Clinical response was monitored by body mass, blood cells counting and histopathology of BM. The influence of hDPSC infusion on hematopoiesis and engraftment capacity of this cell was also investigated. Our data show the hDPSC transplantation in irradiated mice improves clinical conditions and the transplant intraperitoneal showed hDPSC grafting in BM and recovery of medullary components when compared to untreated group. The results indicate that hDPSC transplantation is a potential tool for cell-based therapeutics.

Durante a vida reprodutiva das éguas o endométrio é exposto a eventos como: cópula, parto, puerpério e infecções. Tais circunstâncias podem levar gradativamente a diminuição da capacidade funcional do endométrio com queda da fertilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o meio condicionado de células tronco mesenquimais sobre o endométrio de éguas com fibrose uterina através de avaliação histopatológica. No experimento 1, 21 éguas que não pariram pelo menos em duas temporadas foram avaliadas por meio de exames ultrassonográfico, citológico, bacteriológico e histopatológico. No experimento 2, das 21 éguas avaliadas, quatro éguas classificadas como grau II e duas éguas classificadas como grau III na histopatologia endometrial, foram submetidas a infusão uterina com o meio condicionado de células tronco mesenquimais para promover a regeneração endometrial. No experimento 1, a presença de edema uterino foi observada em 81% (17/21) das fêmeas líquido intrauterino em 23,81% (5/21) e cistos uterinos em 57,14% das éguas (12/21). O crescimento bacteriano identificado em 42,90% (9/21) das éguas pelo exame bacteriológico revelou predominância de Escherichia coli (4/21). O exame citológico revelou processo inflamatório em 44,40% das fêmeas (4/9) com crescimento bacteriano, enquanto 16,70% (2/12) das éguas sem crescimento bacteriano tinham presença de processo inflamatório (P = 0,331). A inflamação uterina foi detectada em 28,60% (6/21) das éguas. A biópsia uterina e avaliação histopatológica revelou 14,30% (3/21) das éguas pertencentes à classe Grau I, 47,60% Grau II (10/21) e 38,10% Grau III (8/21). Verificou-se correlação positiva significativa (r = 0,69; P = 0,0005) entre o grau de endometrose pelo Índice de Caslick e o grau atribuído após exame histopatológico. Maior percentual de éguas com índice Caslick superior a 200 foi observado (P= 0,0242) em éguas classificadas como Grau III (87,5%; 7/8) do que Grau I (0,0%; 0/3). Não houve diferença (P= 0,59) entre as éguas Grau III e as Grau II (70%; 7/10); estas últimas tenderam (P= 0,07) a ter maior percentual com índice Caslick acima 5 de 200 do que as fêmeas com Grau I. O índice Caslick médio comparado entre os graus histológicos revelou maior índice nas éguas Grau III do que nas éguas Grau I (252,0 vs 78,3; P= 0,007). As éguas com Grau II apresentaram índice intermediário (174,6). Não houve associação entre a presença de cistos uterinos e o grau histopatológico das biópsias (P= 0,813). Éguas com cistos uterinos tiveram 16,7%, 41,7% e 41,7% das biópsias classificadas no exame histológico como Graus I, II e III, respectivamente. Esses percentuais nas éguas sem cistos foram de 11,1%, 55,6% e 33,3%, para os Graus I, II e III, respectivamente. A idade média das fêmeas foi similar (P= 0,112) entre as fêmeas com e sem cistos uterinos (20,3 vs 16,3 anos). No experimento 2, a aplicação de 20 mL de meio condicionado de células tronco no lúmen uterino das seis éguas com endometrose grau II e III não resultou em melhoria na condição endometrial. / During the mare reproductive life, the endometrium is exposed to events such as copulation, parturition, puerperium, and infections. Such circumstances may gradually lead to a decrease in the functional capacity of the endometrium, resulting in a drop in fertility. The objective of this study was to evaluate, by using ultrasonographic, cytological, bacteriological, and histopathological exams, the effect of a treatment with mesenchymal stem cell-conditioned medium on the endometrium of 21 mares with uterine fibrosis that did not foal in at least two seasons. In experiment 1, 21 mares were evaluated by using ultrasonographic, cytological, bacteriological and histopathological exams. In experiment 2, from the total 21 females, four mares classified by the endometrial histopathology as grade II and two mares classified as grade III were submitted to uterine infusion with mesenchymal stem cell-conditioned medium to promote the endometrial regeneration. In experiment 1, the evaluation revealed the presence of uterine edema in 81% (17/21), intrauterine liquid in 23.81% (5/21), and uterine cysts in 57.14% of the mares (12/21). Bacteriological examination revealed that 42.86% (9/21) of the mares showed bacterial growth, and the microorganism with the highest incidence was Escherichia coli (4/21). The cytological exam showed inflammatory process in 44.40% (4/9) of the females with bacterial growth, while 16.70% (2/12) of the mares without bacterial growth showed inflammatory process (P = 0.331). Uterine inflammatory process was observed in 28.60% (6/21) of the mares. It was possible to identify by using uterine biopsy and histopathological evaluation that 14.30% (3/21), 47.60% (10/21), and 38.10% (8/21) of mares belong to Grade I, II and III, respectively. There was a significant positive correlation (r = 0.69, P = 0.0005) between the degree of endometrosis evaluated by the Caslick Index and the grade attributed after histopathological examination. The percentage of mares with Caslick index over 200 was higher in females classified as grade III (P= 0.0242) than in grade I females (0.0%; 0/3). There was no difference between mares grade III and grade II 7 (70%; 7/10). Grade II females tended to have a higher percentage with Caslick index above 200 (P = 0.07) when compared to the grade I females. The medium Caslick index compared between the histological grades revealed a higher index in grade III than in grade I mares (252.0 vs 78.3, P = 0.007). Mares grade II showed intermediate index (174.6). There was no association between the presence of uterine cysts and the histopathological grade of biopsies (P = 0.813). Mares with uterine cysts had 16.70%, 41.70%, and 41.70% of the biopsies classified in the histological examination as grades I, II, and III, respectively. The percentages in mares without cysts were 11.10%, 55.60%, and 33.30%, respectively, for Grade I, II and III. The mares mean age was similar (P=0.112) among females with or without uterine cysts (20.3 vs 16.3 years). In experiment 2, the application of 20 mL of mesenchymal stem cell-conditioned medium in the uterine lumen of six mares with endometrosis Grade II and III did not improve the endometrial condition.

O tecido ósseo tem sido amplamente estudado devido às suas inúmeras funções e capacidade de auto-regeneração. Entretanto, muitas vezes a reparação óssea completa pode ser prejudicada quando as fraturas ósseas são graves. Muitas pesquisas visando a regeneração do tecido ósseo estão sendo realizadas tanto nas abordagens que envolvem a utilização de enxertos, quanto na aplicação de terapia celular. O objetivo deste trabalho foi obter e caracterizar uma linhagem celular proveniente do tecido ósseo de fetos caninos. Para isso, foi realizado método de dissociação enzimática do osso fetal canino para obtenção da cultura celular, estabelecendo assim o cultivo das células OSTBN6. Além disso, foram realizados técnicas do teste de viabilidade e proliferação celular por MTT, de imunofenotipagem das células, expressão gênica, diferenciação celular em linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica, e análise do potencial tumorigênico das células derivadas de tecido ósseo fetal canino. Sendo assim, a população isolada de células derivadas de tecido ósseo fetal canino isolada apresentou duas morfologias distintas: formato fibroblastóide e formato triangular. Essas células são viáveis e possuem ótima taxa de proliferação, como indicou o ensaio de MTT. As células foram positivas para pluripotência e para células de origem mesenquimal, e foram negativas para marcadores de células de origem hematopoiéticas. As OSTBN6 foram capazes de se diferenciar em linhagem adipogênica, osteogênica e condrogênica, característica de células mesenquimais. Por fim, foi realizado o teste do potencial tumorigênico em camundongos nude, não havendo formação de tumores. Desse modo, concluimos que a célula proveniente do tecido ósseo fetal canino constitui uma fonte segura para utilização na medicina regenerativa e terapia celular / Bone tissue has been widely studied due to its numerous functions and capacity for self-regeneration. However, often the complete bone repair may be impaired when bone fractures are severe. Many research aiming to regenerate the bone tissue are being conducted in both approaches involving the use of grafts, as the application of stem cell therapy. The objective of this study was to obtain and characterize a cell line derived from the canine fetuses bone. To do so, it was carried out an enzymatic dissociation method for obtaining canine fetal bone cell culture, thus establishing OSTBN6 cells culture. In addition, there were carried out technical viability and cell proliferation by MTT test, immunophenotyping of cells, gene expression, cellular differentiation in adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages, and analysis of tumorigenic potential of cells derived from canine fetal bone. Thus, the population of cells derived from isolated canine fetal bone tissue showed two distinct morphologies: fibroblastoid shape and triangular shape. These cells are viable and have optimal rate of proliferation, as indicated by the MTT assay. Cells were positive for pluripotency and as mesenchymal cells and were negative for hematopoietic origin cell markers. The OSTBN6 were able to differentiate into adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineage, characteristic of mesenchymal cells. Finally, it was performed the tumorigenic potential test in nude mice, with no tumor formation. Thus, it was concluded that the cell derived from canine fetal bone is a reliable source for use in regenerative medicine and cell therapy

Malformações fetais são importantes causas de óbito fetal e mortalidade infantil. A medicina regenerativa apresenta-se como a terceira modalidade terapêutica fetal. Células obtidas do líquido amniótico mostram-se como opção preferencial em terapia celular por sua alta taxa de proliferação in vitro, habilidade de autorrenovação e potencial multilinhagem. Para uso clínico, é recomendável a exclusão de material animal não humano do meio de cultura dessas células, prevenindo reações imunes, transmissão de príons, bactérias e vírus. O soro fetal bovino é componente usual do meio de cultura dessas células. Sua substituição por soro humano previne essas possíveis consequências. O objetivo deste trabalho foi estudar células obtidas do líquido amniótico, em meio de cultura suplementado por soro fetal bovino ou humano e compará-las. Foram avaliadas seu isolamento e cultivo, padrão de crescimento, morfologia, imunofenótipo, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, e caracterizou-se a expressão dos genes OCT-4, NANOG e SOX2. Foram analisadas amostras provenientes de cinco gestantes, obtidas por amniocentese de segundo trimestre, indicadas por idade materna avançada. As células do líquido amniótico, após centrifugação, foram colocadas em frasco de cultura com meio -MEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (grupo B) ou soro humano (grupo H). Ao atingirem 70% de confluência, foram tripsinizadas e expandidas. Após a terceira passagem celular foram separadas alíquotas do grupo B e H para avaliação de seu potencial de expansão, por meio da construção de curvas de crescimento celular para diferentes inóculos iniciais (1.000, 5.000, 10.000 e 15.000 células). Sua morfologia foi avaliada por microscopia ótica através da coloração de Leishman e por microscopia eletrônica. A análise do imunofenótipo das células dos dois grupos foi realizada por citometria de fluxo, analisando-se os marcadores de superfície: CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 e CD133. A diferenciação osteogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de fosfato-2-ascorbato e -glicerofosfato, comprovada pela produção de cálcio pelas células, coradas pela Alizarina e visualização da Fosfatase Alcalina nas células. A diferenciação condrogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de dexametasona e TGF-1, comprovada pela análise histológica após coloração pela hematoxilina-eosina. Avaliou-se a expressão gênica dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, por RT-PCR das células dos dois grupos (B e H), comparadas aos controles celulares MRC-5 e NTERA-2 cl.D1. Observou-se alta taxa de expansão, sem diferença significativa entre os grupos (p=0,715), mesmo considerando-se a evolução dia-a-dia (p=0,681) e a alta viabilidade celular, com média de 94% nos dois grupos (p=0,686). A análise morfológica das células dos dois grupos revelou aspecto mesenquimal típico, com crescimento celular em cultura também típico dessa linhagem. Ao microscópio eletrônico, observou-se maior número de vacúolos lipídicos naquelas células do grupo H. A imunofenotipagem demonstrou marcação positiva para linhagem mesenquimal e negativa para outras linhagens. Ocorreu diferenciação osteogênica e condrogênica e expressão dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2. Não houve diferença significativa nos aspectos estudados, entre os grupos B e H. Concluiu-se que essas células, isoladas do líquido amniótico, apresentam característica de fácil isolamento, alta taxa de proliferação, aspecto morfológico e imunofenótipo mesenquimal, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, expressando os transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, associados à pluripotência celular, tanto em meio suplementado por soro fetal bovino como por soro humano. / Fetal malformations are a significant cause of fetal death and infant mortality. Regenerative medicine is presented as a third therapeutic method. Cells obtained from the amniotic fluid are seen to be an option of choice for cell therapy because of their high rate of in vitro proliferation, power of selfrenewal and multi-lineage potential. For clinical use the exclusion of nonhuman animal material from the culture medium of these cells is to be recommended, thus precluding immune reactions and the transmission of prions, bacteria and viruses. Bovine fetal serum is a normal component of the culture medium of these cells. Its replacement by human serum precludes those possible consequences. The objective of this present study was investigation into the cells obtained from the amniotic fluid, in a culture medium supplemented with bovine fetal or human serum, and compare them. Their isolation and culture, growth rate, morphology, immune phenotype and osteogenic and chondrogenic capacity were assessed and the expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 genes was characterized. Samples taken from five pregnant women by amniocentesis during the second trimester, recommended by virtue of advanced maternal age, were analyzed. The cells of the amniotic fluid, after centrifugation, were placed in a culture flask with an -MEM medium supplemented with 20% of bovine fetal serum (group B) or human serum (group H). After attaining 70% confluence they were trypsinized and expanded. After the third cellular passage they were separated into quotas of groups B and H for assessment of their expansion potential, by means of the construction of cellular growth curves for the different initial inocula (1,000, 5,000, 10,000 and 15,000 cells). Their morphology was assessed by optical microscopy by means of Leishman´s staining and electron microscopy. The analysis of the immune phenotype of the cells of the two groups was undertaken by flow cytometry, the surface markers CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 and CD133 being analyzed. The osteogenic differentiation was undertaken by the addition of ascorbate-2-phosphate-2 and - glycerophosphate to the culture medium and proved by the production of calcium by the cells, stained with Alizarin, and visualization of the Alkaline Phosphatase in the cells. The chondrogenic differentiation was brought about by the addition of dexamethasone and TGF-1 to the culture medium and demonstrated by histological analysis after staining with hematoxilineeosine. The genic expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 transcripts was compared with the control cells MRC-5 and NTERA-2 cl.D1 by the RTPCR of the cells of the two groups (B and H). A high expansion rate was observed, with no significant difference between the groups (p=0.715), even when the day-to-day progress (p=0.681) was taken into consideration, and high cell viability, with an average of 94% in the two groups (p=0.686). The morphological analysis of the cells of the two groups presented a typical mesenchymal aspect, with cell growth in the culture also typical of this line. Under the electron microscope, a greater number of lipid vacuoles were observed in the cells of the H group. The immune phenotyping presented a positive marking for the mesenchymal line but a negative one for the others. Osteogenic and chondrogenic differentiation occurred as also did expression of the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2. There was no significant difference, as regards the aspects studied, between groups B and H. It is concluded that these cells isolated from the amniotic fluid were characterized by ease of isolation, a high rate of proliferation, mesenchymal morphological aspect and immune phenotype, capacity for osteogenic and chondrogenic differentiation, expressing the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2, both in the medium supplemented with bovine fetal serum and in that with human serum.

Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) são uma ferramenta atrativa para a reparação do tecido ósseo baseada na terapia celular. No presente estudo, foi investigado o potencial osteogênico e adipogênico de CTMs-MO e CTMs-TA, assim como o efeito da intercomunicação entre osteoblastos e adipócitos na expressão do fenótipo celular. CTMs-MO e CTMs-TA de ratos foram cultivadas em meios de crescimento, osteogênico e adipogênico para avaliar a diferenciação osteoblástica e adipocítica. Adicionalmente, osteoblastos e adipócitos foram cocultivados de forma indireta para investigar o efeito dos adipócitos sobre os osteoblastos e vice versa. CTMs-MO e CTMs-TA apresentaram potencial tanto osteogênico quanto adipogênico em condições não indutoras de diferenciação. No entanto, quando expostas ao meio osteogênico, as CTMs-MO exibiram maior expressão gênica de RUNX2, fosfatase alcalina e osteocalcina, expressão proteíca de RUNX2 e maior formação de matriz extracelular mineralizada comparadas às CTMs-TA. Por outro lado, em condições adipogênicas, as CTMs-TA apresentaram maior expressão gênica de PPAR&gamma;, proteína adipocítica 2 e resistina, expressão proteíca de PPAR&gamma; e maior formação de acúmulo lipídico comparadas às CTMs-MO. A presença de adipócitos em coculturas indiretas inibiu a expressão do fenótipo osteoblástico, enquanto os osteoblastos não apresentaram um efeito marcante sobre a expressão do fenótipo adipocítico. Em conclusão, o presente estudo mostrou que as CTMs-MO são mais osteogênicas enquanto as CTMs-TA são mais adipogênicas. Adicionalmente, foi observado que a intercomunicação entre osteoblastos e adipócitos pode afetar negativamente o reparo ósseo. Assim, postulamos que o maior potencial osteogênico das CTMs-MO as tornam a escolha mais adequada para a indução do reparo ósseo baseado na terapia celular. / Mesenchymal stem cells from bone marrow (BM-MSCs) and adipose tissue (AT-MSCs) are attractive tools for cell-based therapies to repair bone tissue. In the present study, we investigated the osteogenic and adipogenic potential of BM-MSCs and AT-MSCs as well as the effect of crosstalk between osteoblasts and adipocytes on cell phenotype expression. Rat BM-MSCs and AT-MSCs were cultured either in growth, osteogenic or adipogenic medium to evaluate osteoblast and adipocyte differentiation. Also, osteoblasts and adipocytes were indirectly cocultured to investigate the effect of adipocytes on osteoblast differentiation and vice versa. BM-MSCs and AT-MSCs exhibit osteogenic and adipogenic potential under non-differentiation-inducing conditions. However, when exposed to osteogenic medium, BM-MSCs exhibited higher gene expression of RUNX2, alkaline phosphatase and osteocalcin, RUNX2 protein expression and more extracellular matrix mineralization compared with AT-MSCs. Conversely, under adipogenic conditions, AT-MSCs displayed higher gene expression of PPAR&gamma;, fatty acid binding protein 4 and resistin, PPAR&gamma; protein expression and more lipid accumulation compared with BM-MSCs. The presence of adipocytes as indirect coculture repressed the expression of osteoblast phenotype while osteoblasts did not exert remarkable effect on adipocyte phenotype expression. In conclusion, the present study showed that BM-MSCs are more osteogenic while AT-MSCs are more adipogenic. Also, we observed that the crosstalk between osteoblasts and adipocytes may negatively impact bone repair. Thus, we postulate that the higher osteogenic potential of BM-MSCs makes them the first choice for inducing bone repair in cell-based therapies.