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Proposta na utilização de biopolímero de cana-de açúcar como suporte na diferenciação “in vitro” de células-tronco mesenquimais humanas em queratinócitosGONDIM, Thiago Gomes de Figueiredo 28 February 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-02-28 / CAPES E PROPESQ/UFPE / As células-tronco mesenquimais constituem uma rara população de células progenitoras com capacidade de diferenciação multipotencial e parecem constituir uma ferramenta atrativa no contexto da engenharia de tecidos e da terapia celular. O desenvolvimento de novos materiais pode ser citado como um setor de vanguarda para a engenharia de tecidos; e os biopolímeros despontam como biomateriais inovadores com vasta aplicação na biologia celular, especialmente em função de sua biocompatibilidade. Nesse contexto, temos como principal objetivo estudar a evolução das características morfológicas das células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano quando cultivadas sobre suportes de biopolímero de cana-de-açúcar (gel ou membranas), enfatizando-se a potencial capacidade dessas células diferenciarem-se em queratinócitos. Cordões umbilicais foram obtidos de parturientes do Setor de Obstetrícia do Hospital das Clínicas/UFPE (n=40, com 30 a 40 semanas de idade gestacional). Veias de cordões umbilicais foram preenchidas com colagenase tipo IV e mantidas a 37º C. As células coletadas foram centrifugadas por 10 minutos e ressuspendidas em meio DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, mistura de antibióticos e plaqueadas em garrafas (105 células/mL). Os aspectos morfológicos das células fenotipicamente semelhantes às células-tronco mesenquimais foram avaliados com 3, 5, 10, 14, 28, 40 e 45 dias, através de microscópio invertido com contraste de fase e sistema de captura de imagem. Com 72h de cultivo sobre um suporte comercial, observamos que as células-tronco mesenquimais apresentaram-se com aspecto fibroblastóide difuso e a formação de monocamada ocorreu com cinco dias. Células cultivadas em placas contendo o gel de biopolímero de cana-de-açúcar também apresentaram morfologia semelhante a fibroblastos (72h), porém mais alongadas e dispostas radialmente; com formação de monocamada em torno de sete dias. Quando cultivadas sobre membranas desse biomaterial, notamos com o auxílio de microscópio invertido, células com formato variando de arredondadas a fibroblastóides, e através da microscopia eletrônica de varredura foi possível detalhar essa variação no formato das células e perceber a emissão de finos prolongamentos (nanofibras). Nos ensaios de diferenciação das células-tronco mesenquimais em queratinócitos usando-se o gel de biopolímero de cana-de-açúcar como suporte, observamos que inicialmente grande parte das células conservou a morfologia arredondada e apresentaram-se de forma enfileirada, especialmente em algumas áreas do referido gel, e em torno de 14 dias a típica forma cubóide-arredondada das colônias de queratinócitos pode ser observada. Os resultados do nosso estudo sugerem que os suportes (gel ou membranas) de biopolímeros de cana-de-açúcar foram capazes de favorecer o crescimento e a diferenciação das células-tronco mesenquimais e mais experimentos deverão ser realizados para que o cultivo dessas células nessas condições, possivelmente, possa fornecer uma fonte eticamente não controversa e facilmente acessível de queratinócitos para futuras aplicações experimentais e clínicas.
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Estudo funcional de células mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 / Functional study of mesenchymal cells with pathogenic mutations in TCOF1Camila Camanzano Ornelas 15 April 2009 (has links)
Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.
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Infusão de células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea em modelo experimental de nefropatia crônica induzida por lesões de podócitos. / Infusion of bone marrow mesenchymal stem cells in an experimental model of chronic nephropathy induced by podocyte injuryRodrigo José Ramalho 27 March 2013 (has links)
Estudos com células tronco (CT) têm despertado grande interesse devido ao seu promissor potencial terapêutico. Neste contexto, as CT mesenquimais (CTm) representam uma alternativa para o tratamento de diversas patologias em diferentes órgãos, inclusive o rim e as glomerulopatias que o acometem. As doenças glomerulares constituem uma freqüente causa de doença renal crônica e se caracterizam por apresentar proteinúria. Neste processo, os podócitos são células que apresentam um papel crucial, sendo que as podocitopatias se associam com o aparecimento de proteinúria e desenvolvimento de esclerose glomerular. A obtenção de um modelo de podocitopatia através da administração de aminonucleosídeo de puromicina (PAN), permite a melhor compreensão dessas células altamente diferenciadas que não possuem potencial de proliferação ou regeneração. O presente projeto teve como objetivo estabelecer o modelo experimental de nefropatia crônica induzida por PAN associado à nefrectomia unilateral (UniNx) para induzir lesões glomerulares mais exuberantes e, neste modelo experimental, avaliar o efeito da infusão de CTm derivadas da medula óssea. Ratos Wistar (n=52) foram divididos em três grupos: Controle (UniNx), PAN (PAN+UniNx) e PAN+CTm (PAN+UniNx+CTm). As CTm foram inoculadas na região subcapsular renal no dia 0 e os animais foram sacrificados após 30 e 60 dias. O efeito da infusão das CTm no tecido renal foi avaliado através de parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, microscopia eletrônica e PCR em tempo real. Paralelamente, o projeto analisou a diferenciação in vitro de CTm em podócitos através do estímulo com colágeno tipo IV e através de cocultura de glomérulos isolados de ratos com CTm. A diferenciação celular das CTm foi analisada por citometria de fluxo, imunocitoquímica e PCR em tempo real para genes de proteínas podocitárias. No modelo in vivo foi possível observar a presença de CTm até 15 dias após a inoculação na região subcapsular renal. As CTm foram capazes de diminuir significativamente a proteinúria e a albuminúria com 30 e 60 dias, assim como a pressão arterial aos 60 dias. Não houve diferença nos valores de creatinina, uréia sérica, glomeruloesclerose e fibrose intersticial entre o grupo PAN e o grupo PAN+CTm. As CTm foram responsáveis pela diminuição significativa da fusão dos pedicelos à microscopia eletrônica, com melhora da expressão relativa de WT1 aos 60 dias e melhora parcial da expressão gênica de nefrina, podocina e sinaptopodina. A expressão proteica de WT1 também foi significativamente maior no grupo PAN+CTm em comparação ao grupo PAN. Além disso, houve melhora significante da expressão relativa de IL-4 e IL-10, e diminuição de IL-1? e TNF-? no grupo tratado. Ainda, as CTm promoveram aumento significativo da expressão gênica de VEGF aos 60 dias. Nos resultados in vitro não houve diferenciação das CTm em podócitos quando cultivadas com colágeno IV, assim como a cocultura com glomérulos não proporcionou alteração na expressão de marcadores de superfície das CTm. Concluímos que a terapia celular com CTm foi capaz de induzir proteção renal caracterizada por diminuição da proteinúria, da albuminúria e da pressão arterial, associado a menor fusão dos pedicelos, maior expressão gênica de proteínas podocitárias e de expressão celular de WT1. As citocinas inflamatórias IL-1?, TNF-?, IL-4 e IL-10, em conjunto com o VEGF, foram os possíveis mediadores responsáveis por estes resultados / Stem cells (SC) have emerged as a potential therapeutic approach for several diseases. In this context, the mesenchymal SC (mSC) are considered an alternative for the treatment of kidney diseases such as glomerulopathies. Glomerular diseases are an important cause of chronic kidney disease (CKD) and are characterized by proteinuria. In this process, the podocytes are cells that have a critical role, and the podocytopathies are associated with the onset of proteinuria and glomerular sclerosis. The achievement of a podocytopathy model through administration of puromycin (PAN) allows a better understanding of these highly differentiated cells which do not have the potential for proliferation or regeneration. The aim of the present study was to establish an experimental model of chronic nephropathy induced by PAN associated with unilateral nephrectomy (UniNx), to induce early and marked glomerular lesions and, in this experimental model, to evaluate the effect of bone marrow mSC infusion. Wistar rats (n=52) were randomly divided into three groups: Control (UniNx), PAN (PAN+UniNx) and PAN+mSC (PAN+UniNx+mSC). mSC were inoculated into the subcapsular renal region on day 0, and the animals were sacrificed after 30 and 60 days. The mSC infusion effects in renal tissue were evaluated by clinical and laboratory parameters, histology, immunohistochemistry, electron microscopy and real-time PCR. In parallel, we analyzed whether mSC could differentiate in vitro into podocytes through stimulation with collagen type IV or by means of co-culture of isolated rat glomeruli with mSC. The cell differentiation was analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and real-time PCR. In the in vivo model, mSC were detected until 15 days after inoculation in the renal subcapsular region. mSC were able to significantly reduce the proteinuria and albuminuria with 30 and 60 days, as well as blood pressure at 60 days. There was no difference in the values of creatinine, BUN, glomerulosclerosis and interstitial fibrosis between the groups PAN and PAN+mSC. The treated group showed lower effacement of foot process by electron microscopy, with significant improvement in the relative expression of WT1 in 60 days and partial improvement of nephrin, podocyn and synaptopodin. The WT1 protein expression was also significantly higher in the PAN+mSC group compared to the PAN group. In addition, mSC treatment significantly reduced gene expression of IL-1? and TNF-?, as well as increased the expression of IL-4 and IL-10. At 60 days mSC promoted significant increase of VEGF relative expression. In vitro results, mSC cultived with collagen type IV did not show differentiation to podocytes and the co-culture with glomeruli provided no change in expression of mSC surface markers. In conclusion, mSC therapy in the PAN model was able to induce renal protection characterized by the reduction of albuminuria, proteinuria and blood pressure, associated with a lower effacement of foot process, increased gene expression of podocytes proteins and cellular expression of WT1. Inflammatory cytokines IL-1?, TNF-?, IL-4 and IL-10 associated with VEGF were the probable mediators of these results, promoting podocyte protection
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Participação de quinases reguladas por sinais extracelulares na interação entre células-tronco mesenquimais e titânio durante a diferenciação osteoblástica e adipocítica / Participation of extracellular signal-regulated kinases in mesenchymal stem cells and titanium interaction during osteoblast and adipocyte differentiationHeitor Fontes da Silva 23 September 2016 (has links)
A osseointegração de implantes de titânio (Ti) é dependente da interação entre a superfície de Ti e células, a qual é modulada por diversas vias de sinalização intracelular. Sabe-se que as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs), membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), atuam tanto na osteogênese, quanto na adipogênese e, portanto, podem estar envolvidas no processo de osseointegração de Ti. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a interação entre células-tronco mesenquimais (CTMs) e superfícies de Ti usinada e com nanotopografia é modulada, ao menos em parte, por ERK1/2 e o consequente efeito da inibição dessas ERKs na diferenciação osteoblástica e adipocítica. Para isso, CTMs derivadas de medula óssea de ratos foram cultivadas sobre discos de Ti usinados e com nanotopografia em condições osteogênicas e adipogênicas, na presença ou não do inibidor de ERK1/2, PD98059, em concentração previamente determinada (25 μM) e foram avaliados parâmetros relacionados à diferenciação osteoblástica e adipocítica. Os resultados mostraram que a expressão gênica dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC) foi aumentada pela inibição da via de sinalização de ERK1/2 nas células crescidas sobre Ti usinado e apenas ALP e OC, naquelas crescidas sobre Ti com nanotopografia. A expressão proteica de RUNX2 foi discretamente maior nas células crescidas sobre Ti usinado, mas não sobre Ti com nanotopografia, quando ERK1/2 foram inibidas e essa inibição não afetou a formação de matriz extracelular mineralizada, independentemente da superfície de Ti avaliada. Com relação à diferenciação adipocítica, a inibição da via de sinalização de ERK1/2 aumentou a expressão gênica dos marcadores adipocíticos PPARγ, adiponectina (ADIPOQ) e proteína ligadora de ácido graxo do adipócito ( AP2) nas células crescidas sobre ambas as superfícies de Ti, com efeito mais acentuado na superfície usinada, sem afetar a formação de acúmulo lípidico. Em conclusão, os resultados mostraram que a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação osteoblástica de CTMs crescidas sobre a superfície de Ti usinada, mas não sobre Ti com nanotopografia. Além disso, a inibição de ERK1/2 favoreceu a diferenciação adipocítica de CTMs crescidas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e usinada, sendo o efeito mais acentuado na usinada. Considerando aplicações terapêuticas, esses resultados são relevantes para direcionar o desenvolvimento de superfícies de biomateriais que atuem em vias de sinalização que sabidamente modulam o processo de osteogênese. / Osseointegration of titanium (Ti) implants depends on interaction between Ti surface and cells, which is modulated by several intracellular signaling pathways. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) are members of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) family and act on both osteogenesis and adipogenesis and, therefore, may be involved in the process of Ti osseointegration. In this context, the aim of this study was to evaluate if the interaction between mesenchymal stem cells (MSCs) and Ti surfaces, either machined or with nanotopography, is modulated, at least in part, by ERK1/2 and the effect of ERK1/2 inhibition on osteoblast and adipocyte differentiation. Rat bone marrow MSCs were cultured on Ti discs either machined or with nanotopography under osteogenic and adipogenic conditions, in presence or not of the ERK1/2 inhibitor, PD98059, at a concentration previously determined (25 μM) and it was evaluated parameters related to osteoblast and adipocyte differentiation. The results showed that gene expression of the bone markers RUNX2, osterix (OSX), alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) was increased by ERK1/2 signaling inhibition in cells grown on machined Ti and only ALP and OC in cells grown on Ti with nanotopography. RUNX2 protein expression was slightly higher in cells grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography, when ERK1/2 signaling was inhibited and such inhibition did not affect extracellular matrix mineralization, irrespective of the evaluated Ti surface. Regarding adipocyte differentiation, ERK1/2 signaling inhibition increased gene expression of the adipose tissue markers PPARγ, adiponectin (ADIPOQ) and adipocyte fatty acid-binding protein (AP2) in cells grown on both Ti surfaces, with more prominet effect on machined one, without affecting lipid accumulation. In conclusion, our results showed that ERK1/2 signaling inhibition favored osteoblast differentiation of MSCs grown on machined Ti, but not on Ti with nanotopography. In addition, ERK1/2 signaling inhibition favored adipocyte differentiation of MSCs grown on both Ti surfaces, being more noticeable on machined one. Considering therapeutical applications, these results are relevant to drive the development of biomaterial surfaces to act on signaling pathways that regulate the process of osteogenesis.
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Estabelecimento de cultura de células de pluripotência induzida a partir de células tronco derivadas do tecido adiposo de coelhos / Establishment of culture of induced pluripotent stem cells from adipose derived stem cells of rabbitsHelena Debiazi Zomer 17 December 2013 (has links)
As células de pluripotência induzida (iPS) foram reportadas pela primeira vez em 2006 por Takahashi e Yamanaka e desde então vem sendo extensivamente estudadas. Por meio da técnica, células somáticas adultas adquirem comportamento muito semelhante às células tronco embrionárias, reduzindo as questões éticas relacionadas ao uso destas em pesquisas. Entretanto, os mecanismos biológicos das células iPS ainda não estão completamente elucidados. Ainda são necessárias pesquisas mais aprofundadas para garantir a segurança e eficácia de sua possível utilização em futuras terapias. Os coelhos, como modelos experimentais, são vantajosos tanto pelo seu tamanho ideal para procedimentos cirúrgicos quanto por sua manutenção fácil e econômica. As células tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) consistem em um tipo de célula tronco mesenquimal multipotente que se destaca pela facilidade, rapidez e segurança de coleta e processamento. As ADSC foram coletadas e caracterizadas por meio de análises de curva de crescimento celular, doubling time, viabilidade após criopreservação, capacidade de formação de colônias fibroblastoides, diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica, imunocitoquímica e citometria de fluxo. Elas demonstraram possuir as características básicas de células tronco mesenquimais, destacando-se por uma alta e rápida capacidade proliferativa. A indução de pluripotência foi realizada nas ADSC de coelhos pela introdução de quatro fatores de transcrição (OCT4, SOX2, cMYC, e KLF4), pelo vetor lentiviral STEMCCA (Milipore). Cinco protocolos de indução foram testados. Células resultantes da indução foram caracterizadas quanto à atividade da fosfatase alcalina e perfil fenotípico por citometria de fluxo. A proliferação acentuada das ADSC parece ser um fator limitante para a eficácia da reprogramação. A partir destes dados, espera-se contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia brasileira ainda inédita em coelhos e adicionar informações importantes à literatura, acerca das propriedades das células iPS, visando sua utilização como modelo experimental para futuras terapias. / Induced Pluripotent Stem (iPS) cells were first reported in 2006 by Takahashi e Yamanaka and has been intensively studied since then. Through the technique, adult somatic cells acquire behavior very similar to embryonic stem cells, reducing the ethical issues related to the use of such research. However, biological mechanisms of iPS cells are not yet fully elucidated. Thus, further research is needed to ensure the safety and efficacy for their possible use in future therapies. Rabbits, as experimental models, are advantageous by their ideal size for surgical procedures and easy and economic maintenance. Adipose Derived Stem Cells (ADSC) consists of multipotent mesenchymal stem cells that stand for ease, speed and safety of collection and processing. The ADSC were collected and characterized by analysis of cell growth curve, doubling time, viability after cryopreservation, ability of fibroblast colony formation, osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation, immunocytochemistry and flow cytometry. They showed to have the basic characteristics of mesenchymal stem cells, standing out by a high and fast proliferative capacity. Induction of pluripotency was performed in rabbits ADSC by the introduction of four transcription factors (OCT4, SOX2, cMYC, and KLF4) by lentiviral vector STEMCCA (Millipore). Five protocols were tested and analyzed. The resulting cells after induction were characterized by alkaline phosphatase activity and phenotypic profile by flow cytometry. The great proliferation of ADSC seems to be detrimental for the reprogramming efficiency. From these data, it is expected to contribute to the development of a Brazilian technology still unpublished in rabbits, and to add important information to the literature about the properties of iPS cells, aiming their use as an experimental model for future therapies.
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Reparo ósseo com a utilização de células tronco em ratos submetidos à desnutrição neonataldo Nascimento Fraga, Simone 31 January 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A desnutrição constitui um problema de saúde pública caracterizado pela baixa ingestão
de nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento do organismo. Pesquisas
que envolvem desnutrição e a sua repercussão na vida adulta relevam que ela é capaz de
provocar alterações na programação metabólica que repercutem ao longo da vida. No
entanto, ainda pouco se conhece sobre as seqüelas envolvendo as células tronco adultas
de medula óssea (CTAMO), especialmente sobre as células tronco mesenquimais em
relação à quantidade e sua capacidade de diferenciação em tecido ósseo. O objetivo
deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o número de células
tronco, bem como avaliar o reparo ósseo com essas células em lesões ósseas de animais
desnutridos. Para isso, utilizou-se 64 ratos machos Wistar, dos quais 32 receberam dieta
padrão (nutridos-N), com 23% de proteínas, e o restante recebeu Dieta Básica Regional
(DBR) (desnutridos-D) com 7,87% de proteínas no período de aleitamento. O peso dos
ratos foi aferido até completarem a idade adulta, quando eles foram subdivididos em 4
grupos (n=8): 1. N que receberam células tronco de N (G1); 2. D que receberam células
tronco de D (G2); 3. N que receberam células tronco de D (G3) e 4. D que receberam
células tronco de N (G4). Os outros ratos (N e D) foram usados como doadores de
CTAMO que foram cultivadas por 12 dias e diferenciadas, in vitro, em osteoblastos que,
por sua vez, foram implantados em defeitos críticos confeccionados nos ossos parietais
dos ratos. Após 60 dias, estes foram eutanasiados e as calotas cranianas processadas
para microscopia óptica. A leitura foi realizada por três patologistas e o índice Kappa
foi utilizado para avaliar o grau de concordância entre eles. Para a análise dos pesos e
do número de células tronco, utilizou-se o teste t-Student (p< 0,05). O teste de Mann-
Whitney foi aplicado quando os resultados não passaram no teste de normalidade. Os
ratos desnutridos tiveram redução do ganho de peso desde o segundo dia de vida,
enquanto que o número de CTAMO não apresentou diferença entre N e D. As células
tronco mesenquimais de D, entretanto, apresentaram-se em maior quantidade.
Observou-se um pequeno grau de reparo ósseo entre os grupos, principalmente entre G2
e G4. Com esses dados, pode-se sugerir que a desnutrição neonatal interfere de forma
permanente na vida adulta, sobre o número e a capacidade regenerativa tecidual das
células tronco mesenquimais de medula óssea. Embora essas células tenham um grande
potencial de diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de
tecidos, a desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu
potencial terapêutico no tecido ósseo
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Comparação do potencial terapêutico de células mesenquimais e pericitos em modelo murino de distrofia muscular / Comparison of therapeutics properties of mesenchymal cells and pericytes in dystrophic mouse modelJuliana Plat de Aguiar Gomes 16 September 2014 (has links)
As distrofias musculares progressivas (DMP) são um grupo de doenças genéticas hereditárias caracterizadas pela degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e mais grave de DMP, com prevalência de 1 a cada 3500 a 5000 meninos. Em geral, a perda da ambulação ocorre entre 9 a 12 anos e complicações respiratórias e cardíacas podem levar ao óbito a partir da segunda década. A pesquisa em terapia celular iniciou-se com o objetivo de reverter ou diminuir a progressão do processo distrófico através do repovoamento do músculo com células normais. Atualmente, acredita-se em um benefício terapêutico com base nas propriedades anti-inflamatórias, anti-fibróticas e imunomodulatórias das células tronco adultas (CTA). As CTAs mesenquimais são bastante heterogêneas quanto à sua composição celular o que ocasiona inconsistência de resultados. Por isso, a caracterização e separação de sub-populações através de marcadores específicos e o enriquecimento de culturas de CTA com um subtipo celular de interesse pode aumentar a robustez e o efeito das terapias. Uma dessas subpopulações é o pericito que, ao contrário das CTAs mesenquimais, foi bem descrito quanto à sua localização e função in vivo. Além disso, pericitos derivados de tecido adiposo humano aumentaram a sobrevida de camundongos duplo mutantes para distrofina e utrofina (dko). Dessa forma, este trabalho pretendeu comparar o potencial terapêutico de CTAs mesenquimais e pericitos de um mesmo tecido adiposo em camundongos dko. Conseguimos confirmar o resultado anterior, mostrando que os pericitos tendem a melhorar a sobrevida de animais tratados, sendo ainda melhores do que células mesenquimais, mas a melhora perdura somente durante o tratamento. A sobrevida é maior no começo do tratamento, sugerindo que o quanto antes o tratamento for iniciado, com animais mais jovens e sintomas mais leves, melhor poderá ser o resultado. Outras perguntas a serem pesquisadas na tentativa de melhorar o efeito terapêutico da terapia celular com pericitos são: número de injeções, quantidade de células a serem injetadas, tempo de tratamento e idade das células \"doadoras\" / Progressive muscular dystrophies (PMD) are inherited genetic diseases characterized by progressive muscle loss and weakness. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and aggressive form of PMD, with incidence of 1 in every 3500-5000 boys. In general, patients with DMD are confined to wheelchairs around 9-12 years of age and death occurs due to respiratory and heart dysfunction after the second decade. Cell therapy research at first aimed to recover or slow down the dystrophic process by repopulating the patient\'s muscle with normal cells. However, nowadays it is believed also that therapeutic benefits occur by the anti-inflammatory, anti-fibrotic and immunomodulation properties of mesenchymal stem cells (MSC). MSC are constituted by an heterogeneous cell population and therefore, cell sorting of the subpopulation cell of interest is being done routinely. By doing this enrichment, the effect can be more robust and powerful. One of the cell populations of interest for research is pericyte, which are cells well defined regarding their in vivo function and location, as opposed to MSC. Besides that, pericytes derived from adipose tissue were successful in increasing survival of double knockout mice for dystrophin and utrophin (dko). The present work aimed to compare the therapeutic potential of MSC and pericytes derived from the same adipose tissue sample in the dko mouse model. We confirmed our previous results, showing that pericytes tend to improve the survival of treated mice, and are even better than MSC from the same source but the trend was statistically significant only during the treatment period. Additionally, we also observed that the survival was better in the beginning of treatment, suggesting that earlier treatment may lead to a better therapeutic effect. In an attempt to increase the therapeutic effect of these procedure other questions to be asked are: the number of injections and number of cells per injection, the duration of the treatment and the \"age\" of the donor cells
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Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano / Contribution of mesenchymal stem cells to the tumorigenic properties of human glioblastoma cellsCarolina de Oliveira Rodini 11 March 2016 (has links)
Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular / Mesenchymal stem cells (MSC) display tropism to tumors, being recruited to its microenvironment where they comprise the tumor stroma. In brain, perivascular niche is a substantial source of MSC. Although mechanisms involved are poorly understood, MSC may directly and/or indirectly contribute to tumor development. Herein, the influence of MSC on the proliferation, invasiveness and tumorigenicity of human glioblastoma cells (GBM) was investigated. Moreover, since MSC releases TGFB1, a multifunctional cytokine with roles in immunomodulation, proliferation, migration and epithelial-mesenchymal transition of tumor cells, we analyzed if MSC-secreted TGFB1 affects GBM behavior. In vitro studies performed in the presence of conditioned media from human umbilical cord MSC with a stable TGFB1 gene expression knockdown showed that MSC-secreted TGFB1 is able to significantly increase the proliferation and viability of a GBM cell line (U87FP635). These results revealed an important paracrine effect of this regulatory cytokine when secreted by other cell types in tumor microenvironment. However, under experimental conditions that better mimic the tumor microenvironment, it was found that MSC also affect tumor cell behavior by an alternative mechanism dependent on cell-cell contact, but independent of TGFB1 levels secreted by MSC. The cell-cell contact between MSC and GBM U87FP635 significantly enhaced tumor viable cells. Additionally, the spheroid tumor cell culture with MSC cell contact increased the invasiveness of U87FP635 cells. Finally, in vivo ectopic implantation model showed more developed tumors when GBM U87FP635 cells were coinjected with MSC. These pro-tumorigenic effects were found both in cell-cell contact with control MSC, as with MSC containing TGFB1 gene expression knockdown. Thus, these findings indicate that MSC can exert pro-tumorigenic effects by two alternative and independent mechanisms: paracrine action of TGFB1 secreted by MSC and action mediated by cell-cell contact. In the present experimental conditions, the cell-cell contact-dependent mechanism was predominant. The secretome proteomic study of those cells identified 126 differentially expressed proteins as well as 10 proteins exclusively detected in conditioned media from GBM U87FP635 cell cocultures with MSC. About 80% of proteins uniquely secreted by cell-cell contact are exosomes components and are involved in cell proliferation and tissue development. These results indicate a dynamic interaction of communication between MSC and tumor cells and reveal some interesting proteins potentially involved in a MSC pro-tumorigenic action mediated by cell contact
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Análise do transcriptoma de células-tronco mesenquimais para o estudo da etiologia das fissuras lábio-palatinas não-sindrômicas / Transcriptome analysis of mesenchymal stem cells to investigate the aetiology of non-syndromic cleft lip and palateGerson Shigeru Kobayashi 01 July 2011 (has links)
A fissura lábio-palatina não-sindrômica (FLP NS) é uma doença multifatorial, determinada pela interação entre fatores genéticos e ambientais e sua incidência é estimada entre 0,34 e 2,29 a cada 1000 nascimentos. Trata-se de uma embriopatia causada por erros durante a morfogênese orofacial, a qual depende de uma fina regulação de mecanismos como proliferação celular, remodelagem de matriz extracelular, e transição epitélio-mesenquimal. Apesar de intensos esforços para se determinar fatores genéticos e ambientais de susceptibilidade, a etiologia desta malformação permanece pouco compreendida. Vários loci associados às FLP NS vêm sendo identificados por meio de estudos de mapeamento gênico convencionais, entretanto, a grande maioria dos resultados não se replica em diferentes estudos, e não há clareza acerca do efeito funcional das variantes detectadas. Neste contexto, uma abordagem interessante para investigar a etiologia da doença é a análise de expressão gênica, que pode ser utilizada para identificar alterações de vias biológicas que convergem na manifestação do quadro clínico. Em vista disso, neste trabalho nós utilizamos a análise do transcriptoma de células-tronco de polpa dental de pacientes portadores de FLP NS, com o intuito de identificar padrões de expressão relacionados a mecanismos biológicos relevantes para a embriopatogênese da doença. Obtivemos padrões de expressão que sugerem desregulação de mecanismos associados à remodelagem de matriz extracelular e à transição epitélio-mesenquimal. Além disso, ao utilizarmos diferentes condições de cultura celular, verificamos em uma nova amostra de pacientes a desregulação de vias biológicas relacionadas ao reparo de DNA e checkpoint do ciclo celular. Nossos dados revelam a aplicabilidade das células-tronco de polpa dental para este tipo de abordagem, e indicam que tais perfis de expressão podem levar ao acometimento da morfogênese lábio-palatina. Além disso, mostramos pela primeira vez uma conexão entre desregulação de expressão gênica e a documentada maior incidência de formas esporádicas de câncer em famílias segregando a FLP NS. Nossos resultados abrem novas possibilidades para a investigação da etiologia das FLP NS, e ajudarão na compreensão dos eventos embrionários que predispõem a essa malformação. / Non-syndromic cleft lip and palate (NSCL/P) is a multifactorial disease determined by the interplay between genetic and environmental factors, with a variable incidence of 0.34-2.29:1000 births. This malformation arises from errors during lip and palate morphogenesis, which requires tight regulation of biological mechanisms such as cellular proliferation, extracellular matrix remodelling, and epithelial-mesenchymal transition. Albeit much effort has been put into determining the genetic and environmental factors underlying disease susceptibility, the aetiology of NSCL/P remains obscure. Many candidate loci have been identified through conventional gene mapping strategies, however, there is a general lack of reproducibility across studies, and there is no consensus with regard to the functional implications of the identified genetic variants. In this context, an alternative approach resides in assessing differential expression patterns to identify alterations in biological networks that could lead to phenotype manifestation. Here, we analysed the transcriptome of dental pulp stem cells from NSCL/P patients in order to pinpoint dysregulated pathways involved in the embryopathogenesis of the disease. We encountered expression patterns related to dysregulation of extracellular matrix remodelling and epithelial mesenchymal transition. Moreover, by subjecting a novel NSCL/P sample to differential cell culture conditions, we observed abnormal transcription of genes partaking in DNA repair and cell cycle checkpoint pathways. Our results show the applicability of dental pulp stem cells to this strategy and suggest that the observed expression patterns could lead to impairment of lip and palate morphogenesis. Moreover, we described for the first time a connection between abnormal gene expression in these individuals and the elevated occurrence of sporadic cancer types in NSCL/P families. Our results open new possibilities to investigate the aetiology of NSCL/P and provide further insight into the ontogenetic events underlying disease predisposition.
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Efeito da aplicação local do curcumin nanoparticulado sobre o reparo ósseo in vivo e potencial osteogênico in vitro /Silva, Amanda Favoreto. January 2020 (has links)
Orientador: Morgana Rodrigues Guimarães Stabili / Resumo: Curcumin é um composto ativo derivado da planta Curcuma longa que exibe uma variedade de atividades biológicas, potencial anti-inflamatório e imunomodulatório, que pode ser associado ao tratamento de uma série de condições, como doenças inflamatórias intestinais, artrite reumatoide, câncer, diabetes e periodontite. Recentemente, a literatura também tem demonstrado o potencial do composto sobre o reparo ósseo, entretanto, os dados ainda são contraditórios. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da administração tópica do curcumin veiculado em nanopartículas de PLGA sobre a formação/reparo ósseo de defeitos críticos in vivo, e investigar seu potencial biológico in vivo e in vitro. Defeitos ósseos confeccionados na calvária de ratos machos foram preenchidos com solução salina (controle), curcumin nanoparticulado 0,05mg/ml ou veículo utilizado na diluição do composto (nanopartícula vazia) por 7, 14 e 28 dias. A fração de volume ósseo no interior do defeito nos diferentes grupos foram avaliados por microtomografia óssea (μCT); expressão e imunolocalização dos marcadores do turnover tecidual (RANKL, OPG, PCNA e RUNX2) foram investigados por imuno-histoquímica, enquanto as características teciduais do tecido neoformado foram observadas através da análise histológica descritiva e estereometria. In vitro, o potencial do curcumin nanoparticulado em estimular a diferenciação osteogênica de células estromais derivadas da medula óssea (BMSCs) de ratos foi avaliado determinando-se a at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Curcumin is an active compound derived from the Curcuma longa plant that exhibits a variety of biological activities, anti-inflammatory and immunomodulatory potential, which can be associated with the treatment of a number of conditions, such as inflammatory bowel diseases, rheumatoid arthritis, cancer, diabetes and periodontitis. Recently, the literature has also demonstrated the potential of the compound on bone repair, however, the data are still contradictory. The aim of this study is to evaluate the effect of topical administration of curcumin-loaded PLGA nanoparticles on bone formation / repair of critical defects in vivo, and to investigate its biological potential in vivo and in vitro. Bone defects made in the calvaria of rats were filled with saline solution (control), nanoparticulate curcumin 0,05mg/ml, or vehicle used in the dilution of the compound (empty nanoparticle) for 7, 14 and 28 days. The fraction of bone volume within the defect in the different groups was assessed by microcomputed tomography (μCT); expression and immunolocation of tissue turnover markers (RANKL, OPG, PCNA and RUNX2) were investigated by immunohistochemistry, while the tissue characteristics of the newly formed tissue were observed through descriptive histological analysis and stereometry. In vitro, the potential of nanoparticulate curcumin in stimulating osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived stromal cells (BMSCs) was assessed by determining the activity of alkaline phospha... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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