As células estromais mesenquimais (CMMs) se tornaram de grande interesse para a terapia celular devido ao seu potencial de se diferenciar e reconstituir tecidos especializados. Mais recentemente, este interesse tem aumentado significativamente devido à descoberta de que as CMMs são capazes de secretar uma infinidade de mediadores para estimular a regeneração in situ de tecidos lesados. Dessa forma, CMMs podem ser consideradas tanto como um produto terapêutico em si, quanto uma biofábrica de diversas proteínas relevantes do ponto de vista terapêutico. Para atender a estas crescentes demandas, ambas as aplicações requerem o desenvolvimento de processos de expansão celular com alto rendimento, sob condições de cultivo definidas, reprodutíveis, escalonáveis, permitindo a obtenção de produtos com adequada identidade, potência, pureza, segurança e viáveis economicamente. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivos principais o estabelecimento de um processo de expansão de CMMs baseado em biorreatores e a caracterização do secretoma destas células visando aplicações terapêuticas. Para isto, a expansão de CMMs do cordão umbilical (MCUs) foi realizada em frascos multicamadas (MC) e nos biorreatores de leito fixo (LF), tanque agitado com microcarregadores (TA) e fibrasocas (FO). Os resultados mostraram que a taxa de proliferação específica das células foi maior (< tempo de duplicação) no biorreator de FO (36,8 ± 1,7 horas), bem como o fator de expansão (9,8 ± 1,0) e a eficiência na recuperação celular (100%). Um nível similar de produção celular foi observado para o TA, MC e LF com elevado fator de expansão celular (8,8 ± 0,39, 8,7 ± 0,90, 6,9 ± 1,3, respectivamente). No entanto, em termos de eficiência na recuperação celular (%), LF apresentou a menor taxa de recuperação dentre todos os sistemas (18% (± 0,77)), acompanhado pelo TA (61% (± 15,7)). As células mantiveram suas características imunofenotípicas e o potencial de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos em todos os sistemas de cultivo avaliados. Foi também realizada a análise de custos (COG) e avaliação da viabilidade econômica para produção de CMMs visando tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) em escala comercial, utilizando os sistemas de cultivo avaliados experimentalmente sob diferentes estratégias de reembolso. Apesar dos resultados experimentais satisfatórios para o biorreator FO, o COG revelou que este sistema tem o maior custo devido aos elevados custos dos consumíveis requeridos e do custo do equipamento. O frasco MC foi considerado como a tecnologia mais rentável e robusta no cenário avaliado e o biorreator TA obteve a segunda posição. O biorreator TA foi escolhido como o mais adequado analisando de maneira conjunta os dados experimentais obtidos, a análise dos custos dos diferentes sistemas de cultivo e a escalonabilidade de cada sistema. Assim, esse biorreator foi eficientemente utilizado para o cultivo de MCUs em condições isentas de SFB e xenoantígenos, sendo possível a produção de uma grande quantidade de células, representando um passo importante no desenvolvimento de um bioprocesso em conformidade com as normas das agências regulatórias. Por fim, com a análise do secretoma das CMMs por espectrometria de massas foi possível a identificação de uma gama enorme de proteínas interessantes (aprox. 2400) envolvidas em importantes processos biológicos. O futuro monitoramento dessas proteínas em biorreatores poderá representar um método inovador e original de produção de produtos livres de células para uso na terapia celular. / Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) have become of great interest for cell therapy because of its potential to differentiate and reconstitute specialized tissues. More recently, such interest has significantly increased due to the discovery that MSC are capable of secreting a plethora of mediators to stimulate the in situ regeneration of injured tissues. Thus, MSC can be considered as a therapeutic product itself and as a biofactory of various relevant therapeutic proteins. To meet these increasing demands, both applications require the development of high-yield, reproducible, scalable and cost-effective bioprocesses under defined culture conditions, obtaining products with proper identity, purity and safety. Based on these, the main goal of this work was the establishment of a MSC expansion process based on bioreactors and secretome characterization of these cells targeting therapeutic applications. The MSC expansion was performed using multi-layered flasks (ML) and fixed bed (PB), stirred tank (STR) and hollow fiber (HF) bioreactors. The results showed that the proliferation rate of the cells was higher (< doubling time) in the HF bioreactor (36.8 ± 1.7 hours), as well as the expansion fold-increase (9.8±1.0) and harvesting efficiency (100%). A similar level of cell production was observed for STR, ML and PB with high fold-increase (8.8±0.39, 8.7±0.90, 6.9±1.3, respectively). However, in terms of harvesting efficiency (%), PB bioreactor presented the lowest retrieval rate across all the technologies (18% (±0.77)), followed by STR (61% (±15.7)). The cells retained their functional properties after culture in all the culture systems evaluated. This study was then extended through the use of a bioprocess economics tool for the evaluation of the economic feasibility of producing MSC-based treatment for acute graft vs. host disease (aGvHD) at commercial scale, using the culture systems experimentally evaluated under different reimbursement strategies. Despite the advantageous experimental results of HF bioreactors, the COG analysis has revealed that this is the least cost effective cell culture system to be used, due to its high consumable and equipment costs. ML flasks ranked first as the most cost effective and robust technology in this scenario and microcarrier-based technologies (STR) ranked in second position. The STR bioreactor was chosen as the most suitable for MSC expansion analyzing the experimental data, COG analysis and scalability of each culture system. Thus, STR bioreactor was efficiently tested for MSC expansion under serum and xeno-free conditions and it was possible to produce a large amount of cells. The development of a scalable microcarrier-based stirred culture system using xeno-free culture medium that suits the intrinsic features of UCM-derived MSC represents an important step towards a GMP compliant large-scale production platform for these promising cell therapy candidates. Finally, with the MSC secretome analysis by mass spectrometry it was possible to identify a wide range of interesting proteins (approx. 2400) involved in important biological processes. The future monitoring of these proteins in bioreactors may represent a novel and unique method of producing cell-free products for use in cellular therapy.

Em estudos anteriores desenvolvidos por este grupo de pesquisa uma expressão mais elevada de alvos transcricionais e componentes da via NF-kB, bem como altos níveis de NOTCH1, foi identificada em células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) quando comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO). Este grupo verificou ainda, por comparação das células CD34+ com as CD133+ (mais primitivas) que diversos fatores de transcrição (FT) envolvidos com o potencial de hemangioblasto, com a autorenovação das CTH, e com a diferenciação linfóide; como: RUNX1/AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXA9 e HOXB4 apresentaram-se mais expressos em células mais primitivas. A potencial participação das vias Notch e NF-kB na regulação destes FT tem importância conceitual e prática no entendimento da biologia das CTH, e dos processos envolvidos na diferenciação destas células. Com isto em vista, este projeto teve como objetivo, estudar o papel da via NF-kB e da via Notch na regulação destes FT. Para isso, um modelo experimental in vitro, de diferenciação de CTH CD34+ em linfócitos T, foi utilizado e a influência de fatores agonistas e inibidores farmacológicos destas vias, foram avaliados por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Nossos resultados evidenciam o papel da via Notch na regulação transcricional de HOXB4 e GATA3 em células-tronco hematopoéticas CD34+ humanas, o que foi confirmado com base na expressão dos alvos diretos de Notch (HEY1 e HES1). Notamos ainda, que a expressão dos transcritos HES1, GATA3 e HOXB4 é prejudicada pela síntese protéica das CTH, uma vez que quando empregamos o prétratamento com a droga CHX há aumento da transcrição dos mesmos. Também podemos inferir que a ação do TNF- é positiva sobre esses transcritos, já que quando o utilizamos há elevação do nível de expressão desses transcritos, com exceção a HES1. Em relação ao cocultivo das CTH com as células estromais de camundongos, verificamos que apenas a linhagem OP9-DL1 detém a capacidade de promover a diferenciação celular T, e isso foi comprovado pelo surgimento de células comprometidas com a linhagem linfocítica T, através da presença dos marcadores de superfície específico CD7+ e CD1a+. Esses resultados auxiliarão na compreensão dos mecanismos moleculares de regulação transcricional envolvidos não apenas na diferenciação de linfócitos T, mas também na manutenção de um estado mais primitivo das CTH. Este conhecimento pode vir a contribuir com o desenvolvimento ou otimização de protocolos laboratoriais visando à expansão de CTH ou geração de células T para usos terapêuticos. / In previous studies by this research group a higher expression of transcriptional targets and components via NF-kB, as well as high levels of NOTCH1, was identified in hematopoietic stem cells (HSC) CD34 + cells from umbilical cord blood (UCB) compared to CD34 + hematopoietic stem cells from bone marrow (BM). This group also found, by comparing the CD34 + cells with CD133 + (more primitive) that several transcription factors (TF) involved in the potential of hemangioblast, with self-renewal of hematopoietic stem cells and to differentiated lymphocytic; as Runx1 / AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXB4 and HOXA9 were more expressed in more primitive cells. The potential involvement of Notch signaling pathways and NF-kB in the regulation of FT has conceptual and practical importance in understanding the biology of HSC, and the processes involved in differentiation of these cells. With this in mind, this project aimed to study the role of NF-kB pathway and Notch signaling in the regulation of FT. For this, an experimental model in vitro differentiation of CD34 + hematopoietic stem cells into T lymphocytes, was used and the influence of pharmacological agonists and inhibitors of these pathways were evaluated by flow cytometry and real-time PCR. Our results highlight the role of Notch signaling in the transcriptional regulation of GATA3 and HOXB4 in hematopoietic stem cells CD34 + human, which was confirmed based on the expression of direct targets of Notch (HES1 and HEY1). We also note that the expression of transcripts HES1, GATA3 and HOXB4 protein synthesis is hampered by the HSC, since when we use the pre-treatment with the drug there CHX increased transcription thereof. We can also infer that the action of TNF- is positive about these transcripts, since when we use it for raising the level of expression of these transcripts, except the HES1. In relation to the HSC coculture with stromal cells of mice, we found that only the line-DL1 Op9 has the ability to promote T cell differentiation, and this was evidenced by the appearance of cells committed to the T lymphocyte lineage, through the presence of specific surface markers CD7 + and CD1a +. These results will help understand the molecular mechanisms of transcriptional regulation involved not only in the differentiation of T lymphocytes, but also in maintaining a more primitive state of HSC. This knowledge may contribute to the development or optimization of laboratory protocols aimed at the expansion of HSC or generation of T cells for therapeutic use.

A célula estromal pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e secundário, mas pouco é conhecido sobre as características moleculares das células estromais presentes na medula óssea de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a expressão gênica diferencial entre as células estromais oriundas de medula óssea na presença ou ausência de célula tumoral oculta. Coletamos dez aspirados de medula óssea das pacientes com câncer de mama. A classificação do comprometimento da medula por células tumorais ocultas foi realizada pela detecção da expressão de CK19 por Nested-RT-PCR e quatro entre dez pacientes apresentaram presença de célula tumoral na medula óssea. Estabelecemos culturas primárias de células estromais de todas as amostras e, selecionamos amostras originárias de duas pacientes contendo linfonodos comprometidos e presença de célula tumoral oculta em medula e também de duas pacientes que não apresentavam linfonodos comprometidos e nem célula tumoral oculta na medula. As pacientes selecionadas eram pós-menopausadas com diagnóstico de carcinoma ductal invasor e expressão imunohistoquímica positiva para receptor de estrógeno e progesterona. Realizamos avaliação do perfil de expressão gênica entre estes dois grupos, o que nos revelou 21 genes diferencialmente expressos dentre os 4.608 genes imobilizados em lâmina de cDNA microarray; nove genes hiperexpressos em célula estromal de medula comprometida (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) e doze genes hipoexpressos em célula estromal de medula comprometida (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17). Nossos dados sugerem que apesar da expressão gênica de células estromais oriundas de medula óssea comprometida ou não por micrometástases ser semelhante, algumas diferenças podem ser identificadas. / Stromal cells may influence tumor development in primary and secundary sites, however, molecular characteristics of bone marrow stromal cells from breast cancer patients are almost unknown. Our aim was to evaluate the differential gene expression of bone marrow stromal cells from breast cancer patients in the presence or abscence of occult tumor cells. Bone marrow (BM) aspirates were obtained from 10 breast cancer patients. The presence of occult bone marrow disseminated tumor cells was detected by CK19 expression quantified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Presence of tumoral cell was detected in four of ten BM samples. Stromal cells primary cultures were established and samples from two patients with positive lymph nodes and presence of occult tumor cells in bone marrow and samples from two patients with negative lymph nodes and abscence of occult tumor cells in bone marrow were selected. All the included patients were postmenopausal with invasive ductal carcinoma and positive estrogen and progesterone receptors detected by immunohistochemical analysis. Gene profile evaluated in cDNA microarray slides containing 4.608 spotted genes revealed 21 differencially expressed genes, nine upregulated (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) and twelve downregulated (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17) in stromal cell derived from bone marrow in the presence of tumor breast cancer cell. Our data suggest that gene expression from bone marrow derived stromall cells in the presence or abscence of occult tumor cells seems similar, however small differences may be identified.

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é caracterizada pela limitação persistente de trocas gasosas, usualmente progressiva e associada a uma resposta inflamatória crônica exacerbada das vias aéreas a partículas e gases nocivos. Apesar de prevenível e tratável, não se logrou até o presente uma terapêutica eficaz, que resulte na cura da doença. Neste cenário, a terapia celular apresenta-se como uma alternativa terapêutica potencialmente promissora em DPOC, bem como em outras doenças pulmonares degenerativas e de caráter inflamatório. Porém, vários aspectos da terapia celular carecem de um melhor entendimento. Um dos principais desafios ao sucesso da terapia celular são as baixas taxas de sobrevivência das células transplantadas. O Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1 - PAI-1) pode representar um potencial mediador da sobrevivência de células estromais mesenquimais (CTM) pós-transplante, pois tem sido proposto que anticorpos neutralizadores do PAI-1 auxiliam no aumento da sobrevivência de CTM no tecido-alvo da terapia celular. Desta forma, a diminuição dos níveis de PAI-1 possui um potencial terapêutico interessante, ao modular os principais processos envolvidos na criação de um ambiente pouco propício ao \"homing\" celular durante o processo de injúria. A diminuição dos níveis de PAI-1 é promovida, pela sinvastatina, fármaco da família das estatinas. Desta forma, objetivou-se com este trabalho analisar os efeitos da sinvastatina sobre a expressão do PAI-1, bem como sua influência na sobrevivência das células infundidas para terapia celular de enfisema pulmonar em modelo murino. Camundongos da linhagem FVB foram submetidos à instilação intranasal de elastase para indução de enfisema pulmonar e, posteriormente, tratados com CTM do tecido adiposo e sinvastatina. Os resultados mostraram que, quanto aos aspectos morfológicos e funcionais, considerando-se a análise conjunta de ambos os pulmões, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos submetidos à instilação intranasal de elastase e submetidos à terapia celular com CTM tratados ou não com sinvastatina. Quando porém os pulmões foram analisados individualmente constatou-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e os resultados referentes ao lado direito do pulmão dos animais tratados com elastase e que receberam sinvastatina e infusão de CTM. Diferenças anatômicas entre os lados direito e esquerdo do pulmão, levaram a uma maior deposição de células no lado direito, como evidenciado pelos resultados obtidos nos ensaios de bioluminescência. Pode-se, portanto, inferir que a recuperação morfológica no lado direito do pulmão de animais com DPOC/enfisema poderia ser decorrente de um efeito regenerativo parácrino das CTM associadas à sinvastatina. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease - COPD is characterized by the persistent limitation of gas exchange, is usually progressive, and associated to a chronic augmented inflammatory response of the airways to particles and noxious gases. Despite preventable e treatable, an effective, curative therapeutic approach is yet to be achieved. In this context, cell therapy presents itself as a promising therapeutic approach for COPD and other pulmonary inflammatory and degenerative diseases. However, many aspects of cell therapy with stem cells remain unclear. One of the major challenges to the success of cell therapy are the low survival rates of transplanted cells. The Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) is a potential mediator of the survival of mesenchymal stromal cells (MSC) after transplantation, since PAI-1 neutralizing antibodies have been shown to increase the survival rate of MSC in the target tissue of cell therapy. Thus, the decreased levels of PAI-1 has an interesting therapeutic potential to modulate key processes involved in creating an inhospitable environment, during the process of injury, to the homing of transplanted cells. Decreased levels of PAI-1 are promoted by simvastatin, a drug of the statins family. Thus, the goal of this work was to evaluate the effect of simvastatin in vivo on the expression of PAI-1, as well as its influence on the survival rate of infused cells in mice model of cell therapy for pulmonary COPD/emphysema. FVB mice were submitted pulmonary emphysema induction by means of intranasal instillation of elastase and than treated with adipose-derived mesenchymal stem cells and simvastatin. The results regarding morphological and functional aspects, when considering the analisys of both lungs, presented no statistically significant difference among the groups submitted to intranasal instillation of elastase and cell therapy with MSC, treated or not with simvastatin. However, when the lungs where analyzed individually, it was found that there was no statistically significant difference between the control group and the results regarding the right lung of animals treated with elastase and that received simvastatin and MSC infusion. Anatomical differences between the right and left sides of the lung lead to a higher deposition of cells in the right side, as observed in the bioluminescence assays. Thus, it is possible to infer that the morphological recovery in the right side of the lung of animals with DPOC/emphysema could be due to a regenerative paracrine effect of mesenchymal stem cells associated with simvastatin.

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é caracterizada pela limitação persistente de trocas gasosas, usualmente progressiva e associada a uma resposta inflamatória crônica exacerbada das vias aéreas a partículas e gases nocivos. Apesar de prevenível e tratável, não se logrou até o presente uma terapêutica eficaz, que resulte na cura da doença. Neste cenário, a terapia celular apresenta-se como uma alternativa terapêutica potencialmente promissora em DPOC, bem como em outras doenças pulmonares degenerativas e de caráter inflamatório. Porém, vários aspectos da terapia celular carecem de um melhor entendimento. Um dos principais desafios ao sucesso da terapia celular são as baixas taxas de sobrevivência das células transplantadas. O Inibidor do Ativador de Plasminogênio 1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1 - PAI-1) pode representar um potencial mediador da sobrevivência de células estromais mesenquimais (CTM) pós-transplante, pois tem sido proposto que anticorpos neutralizadores do PAI-1 auxiliam no aumento da sobrevivência de CTM no tecido-alvo da terapia celular. Desta forma, a diminuição dos níveis de PAI-1 possui um potencial terapêutico interessante, ao modular os principais processos envolvidos na criação de um ambiente pouco propício ao \"homing\" celular durante o processo de injúria. A diminuição dos níveis de PAI-1 é promovida, pela sinvastatina, fármaco da família das estatinas. Desta forma, objetivou-se com este trabalho analisar os efeitos da sinvastatina sobre a expressão do PAI-1, bem como sua influência na sobrevivência das células infundidas para terapia celular de enfisema pulmonar em modelo murino. Camundongos da linhagem FVB foram submetidos à instilação intranasal de elastase para indução de enfisema pulmonar e, posteriormente, tratados com CTM do tecido adiposo e sinvastatina. Os resultados mostraram que, quanto aos aspectos morfológicos e funcionais, considerando-se a análise conjunta de ambos os pulmões, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos submetidos à instilação intranasal de elastase e submetidos à terapia celular com CTM tratados ou não com sinvastatina. Quando porém os pulmões foram analisados individualmente constatou-se que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e os resultados referentes ao lado direito do pulmão dos animais tratados com elastase e que receberam sinvastatina e infusão de CTM. Diferenças anatômicas entre os lados direito e esquerdo do pulmão, levaram a uma maior deposição de células no lado direito, como evidenciado pelos resultados obtidos nos ensaios de bioluminescência. Pode-se, portanto, inferir que a recuperação morfológica no lado direito do pulmão de animais com DPOC/enfisema poderia ser decorrente de um efeito regenerativo parácrino das CTM associadas à sinvastatina. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease - COPD is characterized by the persistent limitation of gas exchange, is usually progressive, and associated to a chronic augmented inflammatory response of the airways to particles and noxious gases. Despite preventable e treatable, an effective, curative therapeutic approach is yet to be achieved. In this context, cell therapy presents itself as a promising therapeutic approach for COPD and other pulmonary inflammatory and degenerative diseases. However, many aspects of cell therapy with stem cells remain unclear. One of the major challenges to the success of cell therapy are the low survival rates of transplanted cells. The Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) is a potential mediator of the survival of mesenchymal stromal cells (MSC) after transplantation, since PAI-1 neutralizing antibodies have been shown to increase the survival rate of MSC in the target tissue of cell therapy. Thus, the decreased levels of PAI-1 has an interesting therapeutic potential to modulate key processes involved in creating an inhospitable environment, during the process of injury, to the homing of transplanted cells. Decreased levels of PAI-1 are promoted by simvastatin, a drug of the statins family. Thus, the goal of this work was to evaluate the effect of simvastatin in vivo on the expression of PAI-1, as well as its influence on the survival rate of infused cells in mice model of cell therapy for pulmonary COPD/emphysema. FVB mice were submitted pulmonary emphysema induction by means of intranasal instillation of elastase and than treated with adipose-derived mesenchymal stem cells and simvastatin. The results regarding morphological and functional aspects, when considering the analisys of both lungs, presented no statistically significant difference among the groups submitted to intranasal instillation of elastase and cell therapy with MSC, treated or not with simvastatin. However, when the lungs where analyzed individually, it was found that there was no statistically significant difference between the control group and the results regarding the right lung of animals treated with elastase and that received simvastatin and MSC infusion. Anatomical differences between the right and left sides of the lung lead to a higher deposition of cells in the right side, as observed in the bioluminescence assays. Thus, it is possible to infer that the morphological recovery in the right side of the lung of animals with DPOC/emphysema could be due to a regenerative paracrine effect of mesenchymal stem cells associated with simvastatin.

Em estudos anteriores desenvolvidos por este grupo de pesquisa uma expressão mais elevada de alvos transcricionais e componentes da via NF-kB, bem como altos níveis de NOTCH1, foi identificada em células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) quando comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO). Este grupo verificou ainda, por comparação das células CD34+ com as CD133+ (mais primitivas) que diversos fatores de transcrição (FT) envolvidos com o potencial de hemangioblasto, com a autorenovação das CTH, e com a diferenciação linfóide; como: RUNX1/AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXA9 e HOXB4 apresentaram-se mais expressos em células mais primitivas. A potencial participação das vias Notch e NF-kB na regulação destes FT tem importância conceitual e prática no entendimento da biologia das CTH, e dos processos envolvidos na diferenciação destas células. Com isto em vista, este projeto teve como objetivo, estudar o papel da via NF-kB e da via Notch na regulação destes FT. Para isso, um modelo experimental in vitro, de diferenciação de CTH CD34+ em linfócitos T, foi utilizado e a influência de fatores agonistas e inibidores farmacológicos destas vias, foram avaliados por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Nossos resultados evidenciam o papel da via Notch na regulação transcricional de HOXB4 e GATA3 em células-tronco hematopoéticas CD34+ humanas, o que foi confirmado com base na expressão dos alvos diretos de Notch (HEY1 e HES1). Notamos ainda, que a expressão dos transcritos HES1, GATA3 e HOXB4 é prejudicada pela síntese protéica das CTH, uma vez que quando empregamos o prétratamento com a droga CHX há aumento da transcrição dos mesmos. Também podemos inferir que a ação do TNF- é positiva sobre esses transcritos, já que quando o utilizamos há elevação do nível de expressão desses transcritos, com exceção a HES1. Em relação ao cocultivo das CTH com as células estromais de camundongos, verificamos que apenas a linhagem OP9-DL1 detém a capacidade de promover a diferenciação celular T, e isso foi comprovado pelo surgimento de células comprometidas com a linhagem linfocítica T, através da presença dos marcadores de superfície específico CD7+ e CD1a+. Esses resultados auxiliarão na compreensão dos mecanismos moleculares de regulação transcricional envolvidos não apenas na diferenciação de linfócitos T, mas também na manutenção de um estado mais primitivo das CTH. Este conhecimento pode vir a contribuir com o desenvolvimento ou otimização de protocolos laboratoriais visando à expansão de CTH ou geração de células T para usos terapêuticos. / In previous studies by this research group a higher expression of transcriptional targets and components via NF-kB, as well as high levels of NOTCH1, was identified in hematopoietic stem cells (HSC) CD34 + cells from umbilical cord blood (UCB) compared to CD34 + hematopoietic stem cells from bone marrow (BM). This group also found, by comparing the CD34 + cells with CD133 + (more primitive) that several transcription factors (TF) involved in the potential of hemangioblast, with self-renewal of hematopoietic stem cells and to differentiated lymphocytic; as Runx1 / AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXB4 and HOXA9 were more expressed in more primitive cells. The potential involvement of Notch signaling pathways and NF-kB in the regulation of FT has conceptual and practical importance in understanding the biology of HSC, and the processes involved in differentiation of these cells. With this in mind, this project aimed to study the role of NF-kB pathway and Notch signaling in the regulation of FT. For this, an experimental model in vitro differentiation of CD34 + hematopoietic stem cells into T lymphocytes, was used and the influence of pharmacological agonists and inhibitors of these pathways were evaluated by flow cytometry and real-time PCR. Our results highlight the role of Notch signaling in the transcriptional regulation of GATA3 and HOXB4 in hematopoietic stem cells CD34 + human, which was confirmed based on the expression of direct targets of Notch (HES1 and HEY1). We also note that the expression of transcripts HES1, GATA3 and HOXB4 protein synthesis is hampered by the HSC, since when we use the pre-treatment with the drug there CHX increased transcription thereof. We can also infer that the action of TNF- is positive about these transcripts, since when we use it for raising the level of expression of these transcripts, except the HES1. In relation to the HSC coculture with stromal cells of mice, we found that only the line-DL1 Op9 has the ability to promote T cell differentiation, and this was evidenced by the appearance of cells committed to the T lymphocyte lineage, through the presence of specific surface markers CD7 + and CD1a +. These results will help understand the molecular mechanisms of transcriptional regulation involved not only in the differentiation of T lymphocytes, but also in maintaining a more primitive state of HSC. This knowledge may contribute to the development or optimization of laboratory protocols aimed at the expansion of HSC or generation of T cells for therapeutic use.

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors