O Diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, projeções indicam que em 2030, 366 milhões de indivíduos sofrerão da doença. Durante os últimos anos, tornou-se evidente que a ausência de células produtoras de insulina é um denominador comum em todos os tipos de DM. Assim, várias pesquisas têm procurado desenvolver células produtoras de insulina in vitro. A betacelulina (BTC) é uma proteína ligante de EGFR, relacionada com a proliferação de células β pancreáticas in vitro e, com o aumento no metabolismo da glicose em modelos animais do diabetes. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes, presentes na medula óssea, e vastamente estudadas para terapia celular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da superexpressão do gene da betacelulina sobre células MSCs de ratos. Foi estabelecida uma cultura de longo termo de células MSCs. Após caracterização, estas foram submetidas à transfecção gênica com o gene da BTC por eletroporação. Células transfectadas foram cultivas em meio de cultivo D-MEM suplementado de 10mM Nicotinamida. Análises de radioimunoensaio demonstraram que 104 MSCs transfectadas com o gene da BCT foram capazes de produzir até 0,45 ng/mL de insulina in vitro. In vivo, as células MSC superexpressando BTC foram capazes de diminuir a hiperglicemia induzida por Streptozotocina em ratos. Nossos resultados demonstraram que os efeitos positivos da superexpressão de BTC em MSCs. / Betacellulin (BTC), a ligand of the epidermal growth factor receptor, has been shown to promote growth and differentiation of pancreatic β-cells and to improve glucose metabolism in experimental diabetic rodent models. Mesenchymal stem cells (MSCs) have already been proved to be multipotent. Recent work has attributed to rat and human MSCs the potential to differentiate into insulin secreting cells. Our goal was to evaluate the effects of betacellulin overexpression in rat MSCs. MSCs were characterized by flow cytometry and mesoderm differentiation markers. MSCs were electroporated with a plasmid containing BTC cDNA. Transfected cells were cultivated in H-DMEM with 10mM Nicotinamide. Radioimmunoassay analysis showed that 104 MSC-BTC cells produced up to 0,4ng/mL of insulin, in contrast, MSCs transfected with the empty vector produced insignificant levels of insulin. Also MSC-BTC cells were positive for insulin in immunohistochemistry. RT-PCR showed expression of pancreatic marker genes. When transplanted to streptozotocin diabetic rats, MSC-BTC cells could revert hyperglycemia. Our results demonstrate that BTC overabundance enhances glucose-induced insulin secretion in mesenchymal stem cells in vitro as well as in vivo.

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Kléber Luiz de Araújo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_FlaviaMariaMourade_D.pdf: 1277288 bytes, checksum: fbf2861e21e4c2c3095813e5df9456e2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Durante a instalação do diabetes tipo 1 as células beta pancreáticas são alvos do ataque pelo sistema de defesa do organismo. A morte das células beta, em geral por apoptose, é provocada por contato direto com células ativadas do sistema imune e por mediadores inflamatórios tais como: citocinas pró-inflamatórias, quemocinas e radicais livres. As citocinas pró-inflamatórias, como IL1-beta, TNF-alpha e IFN-gamma, produzem grande quantidade de ROS e RNS no interior das células beta e estas, por sua vez, possuem uma baixa defesa anti-oxidante enzimática, principalmente ao que se refere às enzimas que degradam H2O2, como catalase e glutationa peroxidase. Tal combinação resulta no surgimento de estresse oxidativo e morte celular. Adicionalmente, outro sistema de peroxidases, as PRDXs, também atuam na proteção das células beta contra o estresse oxidativo. Neste sentido, o estudo sobre a modulação de PRDXs por agentes inflamatórios é de grande valia, à medida que se tenta descobrir novas vias intracelulares desencadeadas pelas citocinas e alternativas para suprir a vulnerabilidade das células beta pancreáticas ao estresse oxidativo. Para isso utilizamos linhagem de células beta produtoras de insulina RINm5F. Estas células foram expostas às citocinas pró-inflamatórias IL1-beta, TNF-alpha e IFN-gamma e à anti-inflamatória IL-4 e a expressão das PRDXs foi analizada. Nossos resultados demonstram que IFN-gamma e TNF-alpha reduzem a expressão da PRDX6. Quando separadas, essas citocinas alteram somente a expressão protéica, através da ativação de sistemas de proteólise, especialmente de calpaínas e ubiquitina-proteassomo, e via ativação da JNK/c-Jun. A pré-incubação das células RINm5F com a citocina antiinflamatória IL4, bloqueia os efeitos do TNF-alpha ou IFN-gamma sobre a expressão da PRDX6. Em conjunto, IFN-gamma e TNF-alpha reduzem tanto a expressão gênica quanto protéica da PRDX6. As alterações transcricionais ocorrem, provavelmente, por ação sinérgica de mais de uma via intracelular, neste caso, NFkB (ativado pelo TNF-alpha) e STAT1 (ativado pelo IFN-gamma), sendo necessária a participação dessas duas vias para a modulação gênica da PRDX6. A deleção dessa enzima aumenta a suceptibilidade das células RINm5F aos efeitos deletérios de IFN-gamma, TNF-alpha e H2O2, sugerindo função importante da PRDX6 na proteção das células beta ao estresse oxidativo / Abstract: Peroxiredoxins are a family of six antioxidant enzymes (PRDX1-6), and may be an alternative system for the pancreatic beta cells to cope with oxidative stress. This study investigated whether the main diabetogenic pro-inflammatory cytokines or the antiinflammatory cytokine IL-4 modulate PRDXs levels and putative intracellular pathways important for this process in the insulin-producing RINm5F cells. RINm5F cells expressed significant amounts of PRDX1, PRDX3 and PRDX6 enzymes. Only PRDX6 was modulated by cytokines, showing both mRNA and protein down-regulation following incubation of RINm5F cells with TNF-alpha and IFN-gamma but not with IL-1beta. Separately IFN-gamma or TNF-alpha decreased PRDX6 protein but not mRNA levels. The blockage of the JNK signalling and of the calpains and proteasome proteolysis systems restored PRDX6 protein levels. IL-4 alone did not modulate PRDXs levels. However, pre/co-incubation with IL-4 substantially prevented the decrease in PRDX6 induced by proinflammatory cytokines. Knockdown of PRDX6 increased susceptibility of RINm5F cells to the deleterious effects of pro-inflammatory cytokines and to oxidative stress. These results show that, from the PRDXs highly expressed in RINm5F cells, only PRDX6 is modulated by the diabetogenic cytokines IFN-gamma and TNF-alpha. This PRDX6 downregulation depends on the Calpain and proteasome systems and JNK signalling. PRDX6 is an important enzyme for protection against oxidative stress and the interaction between pro- and anti-inflammatory cytokines might be important to determine the antioxidant capacity of the cells / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T08:40:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_OneidaDiasde_M.pdf: 2570024 bytes, checksum: 51b70acd6a452f6bd84902e9666e8e6a (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: Com o presente trabalho objetivamos estudar os efeitos do tiopental sobre a secreçao de insulina e a permeabilidade ao 'K POT. +¿ em ilhotas isoladas. Tal propósito advém do fato desse anestésico reduzir a permeabilidade ao 'K POT. +¿ em outros tecidos. Na realização do projeto utilizaram-se ilhotas isoladas com as quais se mediram a secreção de insulina e o efluxo de 'RB ANTPOT. 86¿ (substituto do 'K POT. +¿). Para a secreção de insulina, ilhotas de Langerhans isoladas pelo método da colagenase foram incubadas durante 90 min a ¿37 GRAUS¿ na presença de 6.0 mM de glicose e diferentes concentrações de tiopental. Após a incubação avaliou-se a secreção pela técnica de RIE. Para a análise de efluxo de 'RB ANTPOT. 86¿, grupos de 100 ilhotas cada foram pré incubados durante 90 min, lavados 4 vezes e transferidos para uma câmara do 0,25 ml contendo filtro miliopore e perfundidos com o auxílio de uma bomba peristáltica na razão de 0.5 ml/min durante 70 min. A solução perfusora provinha de dois recipientes, sendo que a solução controle foi mantida no '1 GRAUS¿ frasco e, no '2 GRAUS¿, as substâncias em estudo. O perfusato durante os 30 minutos iniciais foi proveniente do '1 GRAUS¿, do ¿30 GRAUS¿ min ao ¿50 GRAUS¿ min proveniente do '2 GRAUS¿ frasco e do '1GRAUS¿ frasco até o final da perfusão... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β que leva à morte celular. A DM1 é a causa de mais de 5% do total de mortes na população por ano e são poucas as estratégias de tratamento disponíveis. As linhagens celulares, são amplamente utilizadas nos estudos da DM1 como um modelo in vitro. A linhagem celular derivada de insulinoma murino, chamada de MIN6, assemelha-se as ilhotas de camundongo. Sendo assim, pesquisadores comprovaram que estas células apresentam características funcionais semelhantes às células β-pancreáticas em resposta a glicose e a outros secretagogos. Através de agregação espontânea e crescimento tridimensional, estas células formam as pseudoilhotas (PIs). A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é um açúcar bifosforilado, que apresenta duas estruturas anoméricas denominadas α e β furanose. Já são conhecidas algumas ações importantes da FBP, como: ação citoprotetora, antioxidante e anti-inflamatória. Com base no descrito, o objetivo deste estudo foi avaliar a possível ação citoprotetora da FBP sobre células MIN6, cultivadas em monocadas e como pseudoilhotas. Para tal, foram avaliados os efeitos do tratamento com diferentes concentrações (0,30 mM, 0,62 mM e 1,25 mM) de FBP sobre a viabilidade, proliferação e síntese de insulina em células MIN6. Também foram determinados os efeitos da FBP na formação, crescimento e viabilidade das PIs. MIN6 Os resultados mostraram, que em qualquer das doses testadas, a FBP aumentou a adesão das células MIN6. No entanto, os tratamentos com 0,62 e 1,25 mM de FBP provocaram uma inibição significativa da proliferação. A sintese de insulina foi detectada por imunocitoquímica e sua secreção basal estimulada por glicose determinada por ELISA. Como esperado, a formação e o crescimento de PIs é tempo dependente, tanto nas culturas controle como nas tratadas com FBP. Nas culturas tratadas com FBP, a formação de PIs maiores (150-300 μm) foi menor que nas culturas controle. A incorporação de iodeto de propídeo mostrou um aumento da porcentagem de células inviáveis nas culturas de PIs tratadas com 1,25 mM de FBP, sendo citotóxica nessa concentração. Embora ainda sejam necessários mais estudos para aprofundar o conhecimento da atividade citoprotetora da FBP em outros modelos celulares e em ilhotas pancreáticas, nossos resultados mostram que em monocamadas e PIs, da linhagem celular MIN6 utilizadas nos experimentos, que a FBP não apresentou atividade citoprotetora. / Diabetes mellitus type 1 (DM 1) is an organ-specific autoimmune syndrome characterized by the selective destruction of β cells that leads to cell death.The DM1 is the cause of more than 5% of all deaths in the population per year and there are few treatment strategies available. Cell lines are widely used in studies of DM1 in vitro model. The cell line derived from a mouse β insulinoma MIN6 is similar to the mouse islets. Studies of these cells exhibit functional characteristic similar to pancreatic β-cells in response to glucose and other secretagogues. Spontaneous aggregation and tridimensional growth those cells form the pseudoislets (PIs). Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) is a biphosphorylated sugar with two anomeric forms designated α and β furanoses. Important actions of FBP as antioxidant, cytoprotective and anti-inflammatory. Based on the described, in this work, our objective is evaluate the cytoprotective effect of FBP on MIN6 cells in monolayer and pseudoislets agregate cells. The effects of FBP with different concentrations (0.30 mM, 0.62 mM and 1.25 mM) in MIN6 cells on the proliferation, viability and insulin synthesis. We also determined the effects of FBP in the formation, growth and viability of PIs. The results showed that all doses of FBP tested increased adhesion on MIN6 cells. However, the treatment with 0.62 and 1.25 mM of FBP causes a significant decrease in cell proliferation. Insulin synthesis detected by immunocytochemistry, basal and glucose-stimulated insulin secretion was determined by ELISA. As expected, PIs formation and growth is time dependent in the control cultures and treated with FBP. In cultures treated with FBP the formation of larger (150-300 μm) PIs was lower than in control cultures. Propidium iodide incorporation showed an increasing percentage of nonviable PIs cells in cultures treated with 1.25 mM of FBP, including cytotoxic. More studies are required to deepen understanding of the role of cytoprotective activity of FBP in other cell types and in pseudoislets, but our results indicate in cell line MIN6, monolayers and pseudoislets, that FBP did not show cytoprotective activity.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β que leva à morte celular. A DM1 é a causa de mais de 5% do total de mortes na população por ano e são poucas as estratégias de tratamento disponíveis. As linhagens celulares, são amplamente utilizadas nos estudos da DM1 como um modelo in vitro. A linhagem celular derivada de insulinoma murino, chamada de MIN6, assemelha-se as ilhotas de camundongo. Sendo assim, pesquisadores comprovaram que estas células apresentam características funcionais semelhantes às células β-pancreáticas em resposta a glicose e a outros secretagogos. Através de agregação espontânea e crescimento tridimensional, estas células formam as pseudoilhotas (PIs). A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é um açúcar bifosforilado, que apresenta duas estruturas anoméricas denominadas α e β furanose. Já são conhecidas algumas ações importantes da FBP, como: ação citoprotetora, antioxidante e anti-inflamatória. Com base no descrito, o objetivo deste estudo foi avaliar a possível ação citoprotetora da FBP sobre células MIN6, cultivadas em monocadas e como pseudoilhotas. Para tal, foram avaliados os efeitos do tratamento com diferentes concentrações (0,30 mM, 0,62 mM e 1,25 mM) de FBP sobre a viabilidade, proliferação e síntese de insulina em células MIN6. Também foram determinados os efeitos da FBP na formação, crescimento e viabilidade das PIs. MIN6 Os resultados mostraram, que em qualquer das doses testadas, a FBP aumentou a adesão das células MIN6. No entanto, os tratamentos com 0,62 e 1,25 mM de FBP provocaram uma inibição significativa da proliferação. A sintese de insulina foi detectada por imunocitoquímica e sua secreção basal estimulada por glicose determinada por ELISA. Como esperado, a formação e o crescimento de PIs é tempo dependente, tanto nas culturas controle como nas tratadas com FBP. Nas culturas tratadas com FBP, a formação de PIs maiores (150-300 μm) foi menor que nas culturas controle. A incorporação de iodeto de propídeo mostrou um aumento da porcentagem de células inviáveis nas culturas de PIs tratadas com 1,25 mM de FBP, sendo citotóxica nessa concentração. Embora ainda sejam necessários mais estudos para aprofundar o conhecimento da atividade citoprotetora da FBP em outros modelos celulares e em ilhotas pancreáticas, nossos resultados mostram que em monocamadas e PIs, da linhagem celular MIN6 utilizadas nos experimentos, que a FBP não apresentou atividade citoprotetora. / Diabetes mellitus type 1 (DM 1) is an organ-specific autoimmune syndrome characterized by the selective destruction of β cells that leads to cell death.The DM1 is the cause of more than 5% of all deaths in the population per year and there are few treatment strategies available. Cell lines are widely used in studies of DM1 in vitro model. The cell line derived from a mouse β insulinoma MIN6 is similar to the mouse islets. Studies of these cells exhibit functional characteristic similar to pancreatic β-cells in response to glucose and other secretagogues. Spontaneous aggregation and tridimensional growth those cells form the pseudoislets (PIs). Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) is a biphosphorylated sugar with two anomeric forms designated α and β furanoses. Important actions of FBP as antioxidant, cytoprotective and anti-inflammatory. Based on the described, in this work, our objective is evaluate the cytoprotective effect of FBP on MIN6 cells in monolayer and pseudoislets agregate cells. The effects of FBP with different concentrations (0.30 mM, 0.62 mM and 1.25 mM) in MIN6 cells on the proliferation, viability and insulin synthesis. We also determined the effects of FBP in the formation, growth and viability of PIs. The results showed that all doses of FBP tested increased adhesion on MIN6 cells. However, the treatment with 0.62 and 1.25 mM of FBP causes a significant decrease in cell proliferation. Insulin synthesis detected by immunocytochemistry, basal and glucose-stimulated insulin secretion was determined by ELISA. As expected, PIs formation and growth is time dependent in the control cultures and treated with FBP. In cultures treated with FBP the formation of larger (150-300 μm) PIs was lower than in control cultures. Propidium iodide incorporation showed an increasing percentage of nonviable PIs cells in cultures treated with 1.25 mM of FBP, including cytotoxic. More studies are required to deepen understanding of the role of cytoprotective activity of FBP in other cell types and in pseudoislets, but our results indicate in cell line MIN6, monolayers and pseudoislets, that FBP did not show cytoprotective activity.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β que leva à morte celular. A DM1 é a causa de mais de 5% do total de mortes na população por ano e são poucas as estratégias de tratamento disponíveis. As linhagens celulares, são amplamente utilizadas nos estudos da DM1 como um modelo in vitro. A linhagem celular derivada de insulinoma murino, chamada de MIN6, assemelha-se as ilhotas de camundongo. Sendo assim, pesquisadores comprovaram que estas células apresentam características funcionais semelhantes às células β-pancreáticas em resposta a glicose e a outros secretagogos. Através de agregação espontânea e crescimento tridimensional, estas células formam as pseudoilhotas (PIs). A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é um açúcar bifosforilado, que apresenta duas estruturas anoméricas denominadas α e β furanose. Já são conhecidas algumas ações importantes da FBP, como: ação citoprotetora, antioxidante e anti-inflamatória. Com base no descrito, o objetivo deste estudo foi avaliar a possível ação citoprotetora da FBP sobre células MIN6, cultivadas em monocadas e como pseudoilhotas. Para tal, foram avaliados os efeitos do tratamento com diferentes concentrações (0,30 mM, 0,62 mM e 1,25 mM) de FBP sobre a viabilidade, proliferação e síntese de insulina em células MIN6. Também foram determinados os efeitos da FBP na formação, crescimento e viabilidade das PIs. MIN6 Os resultados mostraram, que em qualquer das doses testadas, a FBP aumentou a adesão das células MIN6. No entanto, os tratamentos com 0,62 e 1,25 mM de FBP provocaram uma inibição significativa da proliferação. A sintese de insulina foi detectada por imunocitoquímica e sua secreção basal estimulada por glicose determinada por ELISA. Como esperado, a formação e o crescimento de PIs é tempo dependente, tanto nas culturas controle como nas tratadas com FBP. Nas culturas tratadas com FBP, a formação de PIs maiores (150-300 μm) foi menor que nas culturas controle. A incorporação de iodeto de propídeo mostrou um aumento da porcentagem de células inviáveis nas culturas de PIs tratadas com 1,25 mM de FBP, sendo citotóxica nessa concentração. Embora ainda sejam necessários mais estudos para aprofundar o conhecimento da atividade citoprotetora da FBP em outros modelos celulares e em ilhotas pancreáticas, nossos resultados mostram que em monocamadas e PIs, da linhagem celular MIN6 utilizadas nos experimentos, que a FBP não apresentou atividade citoprotetora. / Diabetes mellitus type 1 (DM 1) is an organ-specific autoimmune syndrome characterized by the selective destruction of β cells that leads to cell death.The DM1 is the cause of more than 5% of all deaths in the population per year and there are few treatment strategies available. Cell lines are widely used in studies of DM1 in vitro model. The cell line derived from a mouse β insulinoma MIN6 is similar to the mouse islets. Studies of these cells exhibit functional characteristic similar to pancreatic β-cells in response to glucose and other secretagogues. Spontaneous aggregation and tridimensional growth those cells form the pseudoislets (PIs). Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) is a biphosphorylated sugar with two anomeric forms designated α and β furanoses. Important actions of FBP as antioxidant, cytoprotective and anti-inflammatory. Based on the described, in this work, our objective is evaluate the cytoprotective effect of FBP on MIN6 cells in monolayer and pseudoislets agregate cells. The effects of FBP with different concentrations (0.30 mM, 0.62 mM and 1.25 mM) in MIN6 cells on the proliferation, viability and insulin synthesis. We also determined the effects of FBP in the formation, growth and viability of PIs. The results showed that all doses of FBP tested increased adhesion on MIN6 cells. However, the treatment with 0.62 and 1.25 mM of FBP causes a significant decrease in cell proliferation. Insulin synthesis detected by immunocytochemistry, basal and glucose-stimulated insulin secretion was determined by ELISA. As expected, PIs formation and growth is time dependent in the control cultures and treated with FBP. In cultures treated with FBP the formation of larger (150-300 μm) PIs was lower than in control cultures. Propidium iodide incorporation showed an increasing percentage of nonviable PIs cells in cultures treated with 1.25 mM of FBP, including cytotoxic. More studies are required to deepen understanding of the role of cytoprotective activity of FBP in other cell types and in pseudoislets, but our results indicate in cell line MIN6, monolayers and pseudoislets, that FBP did not show cytoprotective activity.

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafacho_Alex_D.pdf: 17852608 bytes, checksum: ee7b970220681b508fc5519d53e49655 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resistência à insulina (RI) é uma condição que exige maiores níveis de insulina circulante e que normalmente são providenciados pelo aumento da função e população de células ß. A RI pode ser observada a partir de diversos modelos experimentais em roedores tais como os modelos transgênicos, de gravidez, submetidos às dietas hiperlipídicas e hipercalóricas e a partir de infusão venosa de glicose. Estes modelos têm sido úteis para a compreensão dos mecanismos compensatórios observados durante a RI. Os glicocorticóides são amplamente utilizados na indução farmacológica da RI em modelos animais e em seres humanos, com fins científicos. A ativação da sinalização da insulina e das proteínas reguladoras do ciclo celular é crucial para a função e crescimento das células ß adultas. No presente trabalho, apresentamos modelos para investigação da função e crescimento de células ß pancreáticas in vivo a partir da administração diária de três concentrações distintas de dexametasona (DEX) (0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg, peso corpóreo, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 e DEX 1.0, respectivamente) por 5 dias consecutivos. A sensibilidade periférica à glicose e à insulina, parâmetros de secreção de insulina e histomorfométricos foram investigados. A análise dos níveis de proteínas relacionados à função e crescimento de células ß foi realizada por Western blotting. O tratamento com DEX induziu RI de maneira dose- dependente. Aumento da secreção de insulina em resposta à glicose foi observado tanto in vivo quanto ex vivo nos três grupos tratados com DEX. Ratos DEX 1.0, que apresentam hiperglicemia moderada e marcante hiperinsulinemia, exibiram aumento de 5,1 vezes na proliferação além de hipertrofia de células ß, com aumento significativo na massa de células ß comparado aos ratos CTL. Os ratos DEX 0.5, hiperinsulinêmicos, porém normoglicêmicos, também apresentaram aumento significante de 3,6 vezes na proliferação e modesta hipertrofia de células ß. Entretanto, os ratos DEX 0.1, que desenvolveram o menor grau de RI, compensaram à demanda de insulina apenas com aumento da função de células ß. Nenhuma alteração da freqüência de morte celular foi observada nas células ß dos três grupos DEX comparados ao grupo CTL. Foi observada ativação da via IRS-2/PI3- K/Akt/p70S6K, bem como da proteína retinoblastoma nas ilhotas do grupo DEX 1.0 e, em menor grau, no grupo DEX 0.5 quando comparados com as ilhotas do grupo CTL. Assim, aumentando a concentração de dexametasona induzem-se três graus de requerimento de insulina in vivo, servindo como modelo para investigação de alterações compensatórias em células ß. O aumento da demanda de insulina é compensado por aumento da função das células ß (em todos os GRUPOS DEX) e por hiperplasia e hipertrofia de células ß nos GRUPOS DEX 1.0 e DEX 0.5. Baseado nos presentes resultados concluímos que o aumento dos níveis circulantes de insulina parece ser o maior estímulo para proliferação e hipertrofia das células de células ß observado na RI induzida pela dexametasona. / Abstract: Insulin resistance (IR) is a condition that demand increased levels of circulating insulin that are normally provided by increase of ß-cell function and mass. The IR can be observed in several experimental rodent models such as transgenic, pregnancy, high-fat or high-caloric diet and from glucose infusion model. These models have aided in elucidating the compensatory mechanisms observed during the IR. The glucocorticoids are widely used to induce the pharmacological IR in animal models and in humans, with scientific purpose. Activation of insulin signaling and cell cycle proteins are crucial to the function and growth of adult ß-cells. At the present study, we showed models to investigation of pancreatic ß-cell function and growth in vivo from the daily administration of three different dexamethasone (DEX) concentration (0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg, body weight, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 and DEX 1.0, respectively) for 5 consecutive days. The peripheral sensibility to glucose and insulin, insulin secretion and histomorphometrical parameters were investigated. The analyses of proteins related to ß -cell function and growth were done by Western blotting. DEX treatment induced IR in a dose-dependent manner. Incease of glucose-stimulated insulin secretion was observed in vivo as well as ex vivo in the three DEX groups. DEX 1.0 rats, that present moderate hyperglicemya and marked hyperinsulinemia, ehibited a 5.1-fold increase in ß-cell proliferation besides hypertrophy, with significant increase of ß -cell mass compared to CTL rats. DEX 0.5 rats, that are hiperinsulinemic and normoglicemic, also exhibited a significant 3.6-fold increase in ß-cell proliferation as well as ß -cell hypertophy. However, DEX 0.1 rats, which exhibited the lowest degree of insulin resistance, compensate for insulin demand by improving only ß -cell function. No alteration in cell death frequency was noted in ß -cells from the three DEX groups compared to CTL group. Activation of IRS-2/PI3-K/Akt/p70S6K pathway as well as the retinoblastoma protein in islets from DEX 1.0 and, in lesser extend, in DEX 0.5 group was observed compared to islets from CTL group. Therefore, increasing doses of dexamethasone induce three different degrees of insulin requirement in living rats, serving as a model to investigate compensatory beta-cell alterations. The increased insulin demand is compensated by increase of ß-cell function (in all DEX groups) and ß -cell hyperplasia and hypertrophy in DEX 0.5 and DEX 1.0 groups. Based on the present results we concluded that the augmented levels of circulating insulin seem to be the major stimulus for ß-cell proliferation and hypertrophy observed in dexamethasone-induced insulin resistance. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular