Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafacho_Alex_D.pdf: 17852608 bytes, checksum: ee7b970220681b508fc5519d53e49655 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resistência à insulina (RI) é uma condição que exige maiores níveis de insulina circulante e que normalmente são providenciados pelo aumento da função e população de células ß. A RI pode ser observada a partir de diversos modelos experimentais em roedores tais como os modelos transgênicos, de gravidez, submetidos às dietas hiperlipídicas e hipercalóricas e a partir de infusão venosa de glicose. Estes modelos têm sido úteis para a compreensão dos mecanismos compensatórios observados durante a RI. Os glicocorticóides são amplamente utilizados na indução farmacológica da RI em modelos animais e em seres humanos, com fins científicos. A ativação da sinalização da insulina e das proteínas reguladoras do ciclo celular é crucial para a função e crescimento das células ß adultas. No presente trabalho, apresentamos modelos para investigação da função e crescimento de células ß pancreáticas in vivo a partir da administração diária de três concentrações distintas de dexametasona (DEX) (0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg, peso corpóreo, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 e DEX 1.0, respectivamente) por 5 dias consecutivos. A sensibilidade periférica à glicose e à insulina, parâmetros de secreção de insulina e histomorfométricos foram investigados. A análise dos níveis de proteínas relacionados à função e crescimento de células ß foi realizada por Western blotting. O tratamento com DEX induziu RI de maneira dose- dependente. Aumento da secreção de insulina em resposta à glicose foi observado tanto in vivo quanto ex vivo nos três grupos tratados com DEX. Ratos DEX 1.0, que apresentam hiperglicemia moderada e marcante hiperinsulinemia, exibiram aumento de 5,1 vezes na proliferação além de hipertrofia de células ß, com aumento significativo na massa de células ß comparado aos ratos CTL. Os ratos DEX 0.5, hiperinsulinêmicos, porém normoglicêmicos, também apresentaram aumento significante de 3,6 vezes na proliferação e modesta hipertrofia de células ß. Entretanto, os ratos DEX 0.1, que desenvolveram o menor grau de RI, compensaram à demanda de insulina apenas com aumento da função de células ß. Nenhuma alteração da freqüência de morte celular foi observada nas células ß dos três grupos DEX comparados ao grupo CTL. Foi observada ativação da via IRS-2/PI3- K/Akt/p70S6K, bem como da proteína retinoblastoma nas ilhotas do grupo DEX 1.0 e, em menor grau, no grupo DEX 0.5 quando comparados com as ilhotas do grupo CTL. Assim, aumentando a concentração de dexametasona induzem-se três graus de requerimento de insulina in vivo, servindo como modelo para investigação de alterações compensatórias em células ß. O aumento da demanda de insulina é compensado por aumento da função das células ß (em todos os GRUPOS DEX) e por hiperplasia e hipertrofia de células ß nos GRUPOS DEX 1.0 e DEX 0.5. Baseado nos presentes resultados concluímos que o aumento dos níveis circulantes de insulina parece ser o maior estímulo para proliferação e hipertrofia das células de células ß observado na RI induzida pela dexametasona. / Abstract: Insulin resistance (IR) is a condition that demand increased levels of circulating insulin that are normally provided by increase of ß-cell function and mass. The IR can be observed in several experimental rodent models such as transgenic, pregnancy, high-fat or high-caloric diet and from glucose infusion model. These models have aided in elucidating the compensatory mechanisms observed during the IR. The glucocorticoids are widely used to induce the pharmacological IR in animal models and in humans, with scientific purpose. Activation of insulin signaling and cell cycle proteins are crucial to the function and growth of adult ß-cells. At the present study, we showed models to investigation of pancreatic ß-cell function and growth in vivo from the daily administration of three different dexamethasone (DEX) concentration (0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg, body weight, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 and DEX 1.0, respectively) for 5 consecutive days. The peripheral sensibility to glucose and insulin, insulin secretion and histomorphometrical parameters were investigated. The analyses of proteins related to ß -cell function and growth were done by Western blotting. DEX treatment induced IR in a dose-dependent manner. Incease of glucose-stimulated insulin secretion was observed in vivo as well as ex vivo in the three DEX groups. DEX 1.0 rats, that present moderate hyperglicemya and marked hyperinsulinemia, ehibited a 5.1-fold increase in ß-cell proliferation besides hypertrophy, with significant increase of ß -cell mass compared to CTL rats. DEX 0.5 rats, that are hiperinsulinemic and normoglicemic, also exhibited a significant 3.6-fold increase in ß-cell proliferation as well as ß -cell hypertophy. However, DEX 0.1 rats, which exhibited the lowest degree of insulin resistance, compensate for insulin demand by improving only ß -cell function. No alteration in cell death frequency was noted in ß -cells from the three DEX groups compared to CTL group. Activation of IRS-2/PI3-K/Akt/p70S6K pathway as well as the retinoblastoma protein in islets from DEX 1.0 and, in lesser extend, in DEX 0.5 group was observed compared to islets from CTL group. Therefore, increasing doses of dexamethasone induce three different degrees of insulin requirement in living rats, serving as a model to investigate compensatory beta-cell alterations. The increased insulin demand is compensated by increase of ß-cell function (in all DEX groups) and ß -cell hyperplasia and hypertrophy in DEX 0.5 and DEX 1.0 groups. Based on the present results we concluded that the augmented levels of circulating insulin seem to be the major stimulus for ß-cell proliferation and hypertrophy observed in dexamethasone-induced insulin resistance. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células β e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or β cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin®, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células β e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or β cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin®, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.