O meduloblastoma é o tumor cerebral maligno mais comum em crianças de zero a quatro anos e uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil. Diversos estudos têm suportado a hipótese de que a ativação de genes tipicamente expressos em células-tronco confere características mais primitivas e agressivas a células tumorais, frequentemente associadas a prognóstico clínico desfavorável. Nesse contexto, tanto fatores proteicos quanto miRNAs poderiam estimular uma reprogramação em células cancerosas, induzindo um fenótipo semelhantes ao de células-tronco. Estudos recentes apontam o envolvimento do miR-367 na reprogramação de fibroblastos ao estado pluripotente e sua expressão aberrante foi correlacionada com prognóstico desfavorável em alguns tipos de câncer. Neste trabalho, verificou-se um possível papel funcional do miR-367 na agressividade de meduloblastoma. Células de meduloblastoma de quatro diferentes linhagens, Daoy, D283-Med, CHLA-01-Med e USP-13-Med apresentaram níveis baixos de expressão de pri-miR-367 e miR-367 maduro, em relação aos níveis encontrados em células-tronco embrionárias humanas. Uma superexpressão transiente do miR-367 em células das linhagens CHLA-01-Med e USP-13-Med resultaram em uma redução significativa dos níveis proteicos de RYR3, bem como dos transcritos preditos de ITGAV e RAB23, respectivos alvos do miR-367, envolvidos em câncer. Além disso, a superexpressão de miR-367 aumentou significativamente a proliferação celular, indicada pela cinética de crescimento in vitro e pela maior porcentagem de células presentes nas fases S+G2/M do ciclo celular. Embora a sensibilidade ao tratamento com cisplatina não tenha sido alterada após superexpressão de miR-367, a capacidade de geração de neuroesferas in vitro foi significativamente aumentada. Este último resultado é interessante do ponto de vista clínico, uma vez que a capacidade de geração de neuroesferas está significativamente correlacionada com menor sobrevida de pacientes com meduloblastoma. Portanto, esses achados sugerem uma função pró-oncogênica ao miR-367, a qual pode afetar a agressividade de meduloblastoma por meio de efeitos positivos sobre a proliferação celular e propriedades de células-tronco neurais / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in children aged four and younger, and is the leading cause of infant morbidity and mortality. Several studies have reported the activation of stem cell genes leading to more primitive and aggressive characteristics in tumor cell often associated with unfavorable clinical prognosis. Cell reprogramming, stimulated by tumor microenvironment factors, might induce tumor stem cells phenotype. Recent researches suggest an involvement of miR-367 in fibroblasts reprogramming into pluripotent state, as well as a correlation with poor prognosis in some cancers. In this study, we observed a possible functional role of miR-367 in medulloblastoma aggressiveness. Four different medulloblastoma cell lines, Daoy, D283-Med, CHLA-01-Med and USP-13-Med showed low rates of pri-miR-367 and mature miR-367 expression. Overexpression of miR-367 down-regulated the protein levels of its target RYR3 and of two bioinformatically predicted transcript targets encoding ITGAV and RAB23, which are involved in cancer in CHLA-01-Med and USP-13 Med cell lines. Furthermore, transfection with the miRNA mimic significantly increased cell proliferation and the percentage of cells observed in S + G2 / M phase of the cell cycle. Although the sensitivity to cisplatin treatment was not changed after overexpression of miR-367, the ability to generate neurospheres in vitro was significantly increased. This last result can be related to clinical ones because cells from medulloblastoma patients with low survival show great ability to generate neurospheres. In sum, these findings suggest a pro-oncogenic role to miR-367, which can affect medulloblastoma aggressiveness by cell proliferation and neural stem cells positive modifications

O meduloblastoma é o tumor cerebral maligno mais comum em crianças de zero a quatro anos e uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil. Diversos estudos têm suportado a hipótese de que a ativação de genes tipicamente expressos em células-tronco confere características mais primitivas e agressivas a células tumorais, frequentemente associadas a prognóstico clínico desfavorável. Nesse contexto, tanto fatores proteicos quanto miRNAs poderiam estimular uma reprogramação em células cancerosas, induzindo um fenótipo semelhantes ao de células-tronco. Estudos recentes apontam o envolvimento do miR-367 na reprogramação de fibroblastos ao estado pluripotente e sua expressão aberrante foi correlacionada com prognóstico desfavorável em alguns tipos de câncer. Neste trabalho, verificou-se um possível papel funcional do miR-367 na agressividade de meduloblastoma. Células de meduloblastoma de quatro diferentes linhagens, Daoy, D283-Med, CHLA-01-Med e USP-13-Med apresentaram níveis baixos de expressão de pri-miR-367 e miR-367 maduro, em relação aos níveis encontrados em células-tronco embrionárias humanas. Uma superexpressão transiente do miR-367 em células das linhagens CHLA-01-Med e USP-13-Med resultaram em uma redução significativa dos níveis proteicos de RYR3, bem como dos transcritos preditos de ITGAV e RAB23, respectivos alvos do miR-367, envolvidos em câncer. Além disso, a superexpressão de miR-367 aumentou significativamente a proliferação celular, indicada pela cinética de crescimento in vitro e pela maior porcentagem de células presentes nas fases S+G2/M do ciclo celular. Embora a sensibilidade ao tratamento com cisplatina não tenha sido alterada após superexpressão de miR-367, a capacidade de geração de neuroesferas in vitro foi significativamente aumentada. Este último resultado é interessante do ponto de vista clínico, uma vez que a capacidade de geração de neuroesferas está significativamente correlacionada com menor sobrevida de pacientes com meduloblastoma. Portanto, esses achados sugerem uma função pró-oncogênica ao miR-367, a qual pode afetar a agressividade de meduloblastoma por meio de efeitos positivos sobre a proliferação celular e propriedades de células-tronco neurais / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in children aged four and younger, and is the leading cause of infant morbidity and mortality. Several studies have reported the activation of stem cell genes leading to more primitive and aggressive characteristics in tumor cell often associated with unfavorable clinical prognosis. Cell reprogramming, stimulated by tumor microenvironment factors, might induce tumor stem cells phenotype. Recent researches suggest an involvement of miR-367 in fibroblasts reprogramming into pluripotent state, as well as a correlation with poor prognosis in some cancers. In this study, we observed a possible functional role of miR-367 in medulloblastoma aggressiveness. Four different medulloblastoma cell lines, Daoy, D283-Med, CHLA-01-Med and USP-13-Med showed low rates of pri-miR-367 and mature miR-367 expression. Overexpression of miR-367 down-regulated the protein levels of its target RYR3 and of two bioinformatically predicted transcript targets encoding ITGAV and RAB23, which are involved in cancer in CHLA-01-Med and USP-13 Med cell lines. Furthermore, transfection with the miRNA mimic significantly increased cell proliferation and the percentage of cells observed in S + G2 / M phase of the cell cycle. Although the sensitivity to cisplatin treatment was not changed after overexpression of miR-367, the ability to generate neurospheres in vitro was significantly increased. This last result can be related to clinical ones because cells from medulloblastoma patients with low survival show great ability to generate neurospheres. In sum, these findings suggest a pro-oncogenic role to miR-367, which can affect medulloblastoma aggressiveness by cell proliferation and neural stem cells positive modifications

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma neoplasia primária com mau prognóstico e alta taxa de recorrência. Estudos recentes demostram que o HCC pode ser classificado em três subtipos segundo o perfil molecular. Destes subtipos, o HCC pouco diferenciado apresenta pior prognostico. Neste sentido, torna-se de particular interesse o estudo de compostos com efeitos diferenciadores e citotóxicos nas células destas neoplasias pouco diferenciadas. O butirato, um ácido graxo de cadeia curta produzido pela fermentação microbiana da fibra alimentar no intestino, tem demonstrado atividade anti-neoplásica e capacidade moduladora da diferenciação celular em diversos tipos celulares, incluindo linhagens de HCC humano e células progenitoras hepáticas. Assim, objetivou-se neste estudo, caracterizar o efeito do butirato de sódio (NaBu) em duas linhagens de células neoplásicas de rato: uma pouco diferenciada (GP7TB) e a outra, uma linhagem derivada de um HCC diferenciado (JM-1). A linhagem GP7TB mostrou maior resistência ao NaBu (ED50= 7,7 mM) do que as células JM-1 (ED50= 5,2 mM). A redução na viabilidade celular após 72 h de tratamento com NaBu esteve relacionada com a diminuição na proliferação celular e no caso das células GP7TB, de um aumento na apoptose. O tratamento com NaBu induziu alterações morfológicas nas duas linhagens celulares, porém apenas nas células do tipo GP7TB, essas alterações sugerem um processo de diferenciação/transdiferenciação celular. O aumento na expressão de genes envolvidos no controle da pluripotência de células tronco, assim como de alguns marcadores de células tronco, sugere que o NaBu induziu uma reprogramação profunda das células GP7TB. Por outro lado, a redução na expressão de genes relacionados com migração e plasticidade celular assim como de proliferação celular apontam que estas células diminuíram seu potencial invasivo e a capacidade de autorenovação. Embora sejam necessárias análises adicionais para confirmar o efeito observado nos perfis de expressão gênica, os resultados deste estudo sugerem que o NaBu apresenta efeito antineoplásico por meio da redução da proliferação, aumento da apoptose e modulação da expressão de genes associados com a transição epitéliomesenquimal em células com características tronco tumorais. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary neoplasia with poor prognosis and high recurrence rate. Recent evidence suggests that HCC can be classified in three different subtypes based on their molecular profile. Among these subtypes, the poorlydifferentiated HCC has the worst prognosis. Therefore, the study of compounds with pro-differentiating and cytotoxic effects on poorly-differentiated neoplastic cells represents a matter of primary concern. Butyrate which is a short-chain fatty acid produced by microbial fermentation in the intestine, has demonstrated anti-neoplastic activity and pro-differentiating potential in several cell types, including, human HCC cell lines and liver progenitor cells. In this study, we aimed to characterize the effect of sodium butyrate (NaBu) on two neoplastic cell lines derived from rats: a poorlydifferentiated cell line (GP7TB) and, a cell line derived from a well-differentiated HCC. GP7TB showed increased resistance to NaBu treatment (ED50= 7.7 mM) compared to JM-1 (ED50= 5.2 mM). The reduction in cell viability observed after 72 h of treatment was explained by a reduction in cell proliferation and, in the case of GP7TB, by increased levels of apoptosis. The NaBu treatment induced morphological alterations in both cell lines. However, only in the case of GP7TB cells, the alterations suggested a differentiation/transdifferentiation process. The up-regulation of genes involved in pluripotency and genes expressing stem cell markers indicated that NaBu triggered a deep reprogramming of GP7TB cells. Besides, a down-regulation in the expression of genes related with cell migration and plasticity suggested that these cells reduced their invasive potential and their self-renewal capacity. Additional analyses are necessary to confirm the observed effect on gene expression profiles. However, the results of this study suggest that NaBu exert anti-neoplastic effects through apoptosis, reduction of cell proliferation and downregulation of genes associated with epithelial-mesenchymal transition of cancer stem-like cells.

Introdução: A resistência do câncer de mama (CM) ao tratamento quimio/radioterápico convencional ainda representa um grande desafio, especialmente em carcinomas triplonegativos, os quais não expressam receptores de estrógeno, receptores de progesterona e oncogene (HER2)/neu. Sabe-se que o grau de resistência do CM está fortemente associado à quantidade de células-tronco tumorais (CTTs), as quais podem ser detectadas por imunofenotipagem (CD24-/CD44+). As CTTs são quiescentes e apresentam inibição de vias pró- apoptóticas. Vários compostos naturais apresentam atividade antitumoral, dentre os quais o fitoestrógeno da soja genisteína (GEN) destaca-se como amplo inibidor de tirosino-quinases. Contudo os efeitos biológicos da GEN quanto à presença de CTTs ainda são pouco conhecidos, especialmente quando associada a outros quimioterápicos. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do fitoestrógeno GEN em populações de CTTs e não-CTTs, aliado ao tratamento in vitro com radiação ionizante (RAD) e doxorrubicina (DXR) na linhagem de CM triplo-negativo MDA-MB-231. Metodologia: Foram empregados esquemas de pré-tratamento (GEN + DXR e GEN + RAD) e pós-tratamento (DXR + GEN e RAD + GEN), utilizando 1 - 5 ?M de GEN por 24h, 1 ng/mL de DXR por 24h e 5 -10 Gy de RAD, sendo os experimentos realizados após 24h de irradiação. Ao final de cada tratamento, foram avaliados viabilidade celular, grau de sinergia, ciclo celular, apoptose e quantidade de células CD24-/CD44+. Além disso, foi feita a aquisição de células CTTs e não-CTTs a fim de analisar a expressão gênica de vias apoptóticas. O estudo investigou os mesmos parâmetros na linhagem de CM hormônio-positivo MCF-7. Resultados: O tratamento com GEN 1 ?M por 24h provocou apoptose significativa em MDA-MB-231 por bloqueio em fase G2/M, porém o aumento da dose também não alterou a viabilidade e a população CD24-/CD44+. Células MCF-7 mostraram-se resistentes à GEN, pela indução da fase S, mas foram sensíveis à RAD, pelo bloqueio em fase G0/G1. O aumento da dose de GEN nos tratamentos combinados com DXR produziu aumento na sinergia. O pré-tratamento GEN 5 ?M + DXR 1 ng/mL induziu expressão de genes apoptóticos em células CD24-/CD44+, mas não reduziu a viabilidade. Conclusões: Tratamentos combinados utilizando baixas doses de GEN e DXR em esquemas de pré e pós-tratamento são capazes de provocar apoptose e redução da viabilidade em células MDA-MB-231 sensíveis. Contudo, esses tratamentos parecem induzir a sinalização de mecanismos de sobrevivência em CTTs, incluindo supressão de vias apoptóticas. Nesse contexto, apenas os tratamentos que induzem bloqueio no ciclo celular, mas sem alterar a viabilidade, são capazes de afetar populações CTTs resistentes de MDA-MB-231. / Introduction: Conventional chemo/radiotherapy breast cancer resistance still represents a major challenge, especially in triple-negative carcinomas, which do not express estrogen receptors, progesterone receptors and oncogene (HER2)/neu. It is known that the degree of breast cancer resistance is strongly associated with the amount of cancer stem cells, which can be detected by immunophenotyping (CD24-/CD44+). Cancer stem cells remain in G0/G1 phase for a long time, and exhibit inhibition of pro-apoptotic pathways. Several natural compounds have been studied, among which is the phytoestrogen genistein (GEN) from soy bean. The GEN acts as an ample tyrosine kinase inhibitor, and its antitumor activity has been pointed out in several studies. However, the biological effects of GEN in tumor stem cells are still poorly understood, especially when combined with other chemotherapy. Objectives: To assess the cytotoxic effects of GEN phytoestrogen in tumor stem and non-tumor stem sub-populations, combined with radiation (RAD) and doxorubicin (DXR) in vitro treatments in triple-negative breast cancer cell line MDAMB-231. Methodology: We used pretreatment (GEN + DXR e GEN + RAD) and post-treatment (DXR + GEN e RAD + GEN) regimens using 1 - 5 ?M of GEN for 24 hours, 1 ng/ml DXR for 24 hours and 5 - 10 Gy of RAD, in which experiments were performed after 24 hours of irradiation. At the end of each treatment we assessed cell viability, coefficient of drug interaction, cell cycle, apoptosis and amount of CD24-/CD44+ cells. Moreover, cancer stem cells and non-cancer stem cells sub-populations were sorted in order to study the gene expression of apoptotic pathways. This study also investigated the hormone-positive breast cancer cell line MCF-7. Results: GEN 1 ?M for 24 hours caused significant apoptosis in MDA-MB-231 by blocking the G2/M phase, but increasing the dose did not alter viability and CD24-/CD44+ quantity. MCF-7 cells were resistant to GEN, by inducing S phase, but were also sensitive to the RAD, with G0/G1 block. Increasing the dose in GEN treatments combined with DXR produced increased synergistic effects. Pretreatment GEN 5 ?M + DXR 1 ng/ml induced superexpression of apoptotic genes in CD24- /CD44+ cells, but did not reduce cell viability. Conclusions: Combined treatments using low doses of DXR and GEN in pre and post treatment schemes are able to trigger apoptosis and reduce viability of MDA-MB-231 responsive cells. However, these treatments appear to induce survival signaling mechanisms in cancer stem cells, including suppression apoptotic pathways. In this context, only treatments that induce cell cycle block, but without causing decrease in cell viability, are able to affect resistant tumor stem cells in MDA-MB-231.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

O câncer de mama é o tipo mais freqüente e o segundo mais letal no mundo. Embora ass taxas de sobrevida dos pacientes tenham aumentado consideravelmente nas últimas décadas, indicadores prognósticos desfavoráveis são associados a pacientes com diagnóstico em fase avançada e presença de metástases, frequentemente associadas à existência de células-tronco tumorais (CTT). As CTT são indiferenciadas e capazes de autorrenovação e diferenciação, o que as torna fundamentais para a manutenção da heterogeneidade celular intratumoral. As CTTs são altamente invasivas, tumorigênicas e resistentes a tratamentos convencionais, sendo frequentemente associadas ao surgimento de metástase e recidiva após tratamento. O microambiente tumoral modula as CTT por meio de células e da matriz extracelular (MEC), uma estrutura biologicamente dinâmica, complexa e que regula processos celulares como migração, invasão e diferenciação. A MEC é composta por uma grande variedade de moléculas, peptídeos e macromoléculas, sendo o colágeno seu componente mais abundante. A alta densidade mamográfica é frequentemente associada a elevada rigidez da MEC e deposição aumentada de colágeno fibrilar, principalmente colágeno tipo I (Col I), e é um dos maiores fatores de risco independentes para o desenvolvimento do câncer de mama. A alta densidade de Col I e rigidez da MEC também está associada à maior agressividade tumoral e metástase. Col I também induz o fenótipo tronco tumoral em diversos tipos celulares tumorais, embora o papel da densidade sobre este efeito seja pouco esclarecido. Nosso estudo avaliou a hipótese de a alta densidade de Col I induzir o fenótipo tronco tumoral. Cultivamos linhagens normais (MCF-10A) e tumorais (MDA-MB-231 e MCF-7) de mama em géis de baixa, média e alta densidade de Col I. Também cultivamos células em superfície bidimensional (2D) e em suspensão para geração de mamoesferas (ME), representando o cultivo tradicional e de enriquecimento de CTTs, respectivamente. Avaliamos os níveis do imunofenótipo tronco (CD44+CD24-), expressão gênica e proteica de marcadores de CTTs e de resposta mecânica ao substrato (mecanotransdução), bem como potencial clonogênico, autorrenovação celular e alinhamento fibrilar de géis de Col I. Alta densidade de Col I elevou os níveis da subpopulação CD44+CD24- e inibiu o alongamento celular da linhagem MDA-MB-231, porém não modulou a expressão de marcadores de CTT, bem como potencial clonogênico, autorrenovação celular e alinhamento fibrilar de géis de Col I. A alta densidade de Col I induziu aumento dos níveis totais da isoforma variante da glicoproteína CD44 (CD44v), receptor de estrógeno (RE &#945) e do fator de pluripotência Sox2 em linhagem MCF-7 derivada de ME. Entretanto, os níveis nucleares dos fatores de transcrição (RE &#945 e Sox2) permaneceram inalterados. Em comum, a alta densidade de Col I não elevou os níveis nucleares do mecanotransdutor YAP em linhagens MDAMB-231 e MCF-7 derivada de ME. Concluímos que a alta densidade de Col I induz parcialmente o fenótipo molecular, mas não o funcional, de células tumorais mamárias. / Breast cancer is the most frequent and second deadliest cancer type worldwide. Although patient survival rates have increased considerably in recent decades, unfavorable prognostic indicators are associated with patients with advanced disease stage at diagnosis and presence of metastases, frequently associated with the existence of cancer stem cells (CSC). CSC are undifferentiated and capable of self renewal and differentiation, making them fundamental for the maintenance of intratumoral cellular heterogeneity. CTTs are highly invasive, tumorigenic and resistant to conventional treatments, and are frequently associated with the onset of metastasis and relapse after treatment. The tumor microenvironment modulates CTT by means of cells and the extracellular matrix (ECM), a biologically complex and dynamic structure that regulates cell processes such as migration, invasion and differentiation. ECM is composed of a large variety of molecules, peptides and macromolecules, with collagen being its most abundant component. High mammographic density is often associated with high MEC stiffness and increased deposition of fibrillar collagen, mainly type I collagen (Coll I), and is one of the main independent risk factors for breast câncer development. High Coll I density and ECM stifness are also associated with increased tumor aggressiveness and metastasis. Coll I also induces tumor stemness in several tumor cell types, although the role of its density on this effect is unclear. Our study evaluated the hypothesis that high Coll I density induces the tumor stemness. We cultured normal-like- (MCF-10A) and tumoral (MDA-MB-231 and MCF-7) breast cell lines in low-, medium- and high-density Coll I gels. We also cultured cells in twodimensional (2D) surface and in suspension for the generation of mammospheres (MS), representing the traditional cell culture and CSC enrichment, respectively. We evaluated the levels of the CSC immunophenotype (CD44+CD24), gene/protein expression of CSC markers and mechanical response to the substrate (mechanotransduction), as well as the clonogenic potential, cell self-renewal and fibrillar alignment of Col I gels. High Coll I density increased the levels of the CD44+CD24- subpopulation and inhibited cell elongation of the MDA-MB-231 cell line, but did not modulate the expression of CSC markers as well as clonogenic potential, cell self-renewal and fibrillar alignment of Col I gels. High Coll I density increased total levels of the variant CD44 glycoprotein (CD44v), estrogen receptor (ER) and the pluripotency factor Sox2 in MS-derived MCF-7. However, the nuclear levels of the transcription factors (ER &#945 and Sox2) remained unchanged. In common, high Coll I density did not increase nuclear levels of the mechanotransducer YAP in MDA-MB- 231 and MS-derived cell lines. We conclude that high Coll I density partially induces the molecular stemness, but not the functional, phenotype of mammary tumor cells.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-12-16T18:14:58Z No. of bitstreams: 2 Tese - Constanza Thaise Xavier Silva - 2016.pdf: 3305701 bytes, checksum: 6bb860eedef867f3085559fcca9d7190 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-26T12:28:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Constanza Thaise Xavier Silva - 2016.pdf: 3305701 bytes, checksum: 6bb860eedef867f3085559fcca9d7190 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-26T12:28:18Z (GMT). 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For survival study, patients with a followup of up to 60 months were selected, with a recorded death. Of the 102 cases evaluated, 62.7% were female and 37.3% male; With mean age of 57.2 years and 63.1 years respectively (p= 0.0026). The most prevalent age at diagnosis of melanoma was between 51 and 70 years (44.1% p= 0.023). In this study, there was a predominance of lesions located in the trunk (32.3%). Histopathological examination of the type of tumor growth showed a predominance of the superficial extensive type in 52.9% of the cases. According to the Breslow index, lesions with ≤1.0 mm predominated in 39.2% of the individuals, followed by lesions> 4.0 mm in 23.5% of the cases. According to the Clark level 29.4% of the cases were classified in level IV; Followed by 25.5% cases with level V; Clark II in 23.5%; Clark III in 20.6%; And Clark I in only 1 case (1.0%). There were metastases in 47% of the cases and the main localization sites were: lymph nodes, brain, skin and lung. Regarding the clinical evolution of the patients, there were 26 cases of deaths due to melanoma (25.5%). The survival curve calculated at the 60-month follow-up was 73.0%. Univariate analysis revealed significant associations between nuclear overexpression of OCT4 and the following variables: Breslow index with thickness > 2.1 mm (p = 0.021, OR: 2.64, 95% CI: 1.15-6.05 ); Levels of Clark, IV and V (p = 0.001, OR: 4.11, 95% CI: 1.79-9.46); ulceration present (p≤0.0001; OR: 459.0; 95% CI: 51.67-4077.27); Presence of metastases (p <0.0001, OR: 40.25, 95% CI: 12.90- 125.62), and death from cutaneous melanoma (p <0.0001). The significant associations between cytoplasmic hyperexpression of OCT4 and the following variables were: present ulceration (p = 0.015, OR: 2.73, 95% CI: 1.21-6.16); Presence of metastases (p = 0.004, OR: 3.34, 95% CI: 1.47 - 7.62) and death from cutaneous melanoma (p = 0.039, OR 2.67, 95% CI 1.05 - 6,77). And the significant associations between the cytoplasmic hyperexpression of NANOG and the following variables were: present ulceration (p≤ 0.0001); Presence of metastases (p ≤ 0.0001) and death due to cutaneous melanoma (p = 0.030). Our study demonstrated a strong association of the OCT4 / O melanoma cutâneo é um tipo de câncer de pele que tem origem nos melanócitos, afetando predominantemente adultos jovens e de meia-idade. Diversas evidências sugerem a existência células-tronco tumorais para o melanoma. Os genes POU5F1/OCT4, NANOG vem sendo estudados como marcadores células-tronco tumorais. O OCT4 e o NANOG estão envolvidos na manutenção da pluripotência e autorrenovação das células-tronco embrionárias indiferenciadas. Este estudo tem por objetivo avaliar os fatores epidemiológicos, clínico-patológicos e expressão da proteína OCT4 e NANOG em amostras de melanoma cutâneo. Foram selecionados 102 casos para o estudo epidemiológico, clínico e patológico, diagnosticados entre os anos de 2004 a 2008. Para estudo de sobrevida foram selecionadas pacientes com seguimento de até 60 meses, com óbito registrado. Dos 102 casos avaliados foram observados 62,7% do gênero feminino e 37,3% masculino; com média de idade de 57,2 anos e 63,1 respectivamente (p= 0,0026). A idade de maior prevalência ao diagnóstico do melanoma foi entre 51 a 70 anos (44,1% p= 0,023). Nesse estudo, houve predomínio das lesões localizadas no tronco (32,3%). Ao exame histopatológico quanto ao tipo de crescimento do tumor, houve predomínio do tipo extensivo superficial em 52,9% dos casos. Segundo o índice de Breslow predominaram as lesões com ≤1,0mm em 39,2% dos indivíduos, seguidas pelas lesões >4,0mm em 23,5% dos casos. De acordo com o nível de Clark 29,4% dos casos foram classificados no nível IV; seguidas por 25,5% casos com nível V; Clark II em 23,5%; Clark III em 20,6%; e Clark I em apenas 1 caso (1,0%). Houve metástases em 47% dos casos e os principais sítios de localização foram: linfonodos, cérebro, pele e pulmão. Em relação à evolução clínica dos pacientes ocorreram 26 casos de óbitos por melanoma (25,5%). A curva de sobrevida calculada no seguimento de 60 meses foi de 73,0%. A análise univariada revelou associações significativas entre a hiperexpressão nuclear de OCT4 e as seguintes variáveis: índice de Breslow com espessura de > 2,1 mm (p= 0,021; OR: 2,64; IC 95%: 1,15 - 6,05); níveis de Clark, IV e V (p= 0,001; OR: 4,11; IC 95%: 1,79 - 9,46); ulceração presente (p≤ 0,0001; OR: 459,0; IC 95%: 51,67 - 4077,27); presença de metástases (p≤ 0,0001; OR: 40,25; IC 95%: 12,90 - 125,62) e óbito por melanoma cutâneo (p≤ 0,0001). As associações significativas entre a hiperexpressão citoplasmática de OCT4 e as seguintes variáveis foram: ulceração presente (p= 0,015; OR: 2,73; IC 95%: 1,21 - 6,16); presença de metástases (p= 0,004; OR: 3,34; IC 95%: 1,47 - 7,62) e óbito por melanoma cutâneo (p= 0,039; OR: 2,67; IC 95%: 1,05 - 6,77). E as associações significativas entre a hiperexpressão citoplasmática de NANOG e as seguintes variáveis foram: ulceração presente (p≤ 0,0001); presença de metástases (p≤ 0,0001) e óbito por melanoma cutâneo (p= 0,030). Nosso estudo demostraram uma forte associação dos genes OCT4 e NANOG como os piores fatores prognósticos do melanoma cutâneo.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma neoplasia primária com mau prognóstico e alta taxa de recorrência. Estudos recentes demostram que o HCC pode ser classificado em três subtipos segundo o perfil molecular. Destes subtipos, o HCC pouco diferenciado apresenta pior prognostico. Neste sentido, torna-se de particular interesse o estudo de compostos com efeitos diferenciadores e citotóxicos nas células destas neoplasias pouco diferenciadas. O butirato, um ácido graxo de cadeia curta produzido pela fermentação microbiana da fibra alimentar no intestino, tem demonstrado atividade anti-neoplásica e capacidade moduladora da diferenciação celular em diversos tipos celulares, incluindo linhagens de HCC humano e células progenitoras hepáticas. Assim, objetivou-se neste estudo, caracterizar o efeito do butirato de sódio (NaBu) em duas linhagens de células neoplásicas de rato: uma pouco diferenciada (GP7TB) e a outra, uma linhagem derivada de um HCC diferenciado (JM-1). A linhagem GP7TB mostrou maior resistência ao NaBu (ED50= 7,7 mM) do que as células JM-1 (ED50= 5,2 mM). A redução na viabilidade celular após 72 h de tratamento com NaBu esteve relacionada com a diminuição na proliferação celular e no caso das células GP7TB, de um aumento na apoptose. O tratamento com NaBu induziu alterações morfológicas nas duas linhagens celulares, porém apenas nas células do tipo GP7TB, essas alterações sugerem um processo de diferenciação/transdiferenciação celular. O aumento na expressão de genes envolvidos no controle da pluripotência de células tronco, assim como de alguns marcadores de células tronco, sugere que o NaBu induziu uma reprogramação profunda das células GP7TB. Por outro lado, a redução na expressão de genes relacionados com migração e plasticidade celular assim como de proliferação celular apontam que estas células diminuíram seu potencial invasivo e a capacidade de autorenovação. Embora sejam necessárias análises adicionais para confirmar o efeito observado nos perfis de expressão gênica, os resultados deste estudo sugerem que o NaBu apresenta efeito antineoplásico por meio da redução da proliferação, aumento da apoptose e modulação da expressão de genes associados com a transição epitéliomesenquimal em células com características tronco tumorais. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary neoplasia with poor prognosis and high recurrence rate. Recent evidence suggests that HCC can be classified in three different subtypes based on their molecular profile. Among these subtypes, the poorlydifferentiated HCC has the worst prognosis. Therefore, the study of compounds with pro-differentiating and cytotoxic effects on poorly-differentiated neoplastic cells represents a matter of primary concern. Butyrate which is a short-chain fatty acid produced by microbial fermentation in the intestine, has demonstrated anti-neoplastic activity and pro-differentiating potential in several cell types, including, human HCC cell lines and liver progenitor cells. In this study, we aimed to characterize the effect of sodium butyrate (NaBu) on two neoplastic cell lines derived from rats: a poorlydifferentiated cell line (GP7TB) and, a cell line derived from a well-differentiated HCC. GP7TB showed increased resistance to NaBu treatment (ED50= 7.7 mM) compared to JM-1 (ED50= 5.2 mM). The reduction in cell viability observed after 72 h of treatment was explained by a reduction in cell proliferation and, in the case of GP7TB, by increased levels of apoptosis. The NaBu treatment induced morphological alterations in both cell lines. However, only in the case of GP7TB cells, the alterations suggested a differentiation/transdifferentiation process. The up-regulation of genes involved in pluripotency and genes expressing stem cell markers indicated that NaBu triggered a deep reprogramming of GP7TB cells. Besides, a down-regulation in the expression of genes related with cell migration and plasticity suggested that these cells reduced their invasive potential and their self-renewal capacity. Additional analyses are necessary to confirm the observed effect on gene expression profiles. However, the results of this study suggest that NaBu exert anti-neoplastic effects through apoptosis, reduction of cell proliferation and downregulation of genes associated with epithelial-mesenchymal transition of cancer stem-like cells.

Introdução: A resistência do câncer de mama (CM) ao tratamento quimio/radioterápico convencional ainda representa um grande desafio, especialmente em carcinomas triplonegativos, os quais não expressam receptores de estrógeno, receptores de progesterona e oncogene (HER2)/neu. Sabe-se que o grau de resistência do CM está fortemente associado à quantidade de células-tronco tumorais (CTTs), as quais podem ser detectadas por imunofenotipagem (CD24-/CD44+). As CTTs são quiescentes e apresentam inibição de vias pró- apoptóticas. Vários compostos naturais apresentam atividade antitumoral, dentre os quais o fitoestrógeno da soja genisteína (GEN) destaca-se como amplo inibidor de tirosino-quinases. Contudo os efeitos biológicos da GEN quanto à presença de CTTs ainda são pouco conhecidos, especialmente quando associada a outros quimioterápicos. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do fitoestrógeno GEN em populações de CTTs e não-CTTs, aliado ao tratamento in vitro com radiação ionizante (RAD) e doxorrubicina (DXR) na linhagem de CM triplo-negativo MDA-MB-231. Metodologia: Foram empregados esquemas de pré-tratamento (GEN + DXR e GEN + RAD) e pós-tratamento (DXR + GEN e RAD + GEN), utilizando 1 - 5 ?M de GEN por 24h, 1 ng/mL de DXR por 24h e 5 -10 Gy de RAD, sendo os experimentos realizados após 24h de irradiação. Ao final de cada tratamento, foram avaliados viabilidade celular, grau de sinergia, ciclo celular, apoptose e quantidade de células CD24-/CD44+. Além disso, foi feita a aquisição de células CTTs e não-CTTs a fim de analisar a expressão gênica de vias apoptóticas. O estudo investigou os mesmos parâmetros na linhagem de CM hormônio-positivo MCF-7. Resultados: O tratamento com GEN 1 ?M por 24h provocou apoptose significativa em MDA-MB-231 por bloqueio em fase G2/M, porém o aumento da dose também não alterou a viabilidade e a população CD24-/CD44+. Células MCF-7 mostraram-se resistentes à GEN, pela indução da fase S, mas foram sensíveis à RAD, pelo bloqueio em fase G0/G1. O aumento da dose de GEN nos tratamentos combinados com DXR produziu aumento na sinergia. O pré-tratamento GEN 5 ?M + DXR 1 ng/mL induziu expressão de genes apoptóticos em células CD24-/CD44+, mas não reduziu a viabilidade. Conclusões: Tratamentos combinados utilizando baixas doses de GEN e DXR em esquemas de pré e pós-tratamento são capazes de provocar apoptose e redução da viabilidade em células MDA-MB-231 sensíveis. Contudo, esses tratamentos parecem induzir a sinalização de mecanismos de sobrevivência em CTTs, incluindo supressão de vias apoptóticas. Nesse contexto, apenas os tratamentos que induzem bloqueio no ciclo celular, mas sem alterar a viabilidade, são capazes de afetar populações CTTs resistentes de MDA-MB-231. / Introduction: Conventional chemo/radiotherapy breast cancer resistance still represents a major challenge, especially in triple-negative carcinomas, which do not express estrogen receptors, progesterone receptors and oncogene (HER2)/neu. It is known that the degree of breast cancer resistance is strongly associated with the amount of cancer stem cells, which can be detected by immunophenotyping (CD24-/CD44+). Cancer stem cells remain in G0/G1 phase for a long time, and exhibit inhibition of pro-apoptotic pathways. Several natural compounds have been studied, among which is the phytoestrogen genistein (GEN) from soy bean. The GEN acts as an ample tyrosine kinase inhibitor, and its antitumor activity has been pointed out in several studies. However, the biological effects of GEN in tumor stem cells are still poorly understood, especially when combined with other chemotherapy. Objectives: To assess the cytotoxic effects of GEN phytoestrogen in tumor stem and non-tumor stem sub-populations, combined with radiation (RAD) and doxorubicin (DXR) in vitro treatments in triple-negative breast cancer cell line MDAMB-231. Methodology: We used pretreatment (GEN + DXR e GEN + RAD) and post-treatment (DXR + GEN e RAD + GEN) regimens using 1 - 5 ?M of GEN for 24 hours, 1 ng/ml DXR for 24 hours and 5 - 10 Gy of RAD, in which experiments were performed after 24 hours of irradiation. At the end of each treatment we assessed cell viability, coefficient of drug interaction, cell cycle, apoptosis and amount of CD24-/CD44+ cells. Moreover, cancer stem cells and non-cancer stem cells sub-populations were sorted in order to study the gene expression of apoptotic pathways. This study also investigated the hormone-positive breast cancer cell line MCF-7. Results: GEN 1 ?M for 24 hours caused significant apoptosis in MDA-MB-231 by blocking the G2/M phase, but increasing the dose did not alter viability and CD24-/CD44+ quantity. MCF-7 cells were resistant to GEN, by inducing S phase, but were also sensitive to the RAD, with G0/G1 block. Increasing the dose in GEN treatments combined with DXR produced increased synergistic effects. Pretreatment GEN 5 ?M + DXR 1 ng/ml induced superexpression of apoptotic genes in CD24- /CD44+ cells, but did not reduce cell viability. Conclusions: Combined treatments using low doses of DXR and GEN in pre and post treatment schemes are able to trigger apoptosis and reduce viability of MDA-MB-231 responsive cells. However, these treatments appear to induce survival signaling mechanisms in cancer stem cells, including suppression apoptotic pathways. In this context, only treatments that induce cell cycle block, but without causing decrease in cell viability, are able to affect resistant tumor stem cells in MDA-MB-231.