Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T13:25:49Z No. of bitstreams: 1 2017_ClarissaRochadosSantos.pdf: 1936212 bytes, checksum: 4c4a137c99375e8b68f6a90149bca87f (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-02T13:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ClarissaRochadosSantos.pdf: 1936212 bytes, checksum: 4c4a137c99375e8b68f6a90149bca87f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T13:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ClarissaRochadosSantos.pdf: 1936212 bytes, checksum: 4c4a137c99375e8b68f6a90149bca87f (MD5) Previous issue date: 2017-10-02 / A ruptura do ligamento cruzado cranial é a afecção ortopédica mais comum entre os cães. Dentre as diversas técnicas para tratamento desta afecção, o avanço da tuberosidade tibial tem sido empregada para se obter uma rápida recuperação do joelho afetado. Uma desvantagem desta técnica é a formação de um espaço ósseo que se forma entre a tuberosidade tibial e a epífise proximal da tíbia após a realização da osteotomia. Normalmente este espaço ósseo pode levar mais de quatro meses para se consolidar. Estudos afirmam que a utilização de células-tronco pode aumentar a reparação de defeitos ósseos críticos em animais, mas a recuperação óssea com o auxílio de células-tronco após osteotomias corretivas no tratamento da ruptura do ligamento cruzado cranial ainda não foi totalmente comprovada. Este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade do uso de células-tronco mesenquimais implantadas no sítio de osteotomia obtido pelo de avanço da tuberosidade tibial em 9 cães diagnosticados com RLCC. No mesmo procedimento foram coletados, de todos os animais, um fragmento de tecido adiposo para envio ao laboratório e extração das células tronco mesenquimais. O estudo foi realizado em duplo-cego, sem que o médico veterinário ou o proprietário soubessem quais animais iriam receber células tronco e quais animais receberiam placebo. Os animais foram divididos em dois grupos. No grupo tratado os animais receberam meio de transporte celular contendo células-tronco devidamente cultivadas e o grupo controle recebeu somente o meio de transporte celular. Uma parte das células permaneceu no laboratório e foi induzida à diferenciação celular para tecido ósseo. Outra parte das células foi enviada para o laboratório MOFA nos Estados Unidos da América a fim de realizar a caracterização molecular. Foram realizadas radiografias seriadas após 15, 30, 60, 90 e 120 dias do procedimento. A avaliação da densidade do osso trabecular a partir da substância esponjosa foi feita usando o software Adobe Photoshop CS6, analisando as imagens de raios-x. Posteriormente as imagens dos dois grupos foram processadas pelo software Image-Pro Plus 4.1. Realizou-se a análise estatística descritiva para obtenção da média e do desvio padrão e do teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Em ambas as avaliações, foi possível observar que o grupo controle obteve melhores resultados que o grupo tratado somente nos primeiros 30 dias, não obtendo diferença estatística nos demais períodos. Possivelmente obteve-se um atraso no período de diferenciação, justificável devido à necessidade de reorganização decorrente do processo inflamatório após a introdução das células tronco. / The cranial cruciate ligament rupture (CCLR) is the most common orthopedic affection in dogs. Studies state that the use of stem cells can increase the repair of critical bone defects in large animals, but the bone recovery using stem cells after corrective osteotomies in CCLR treatment has not been totally proven yet. This study had an objective to evaluate the viability of using mesenchimal stem cells (MST) implanted on osteotomy site through the tibial tuberosity advancement in 9 dogs has been diagnosed with CCLR. At the same procedure was collected, from all animals, a fat tissue fragment to be sent to the laboratory and extraction of the mesenchymal stem cells. The study was double-blinded, without the knowledge of what animals would receive the stem cells treatment by the veterinarian neither by the owner. The animals were splitted in two groups, the treated group and the control group. The treated group received the stem cells properly cultivated and the control group received only the transport solution where the stem cells were forwarded. A portion of the cells remained at lab and was induced to differentiation of the bone cells. Another portion of the cells was sent to the MOFA lab at United States of America to perform molecular characterization. Serial x-rays were performed after 15, 30, 60, 90 and 120 days of procedure. The density evaluation of the trabecular bone from spongy substance was done using the software Adobe Photoshop CS6, analyzing the x-ray images. Posteriorly, the images from the two groups was processed by the software Image-Pro Plus 4.1. It was carried out the descriptive statistics analysis to obtain the mean and the standard deviation and the Kolmogorov-Smirnov normality test. In both evaluation was possible to observe that control group obtained better results than treated group in the first 30 days, not obtaining statistical differences in the other periods. Possibly it can be explained by the delay in the period of cell differentiation owing the necessity of reorganization due the inflammatory process after the stem cell introduction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-09-05T18:25:51Z No. of bitstreams: 1 2011_StellaAlvesdaFonseca.pdf: 1459900 bytes, checksum: 8e551b86d0680e69d061e73ab6c7dc88 (MD5) / Approved for entry into archive by Repositorio Gerência(repositorio@bce.unb.br) on 2011-10-25T20:41:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_StellaAlvesdaFonseca.pdf: 1459900 bytes, checksum: 8e551b86d0680e69d061e73ab6c7dc88 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-25T20:41:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_StellaAlvesdaFonseca.pdf: 1459900 bytes, checksum: 8e551b86d0680e69d061e73ab6c7dc88 (MD5) / Foi realizado estudo retrospectivo de 159 cães com ceratoconjuntivite seca (CCS) atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Brasília, a fim de estabelecer os padrões da doença no Distrito Federal. O estudo demonstrou predisposição da raça cocker spaniel (P<0,0001), sinais clínicos mais evidentes em animais com valores do Teste da Lágrima de Schirmer realizado sem colírio anestésico (TLS-1) < 5mm/minuto (P<0,0001) e maior incidência da CCS em cães com idade superior a seis anos. Exceção foi observada em cães da raça Yorkshire terrier, acometidos mais precocemente. Os sinais clínicos observados com maior frequência foram hiperemia conjuntival, secreção mucosa, neovascularização e pigmentação de corneanas. A ciclosporina A foi o principal medicamento prescrito. A fim de investigar o potencial da terapia com células-tronco, foi criado um protocolo aplicado ao tratamento da CCS, de colheita de medula óssea (MO), separação de fração de células mononucleares (FCM) e administração autóloga por via subconjuntival palpebral sobre a glândula da terceira pálpebra de coelhos e cães. Foram utilizados dez coelhos e 20 cães, que, após passarem por exames clínicos e laboratoriais e ambientação, foram divididos em grupo controle e grupo tratado. Para obtenção da FCM, foi realizada colheita, centrifugação e isolamento da medula óssea. O material, ressuspenso em solução salina, foi administrado no grupo tratado, enquanto o grupo controle recebeu apenas solução salina. Os animais passaram por avaliações clínicas e TLS-1 até 60 dias da aplicação, e avaliação histológica da glândula da terceira pálpebra, que demonstraram não haver alterações que contraindicassem o tratamento. Tanto a administração de solução salina quanto a de solução salina + FCM aumentaram significativamente os valores do TLS, mas o aumento foi mais pronunciado nos cães que receberam células mononucleares. Aos 60 dias da aplicação da FCM, os cães tratados apresentaram aumento de 3,4mm;min ao TLS-1. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / A retrospective study of 157 dogs with keratoconjunctivitis sicca (KCS) examined at the Veterinary Hospital at the University of Brasilia was undertaken in order to establish the patterns of disease in Distrito Federal. The study demonstrated predisposition of cocker spaniels (P <0.0001), more clinical signs in patients with Schirmer Tear Test (STT) values less than 5 mm/minutes (P <0.0001) and higher incidence of KCS on dogs over six years (except on Yorkshire terriers, which were stricken younger). Clinical signs more frequently observed were conjunctival hyperaemia, mucus discharge, neovascularization and pigmentation. Cyclosporin A was the main drug prescribed, regardless of the amount of clinical signs and values of the STT presented by each animal. In order to investigate the potential of stem cell therapy, an experimental model of harvest of bone marrow (BM), separation of mononuclear cell fraction (MCF) and administration by subconjunctival autologous eyelid on the third eyelid gland in rabbits and dogs was created and applied to the treatment of KCS. Ten rabbits and 20 dogs were were divided into control and treated group, after undergoing clinical and laboratorial exams and quarantine. To obtain MCF, BM was harvested, centrifuged and isolated. Treated group was submitted to the autotransplant of MCF + saline , while the control group received only saline. The animals underwent clinical and histological evaluation and STT, which showed no contraindicative changes. Both the administration of saline as that of saline + FCM significantly increased the values of the TLS, but the increase was more pronounced in dogs that were inoculated mononuclear cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-27T18:57:45Z No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) / Approved for entry into archive by Repositorio Gerência(repositorio@bce.unb.br) on 2011-10-27T19:42:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-27T19:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) / O processo de diferenciação celular foi por muito tempo considerado progressivo e irreversível. O desenvolvimento da clonagem por transferência nuclear e da indução da pluripotência por fatores definidos (Oct4, Sox2, cMyc, e Klf4) demonstrou inequivocamente que células somáticas podem ser reprogramadas para um estado indiferenciado. No entanto, essas tecnologias permanecem pouco eficientes devido a fatores técnicos e biológicos. A enucleação dos ovócitos representa um dos principais fatores limitantes da transferência nuclear, enquanto que a integração dos transgenes no genoma durante a indução da pluripotência pode afetar negativamente o fenótipo das células. Por isso, os objetivos do presente trabalho foram: aprimorar a enucleação química de ovócitos pela actinomicina D e investigar um mecanismo que permita reprogramar para pluripotência sem Oct4 exógeno, ao compensar a atividade do transgene com moléculas. A investigação da enucleação por actinomicina D permitiu eliminar a toxidez da abordagem durante a maturação dos ovócitos, aumentar a eficiência do procedimento e reduzir drasticamente o período de incubação com a actinomicina D. Diferentes abordagens in vitro e in vivo permitiram determinar que a principal limitação do desenvolvimento embrionário após a enucleação pela actinomicina D é a presença dos cromossomos expostos a actinomicina D dentro gameta. A ativação do gene Nr5a2 foi testada como mecanismo para substituir o Oct4 exógeno na indução da pluripotência, baseandose na importância desse receptor nuclear na regulação do Oct4 durante o desenvolvimento. A expressão forçada do Nr5a2 não aumentou a eficiência da reprogramação com Oct4, Sox2, e Klf4 em fibroblastos, e em conjunto com Sox2 e Klf4 apenas não resultou em células reprogramadas. As tentativas de ajustar a estequiometria das partículas virais e de elevar a expressão endógena do Nr5a2 pelo uso de agonistas também não foram bem sucedidas. Esforços mais recentes utilizando hepatócitos podem determinar se existem limitações tecido-específicas. Apesar das evidências recentes na literatura em suporte ao modelo, ainda não foi possível repetir tais resultados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cell differentiation has long been considered a progressive and irreversible process. The development of cloning by nuclear transfer and induced pluripotency by defined factors (Oct4, Sox2, cMyc, and Klf4) demonstrated inequivocally that somatic cells can be reprogrammed to an undifferentiated state. However, both technologies hold low efficiencies due to technical and biological factors. The enucleation of oocytes represents one of the main limiting factors for nuclear transfer, while the integration of reprogramming vectors in the genome during the induction of pluripotency can negatively affect cell phenotype. Due to these facts, the objectives of the present research were: to improve oocyte chemical enucleation by actinomycin D and to investigate a mechanism that would allow reprogramming in the absence of exogenous Oct4, by replacing the transgene with small molecules. The investigation of oocyte enucleation by actinomycin D confered with the possibility to eliminate the toxic effect of the approach on oocyte maturation, to increase enucleation efficiency and drastically reduce incubation period with the inhibitor. Different in vitro and in vivo approaches altogether allowed the conclusion that the main limiting factor to embryonic development after enucleation by actinomycin D is the presence of cromossomes exposed to the inhibitor inside the oocyte. The induction of Nr5a2 expression was tested as a possible mechanism to replace exogenous Oct4 during reprogramming to pluripotency based on upstream roles of the nuclear receptor on Oct4 levels during development. The ectopic expression of Nr5a2 did not increase reprogramming efficiency with Oct4, Sox2, and Klf4 in fibroblasts, and concomitant with Sox2 and Klf4 only did not yield reprogrammed cells. Fine-tuning of viral stochiometry and atempts to induce endogenous expression of Nr5a2 by agonists were unsuccessful. Recent efforts with hepatocytes might shed some light on possible cell type specific limitations. In spite of recent literature in accordance with this model, it has been challeging to reproduce such results.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-26T15:37:59Z No. of bitstreams: 1 2013_RomuloVitelliRochaPeixoto.pdf: 2229695 bytes, checksum: b9d0c709c69121a3e5d2a1eaff4d1400 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-03T13:13:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RomuloVitelliRochaPeixoto.pdf: 2229695 bytes, checksum: b9d0c709c69121a3e5d2a1eaff4d1400 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T13:13:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RomuloVitelliRochaPeixoto.pdf: 2229695 bytes, checksum: b9d0c709c69121a3e5d2a1eaff4d1400 (MD5) / A ceratoconjuntivite seca em cães é uma afecção frequente na rotina clínica. Embora se verifiquem resultados satisfatórios no emprego de imunomoduladores, alguns pacientes não respondem positivamente ao uso desses fármacos, e a terapia celular pode se tornar uma alternativa ao tratamento convencional. Objetivou-se avaliar os efeitos da aplicação de fração autógena de células mononucleares (FCM) da medula óssea na região periglandular da terceira pálpebra, sobre a superfície ocular de cães com CCS. Foram selecionados 15 pacientes (25 olhos acometidos) provenientes do Serviço de Oftalmologia Veterinária da FAV/UnB, sendo nove machos e seis fêmeas, de dez raças distintas. Para inclusão neste estudo, os indivíduos apresentaram valores inferiores à 10mm/min ao teste lacrimal de Schirmer (TLS). Eles foram submetidos ao TLS, à tonometria de aplanação, à biomicroscopia com lâmpada em fenda, ao tempo de ruptura do filme lacrimal (TRFL), ao teste da lissamina verde e ao teste da fluoresceína, semanalmente, durante 16 semanas consecutivas. Realizou-se, neste mesmo período, avaliação quanto à hiperemia e à secreção ocular, à quemose e à transparência corneal. A medula óssea foi coletada mediante punção pelo esterno, a FCM foi isolada por centrifugação e o pellet contendo a FCM foi aplicado na região periglandular da terceira pálpebra no dia inicial do estudo. Realizou-se biopsia da conjuntiva bulbar temporal superior para avaliação do grau de inflamação e quantificação das células caliciformes no dia da aplicação da FCM e 16 semanas após a mesma. Os resultados obtidos foram avaliados empregando-se teste t-Student e descritos em um gráfico de pontos acompanhado de regressão linear. Verificou-se aumento dos valores do TLS até a sexta semana após o tratamento, seguindo-se diminuição do TLS, mas nos dois momentos não ocorreu diferença estatisticamente significativa dos valores iniciais. Quadro semelhante foi observado com a avaliação dos parâmetros clínicos. Entretanto, o TRFL aumentou ao término das avaliações, bem como a impregnação por lissamina verde foi menor do que a verificada previamente ao tratamento. A inflamação conjuntival foi classificada como inferior, estável e superior aos valores iniciais em 30%, 40% e 30% dos olhos, respectivamente. A média no número de células caliciformes aumentou de 78,3 células/campo para 161 células/campo, verificando-se melhora em 50% dos olhos avaliados, estabilidade em 20% e piora em 30%. Diante das condições experimentais descritas, conclui-se que o uso da fração de células mononucleares da medula óssea aumentou a quantidade de células caliciformes conjuntivais, além de melhorar parâmetros de avaliação da superfície ocular. Desta forma tornando-se uma opção promissora para o tratamento da CCS canina, conferindo melhora à superfície ocular dos pacientes acometidos pela ceratoconjuntivite seca. O efeito de plasticidade celular e a ação anti-inflamatória da FCM sobre a glândula da terceira pálpebra merecem maiores investigações. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The keratoconjunctivitis sicca in dogs is a common condition in clinical practice. While there are satisfactory results in the use of immunomodulators, some patients do not respond positively to these drugs, and cell therapy may become an alternative to conventional treatment. This study aimed to evaluate the effects of the application of autologous mononuclear cell fraction (MCF) bone marrow periglandular in the region of the third eyelid, on the ocular surface of dogs with CCS. We selected 15 patients (25 affected eyes) from the Department of Veterinary Ophthalmology FAV/UNB, nine males and six females, ten distinct breed. For inclusion in this study, subjects had values below the 10mm/min the Schirmer tear test (STT). They were submitted to TLS, the applanation tonometry, slit lamp examination with the slit lamp, the breakup time of the tear film (BUT), the test of lissamine green and fluorescein test weekly for 16 consecutive weeks. Took place in the same period, evaluation as to hyperemia and ocular discharge, the chemosis and corneal transparency. Bone marrow was collected by puncture of the sternum, MCF was isolated by centrifugation and the pellet containing the MCF was applied in the region of the third eyelid periglandular the initial day of the study. Held biopsy superior temporal bulbar conjunctiva for assessing the degree of inflammation and quantification of goblet cells on the day of application of MCF and 16 weeks thereafter. The results were analyzed employing Student's t test and described in a scatterplot accompanied by linear regression. An increase in the values of the TLS until six weeks after treatment, followed by reduction of the TLS, but the two moments not statistically significant difference from baseline. A similar picture was observed with assessment of clinical parameters. However, BUT increased at the end of the evaluations, as well as lissamine green impregnation was lower than that determined prior to treatment. The conjunctival inflammation was ranked lower, stable and superior to the initial values by 30%, 40% and 30% of eyes, respectively. The mean number of goblet cells increased from 78.3 cells / field to 161 cells / field, verifying an improvement in 50% of eyes evaluated, stability in 20% and worsened in 30%. Given the experimental conditions described, it is concluded that the use of the fraction of bone marrow mononuclear cells increased the amount of conjunctival goblet cells, and improve evaluation parameters of the ocular surface. Thus making it a promising option for the treatment of canine CCS, giving improves the ocular surface of patients suffering from keratoconjunctivitis sicca. The effect of cellular plasticity and anti-inflammatory action of MCF on the gland of the third eyelid deserve further investigation.