Os microRNAs (miRs) desempenham um papel importante na biologia das células-tronco por meio da interação com seus mRNAs alvos, induzindo inibição da tradução e/ou degradação destes transcritos. Durante a diferenciação de células pluripotentes, os miRs podem ser induzidos ou reprimidos, no entanto, suas funções específicas são amplamente inexploradas. Nós investigamos os papéis funcionais de um conjunto selecionado de miRs na pluripotência e diferenciação celular, usando microscopia de fluorescência quantitativa (High Content Analysis). Para isso, foram empregadas a NTera-2 (células de carcinoma embrionário humano, CCE) e a H1 (células-tronco embrionárias humanas, CTEh) como modelos. Essas células foram transfectadas reversamente com trinta moléculas de miRs distintas (individualmente) ou moléculas controles. Após 3-4 dias de cultura, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com Hoechst / CellMask Blue (núcleo/citoplasma), anti-OCT4, anti-Ciclina B1 e imageadas com um sistema ImageXpress Micro HCA. O CellProfiler foi utilizado para quantificar vários parâmetros morfométricos e medidas de intensidade de OCT4 e Ciclina B1 em compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Esses dados foram usados para gerar perfis fenotípicos multiparamétricos específicos de cada miR (usando KNIME) e o agrupamento desses dados levou à identificação de vias e processos envolvidos na indução de características de pluripotência ou diferenciação celular causadas por miRs com efeitos fenotípicos similares. Como exemplo, as vias de PI3K-AKT, WNT, TGF? e DICER foram encontradas como moduladas por alguns clusters fenotípicos e os transcritos de alguns alvos foram avaliados por qPCR para validar os achados. Parte do trabalho foi focada na regulação da via Notch por miRNAs em células pluripotentes, o que levou à observação de que o miR- 363-3p inibe a sinalização de Notch e promove pluripotência nessas células. A transfecção de miR-363-3p não apenas elevou as características de pluripotência em NTera-2 e H1, mas também protegeu as CCE da diferenciação induzida por cocultivo com OP9 expressando DLL1 e causou a diminuição no nível de transcritos de PSEN1. Em conclusão, o ensaio desenvolvido aqui provou ser uma ferramenta robusta na detecção de mecanismos moleculares, baseando-se na combinação de análises fenotípicas funcionais e bioinformáticas. / microRNAs (miRs) play an important role in stem cell\'s biology by binding to target mRNAs transcripts, inducing translation blockage and/or transcripts degradation. Upon differentiation of pluripotent cells, miRNAs can be induced or repressed, however, their specific roles are largely unexplored. We investigated the functional roles of a selected set of miRs in pluripotency and differentiation, using quantitative automated fluorescence microscopy (High Content Analysis). For this, we used NTera-2 (human embryonal carcinoma cells, ECC) and H1 (embryonic stem cells; ESC) as models. These cells were reverse-transfected with thirty distinct miRs mimics (individually) or control molecules. Following 3-4 days of culture, cells were fixed, permeabilized and stained with Hoechst/CellMask Blue (nucleus/cytoplasm), antiOCT4, anti-Cyclin B1 and imaged using an ImageXpress Micro HCA System. CellProfiler was used to quantify several morphometric parameters and intensity measurements of OCT4 and CYCB1 in nuclear and cytoplasmic compartments. Quantified parameters were used to generate miR-specific multiparametric phenotypic profiles (using KNIME) and clustering these data led to identification of pathways and processes involved in the induction of pluripotency or cell diferention features caused by miRs with similar phenotypic effects. As an example, PI3K-AKT, WNT, TGF? and DICER pathways were found to be regulated by some phenotypic clusters and transcripts level of some of miR targets were evaluated by qPCR to validate de findings. Part of the work was focused in the regulation of Notch pathway by miRNAs in pluripotent cells, which led the observation that miR-363-3p inhibits Notch signaling and promotes pluripotency feature, as the transfection with miR-363-3p mimic not only enhanced pluripotent phenotype in NTera-2 and H1, but also protected de ECCs from differentiation induced by coculture with OP9 expressing DLL1 and decreased PSEN1 transcripts level.In conclusion, The assay developed here proved to be a robust tool in the detection of molecular mechanisms based on combined functional phenotypic and bioinformatic analyzes.

Orientador: Henrique Marques Barbosa de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:31:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_VivianedeSouza_M.pdf: 2727894 bytes, checksum: d0d5ab88ca9670f3109f39586f01a78c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Células-tronco embrionárias (CTE) são células indiferenciadas que possuem a capacidade de (1) se proliferarem indefinidamente (auto-renovação) e, quando induzidas, (2) darem origem a qualquer tipo celular presente no embrião (pluripotência). Uma das abordagens mais comumente utilizadas para o estudo de diferenciação de CTE é através da formação de agregados multicelulares esféricos denominados corpos embrióides (CE). CE passam por um processo de morfogênese semelhante ao observado em embriões, originando derivados dos três folhetos germinativos. Durante o desenvolvimento embrionário, a formação e o posicionamento dos três folhetos ocorre por um processo altamente coordenado que culmina na formação de um embrião polarizado no eixo anteroposterior. Entretanto, um dos grandes desafios de pesquisas que envolvem o uso da diferenciação de CTE em CE é encontrar indícios de que esses processos são recapitulados in vitro e se entender como que células derivadas dos folhetos germinativos, que no embrião ocorrem de forma altamente organizada, são originadas em estruturas celulares sem nenhuma organização global evidente, como visto em CE. Coup-TFII (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II) é um fator de transcrição o qual possui um papel fundamental na regulação do desenvolvimento embrionário e na aquisição de destinos celulares específicos durante a diferenciação de CTE. Utilizando CE como um modelo de estudo, caracterizamos a expressão de Coup-TFII e seu possível envolvimento durante a determinação de destinos celulares. Nossos resultados identificaram uma expressão hemisférica de Coup-TFII em CE em etapas inicias do processo de diferenciação. Esta observação nos levou a caracterizar a distribuição espacial de marcadores moleculares tecido-específicos nos CE em relação à expressão hemisférica de Coup-TFII. Interessantemente, praticamente todas as células identificadas como precursores mesodérmicos e precursores neuroectodérmicos, através da expressão de Brachyury-T e Nestin, respectivamente, estão contidas nas população de células Coup-TFII-positivas. Estes resultados sugerem a existência de um mecanismo de organização global intrínseco nas CTE, onde a expressão de Coup-TFII parece segregar os CE em dois hemisférios e, provavelmente de forma antagônica com Oct4, determinaria diferentes destinos celulares ainda em fases iniciais da diferenciação / Abstract: Embryonic stem cells (ESC) are undifferentiated cells that have the ability to (1) proliferate indefinitely (self-renewal) and when induced, (2) give rise to any cell type present in the embryo (pluripotency). One of the most commonly used approaches for the study of ESC differentiation is through the formation of spherical multicellular aggregates called embryoid bodies (EB). EB undergo a process similar to that observed in morphogenesis embryos, giving derivatives of three germ layers. During embryonic development, formation and placement of the three germ layers is a highly coordinated process by which culminates in the formation of a polarized embryo in the antero-posterior axis. However, one of the great challenges of research involving the use of ESC differentiation in EB is to find evidence that these processes are recapitulated in vitro and in understanding how to cells derived from the germ layers that occurs in the embryo highly organized manner originate on cellular structures with no apparent global organization, as seen in the EB. COUP-TFII (chicken ovalbumin promoter-upstream transcription factor II) is a transcription factor which plays a key role in the regulation of embryonic development and determination of specific cell fates during differentiation ESC. Using EB as a model system, we characterized the expression of Coup-TFII and its possible involvement in the determination of cell fates. Our results identified a hemispheric expression of Coup-TFII in EB at the onset of differentiation. This observation led us to characterize the spatial distribution of tissue-specific molecular markers in EB in relation the hemispheric expression of Coup-TFII. Interestingly, practically all cells identified as mesodermal and neuroectodermal precursors by the expression of Brachyury-T and Nestin, respectively, are contained in the COUP-TFII-positive cell population. These results suggest the existence of a mechanism of global organization intrinsic to ESC, where the expression of Coup-TFII segregates the EB into two hemispheres and probably antagonistically with Oct4, determine different cell fates still in early stages of differentiation / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

A metilação do DNA em mamíferos é uma importante modificação epigenética, sendo essencial no silenciamento de DNAs repetitivos, de regiões que sofrem imprinting genômico e no estabelecimento do cromossomo X inativo em fêmeas. Existem 5 tipos de DNA Metiltransferases, tendo a DNMT3B um importante papel na metilação de novo. A MeCP2, por sua vez, é uma proteína capaz de reconhecer sítios de DNA metilados e recrutar proteínas responsáveis pela desacetilação das histonas. Isto provoca alterações na conformação da cromatina, impedindo a transcrição gênica. Alterações nos padrões de expressão de DNMT3B e na metilação do DNA encontradas em diferentes tipos de tumores, e a temporalidade de expressão de Dnmt3b e de Mecp2 durante ondas de desmetilação e de metilação que ocorrem no início do desenvolvimento embrionário, podem auxiliar na identificação de fatores envolvidos no estabelecimento e manutenção do padrão de metilação do DNA, os quais ainda são pouco conhecidos. Por sua vez, uma nova classe de pequenos RNAs, os microRNAs, envolvidos com a regulação da expressão gênica pós-transcricional, têm grande importância na manutenção do estado diferenciado de diferentes tipos celulares. Trabalhos recentes demonstram também que há alterações nos padrões de expressão de microRNAs entre tecidos normais e tumorais. Assim, é objetivo deste trabalho a identificação de possíveis miRNAs envolvidos na modulação da expressão dos genes DNMT3B/Dnmt3b e MeCP2/Mecp2 em diferentes linhagens de células normais e tumorais, bem como, em células tronco embrionárias humanas e murinas submetidas à diferenciação. / DNA methylation in mammals is an important epigenetic modification, playing an essential role in the silencing of repetitive DNA, in genomic imprinting and, in females, the establishment of X chromosome inactivation. There are 5 DNA metyhltransferases, and one of them, DNMT3B has an important role in de novo methylation. MeCP2, by its turn, is a protein capable of recognizing methylated DNA sites and of recruiting proteins responsible for histones deacetylation. This causes alterations in chromatin conformation, therefore inhibiting gene transcription. Changes in the expression patterns of DNMT3B and in DNA methylation are found in several types of tumors, and temporal expression of Dnmt3b and Mecp2 during global demetyhlation and de novo methylation waves, which occur in early embryonic development, could give a better understanding of the factors involved in the establishment and maintenance of DNA methylation patterns, which are still largely unkown. Additionally, a new class of small RNAs, the microRNAs, involved in the post-transcriptional gene silencing, has great importance in maintaining the differentiated state of several cell types. Recent studies have demonstrated alterations in miRNAs expression patterns between normal and tumor tissues. Thus, the aim of this work was to identify possible miRNAs involved in the modulation of Dnmt3b and Mecp2 RNAs in different normal and tumoral cell lines, as well as in human and murine embryonic stem cells and their respectively differentiated embryoid bodies.

Fontes alternativas de células β têm sido estudadas para o tratamento de Diabetes mellitus tipo 1, dentre as quais a mais promissora consiste das células-tronco diferenciadas em células produtoras de insulina (IPCs). Alguns trabalhos demonstram a capacidade de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) de formarem estruturas semelhantes a ilhotas pancreáticas, porém, os níveis de produção de insulina são insuficientes para a reversão do diabetes em camundongos diabetizados. Este trabalho visa desenvolver um protocolo adequado para geração de IPCs e contribuir para a identificação e caracterização funcional de novos genes associados à organogênese pancreática. Logo no início da diferenciação das mESCs em IPCs, foi possível verificar o surgimento de células progenitoras, evidenciado pela expressão de marcadores importantes da diferenciação beta-pancreática. Ao final do processo de diferenciação in vitro, ocorreu a formação de agrupamentos (clusters) semelhantes a ilhotas, corando positivamente por ditizona, que é específica para células β-pancreáticas. Para avaliar seu potencial in vivo, estes clusters foram microencapsulados em Biodritina® e transplantados em camundongos diabetizados. Apesar dos níveis de insulina produzidos não serem suficientes para estabelecer a normoglicemia, os animais tratados com IPCs apresentaram melhores condições, quando comparados ao grupo controle, tendo melhor controle glicêmico, ganho de massa corpórea e melhor aparência da pelagem, na ausência de apatia. Além disso, análise dos clusters transplantados nestes animais indicou aumento da expressão de genes relacionados à maturação das células β. Porém, quando estes clusters foram microencapsuladas em Bioprotect® e submetidos à maturação in vivo em animais normais, ocorreu um aumento drástico na expressão de todos os genes analisados, indicando sua maturação completa em células beta. O transplante destas células completamente maturadas em animais diabetizados, tornou-os normoglicêmicos e capazes de responder ao teste de tolerância à glicose (OGTT) de forma semelhante aos animais normais. A segunda parte do trabalho visou analisar genes diferencialmente expressos identificados em estudo anterior do nosso grupo, comparando, através de DNA microarray, mESCs indiferenciadas e diferenciadas em IPCs. Um dos genes diferencialmente expressos é aquele que codifica para a Purkinge cell protein 4 (Pcp4), sendo 3.700 vezes mais expresso em IPCs. Para investigar o possível papel do gene Pcp4 em células β e no processo de diferenciação β-pancreática, adotou-se o enfoque de genômica funcional, superexpressando e inibindo sua expressão em células MIN-6 e mESCs. Apesar da alteração na expressão de Pcp4 em células MIN-6 não ter interferido de forma expressiva na expressão dos genes analisados, quando inibido, modificou o perfil da curva de crescimento celular, aumentando seu tempo de dobramento de forma significativa e diminuindo da viabilidade celular em ensaios de indução de apoptose. Já na diferenciação de mESCs em IPCs, a superexpressão de Pcp4 interferiu de forma positiva apresentando uma tendência a aumentar a expressão dos genes relacionado à diferenciaçãoβ-pancreática. Concluindo, desenvolvemos um novo protocolo de diferenciação de mESCs em IPCs as quais foram capazes de reverter o diabetes em camundongos diabetizados e descrevemos, pela primeira vez, o gene Pcp4 como sendo expresso em células β-pancreáticas, podendo estar relacionado à manutenção da viabilidade celular e maturação destas células. / New cellular sources for type 1 Diabetes mellitus treatment have been previously investigated, the most promising of which seems to be the insulin producing cells (IPCs), obtained by stem cells differentiation. Some reports show that murine embryonic stem cells (mESCs) are able to form islet-like structures, however, their insulin production is insufficient to render diabetic mice normoglycemic. This work aims at developing an adequate protocol for generation of IPCs and searching for new genes which could be involved in the pancreatic organogenesis process. Early on during mESCs differentiation into IPCs, we observed the presence of progenitor cells, which were able to express pancreatic β-cell markers. At the end of the differentiation process, the islet-like clusters positively stained for the insulin-specific dithizone. These clusters were microencapsulated in Biodritin® microcapsules, and then transplanted into diabetized mice. Although the levels of insulin production were insufficient for the animals to achieve normoglycemia, those which received IPCs displayed improved conditions, when compared to the control group, as judged by a better glycemic control, body weight gain and healthy fur appearance, in the absence of apathy. In addition, when these transplantated clusters were retrieved, high levels of expression of the genes related to β-cell maturation were detected. IPCs were also microencapsulated in Bioprotect® and subjected to in vivo maturation in normal animals. A dramatic increase of the analyzed genes expression was observed, indicating complete maturation of the differentiated cells. When these cells were transplanted into diabetized mice, these animals achieved normoglycemia and were able to display glucose tolerance test (OGTT) response very similar to that of normal mice. In the second part of this work, we analyzed upregulated genes described in previous work from our group, comparing undifferentiated mESCs to IPCs using a microarray platform. One of these genes is that coding for the Purkinje cell protein 4 (Pcp4), which is 3,700 more expressed than in undifferentiated mESC cells. We adopted a functional genomics approach to investigate the role played by the Pcp4 gene in β-cells and in β-cell differentiation, by inducing overexpression and knocking down this gene in MIN-6 and mESC cells. Although the differential expression of Pcp4 in MIN-6 was not able to interfere with the expression of the genes analyzed, we observed different cell growth rates, with increased doubling time and decreased cell viability when its expression was knocked down. In addition, overexpression of Pcp4 in mESCs subjected to differentiation into IPCs apparently increases the expression of genes related to β-cell differentiation. In conclusion, we developed a new protocol for ESCs differentiation into IPCs, which is able to revert diabetes in diabetized mice, and we also describe here, for the first time, the Pcp4 gene as being expressed in pancreatic β-cells and possibly being related to maintenance of cell viability and β-cell maturation.

Made available in DSpace on 2016-08-18T18:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA ZELIA JANSEN SARAIVA GOMES.pdf: 382708 bytes, checksum: d4a06d04b79581bd8bab21baebc7e467 (MD5) Previous issue date: 2010-04-14 / A review the decision of the Supreme Court ruled as a constitutional law 11.105/05 (Biosafety Law) concerning the possibility of using embryonic stem cells for scientific research derived from the manipulation of frozen embryos more than three years or impractical for human reproduction. The decision became historic because it can generate the 1st public hearing held by the Supreme Court that, besides having to deal with issues that at first escaped legal issues, such as the beginning of human life in a biomedical perspective. Throughout the analysis, there is a new insight into the legal issues is becoming increasingly a social need, particularly when discussing issues related to human life and ethics, as these create a number of consequences that impact directly the legal environment. The search for solutions to such problems is presented as urgent in view of social harmony, which is necessary to rescue the constitutional principles as a means able to balance tensions between science presented, Law and Ethics. Thus, they are justified in the light of Biolaw and Democratic State of Brazil, the advantages, disadvantages and consequences of permitting such research, so that we can finally analyze the favorable decision of the Supreme Court for the research, which allows, in the near future, be formulated and implemented policies regarding the issues under investigation. / A análise da decisão do Supremo Tribunal Federal que julgou constitucional a lei 11.105/05 (Lei de Biossegurança), referente à possibilidade de utilização de célulastronco embrionárias para pesquisas científicas obtidas a partir da manipulação de embriões congelados há mais de três anos ou inviáveis para a reprodução humana. A decisão se tornou histórica em virtude de ter gerado a 1ª audiência pública realizada por aquela Corte Suprema, além de ter que enfrentar temas que, a princípio, fugiam ao âmbito jurídico, como por exemplo, o início da vida humana em uma perspectiva biomédica. Ao longo da análise, observa-se que uma nova visão sobre as questões jurídicas constitui-se cada vez mais uma necessidade social, especialmente quando se discute temas relacionados à vida humana e sua ética, visto que estas criam diversas conseqüências que repercutem de forma direta no âmbito jurídico. A busca de soluções para tais situações apresenta-se como urgência tendo em vista a harmonia social, o que faz necessário o resgate dos princípios constitucionais como meio capaz de equilibrar tensões apresentadas entre Ciência, Direito e Ética. Assim, são fundamentadas, à luz do Biodireito e do Estado Democrático do Brasil, as vantagens, desvantagens e consequências da permissão de tais pesquisas, para que se possa, por fim, analisar a decisão favorável do Supremo Tribunal Federal para as pesquisas, o que permite, em um futuro próximo, serem formuladas e implementadas políticas públicas referentes à tematica em questão.

Fontes alternativas de células β têm sido estudadas para o tratamento de Diabetes mellitus tipo 1, dentre as quais a mais promissora consiste das células-tronco diferenciadas em células produtoras de insulina (IPCs). Alguns trabalhos demonstram a capacidade de células-tronco embrionárias murinas (mESCs) de formarem estruturas semelhantes a ilhotas pancreáticas, porém, os níveis de produção de insulina são insuficientes para a reversão do diabetes em camundongos diabetizados. Este trabalho visa desenvolver um protocolo adequado para geração de IPCs e contribuir para a identificação e caracterização funcional de novos genes associados à organogênese pancreática. Logo no início da diferenciação das mESCs em IPCs, foi possível verificar o surgimento de células progenitoras, evidenciado pela expressão de marcadores importantes da diferenciação beta-pancreática. Ao final do processo de diferenciação in vitro, ocorreu a formação de agrupamentos (clusters) semelhantes a ilhotas, corando positivamente por ditizona, que é específica para células β-pancreáticas. Para avaliar seu potencial in vivo, estes clusters foram microencapsulados em Biodritina® e transplantados em camundongos diabetizados. Apesar dos níveis de insulina produzidos não serem suficientes para estabelecer a normoglicemia, os animais tratados com IPCs apresentaram melhores condições, quando comparados ao grupo controle, tendo melhor controle glicêmico, ganho de massa corpórea e melhor aparência da pelagem, na ausência de apatia. Além disso, análise dos clusters transplantados nestes animais indicou aumento da expressão de genes relacionados à maturação das células β. Porém, quando estes clusters foram microencapsuladas em Bioprotect® e submetidos à maturação in vivo em animais normais, ocorreu um aumento drástico na expressão de todos os genes analisados, indicando sua maturação completa em células beta. O transplante destas células completamente maturadas em animais diabetizados, tornou-os normoglicêmicos e capazes de responder ao teste de tolerância à glicose (OGTT) de forma semelhante aos animais normais. A segunda parte do trabalho visou analisar genes diferencialmente expressos identificados em estudo anterior do nosso grupo, comparando, através de DNA microarray, mESCs indiferenciadas e diferenciadas em IPCs. Um dos genes diferencialmente expressos é aquele que codifica para a Purkinge cell protein 4 (Pcp4), sendo 3.700 vezes mais expresso em IPCs. Para investigar o possível papel do gene Pcp4 em células β e no processo de diferenciação β-pancreática, adotou-se o enfoque de genômica funcional, superexpressando e inibindo sua expressão em células MIN-6 e mESCs. Apesar da alteração na expressão de Pcp4 em células MIN-6 não ter interferido de forma expressiva na expressão dos genes analisados, quando inibido, modificou o perfil da curva de crescimento celular, aumentando seu tempo de dobramento de forma significativa e diminuindo da viabilidade celular em ensaios de indução de apoptose. Já na diferenciação de mESCs em IPCs, a superexpressão de Pcp4 interferiu de forma positiva apresentando uma tendência a aumentar a expressão dos genes relacionado à diferenciaçãoβ-pancreática. Concluindo, desenvolvemos um novo protocolo de diferenciação de mESCs em IPCs as quais foram capazes de reverter o diabetes em camundongos diabetizados e descrevemos, pela primeira vez, o gene Pcp4 como sendo expresso em células β-pancreáticas, podendo estar relacionado à manutenção da viabilidade celular e maturação destas células. / New cellular sources for type 1 Diabetes mellitus treatment have been previously investigated, the most promising of which seems to be the insulin producing cells (IPCs), obtained by stem cells differentiation. Some reports show that murine embryonic stem cells (mESCs) are able to form islet-like structures, however, their insulin production is insufficient to render diabetic mice normoglycemic. This work aims at developing an adequate protocol for generation of IPCs and searching for new genes which could be involved in the pancreatic organogenesis process. Early on during mESCs differentiation into IPCs, we observed the presence of progenitor cells, which were able to express pancreatic β-cell markers. At the end of the differentiation process, the islet-like clusters positively stained for the insulin-specific dithizone. These clusters were microencapsulated in Biodritin® microcapsules, and then transplanted into diabetized mice. Although the levels of insulin production were insufficient for the animals to achieve normoglycemia, those which received IPCs displayed improved conditions, when compared to the control group, as judged by a better glycemic control, body weight gain and healthy fur appearance, in the absence of apathy. In addition, when these transplantated clusters were retrieved, high levels of expression of the genes related to β-cell maturation were detected. IPCs were also microencapsulated in Bioprotect® and subjected to in vivo maturation in normal animals. A dramatic increase of the analyzed genes expression was observed, indicating complete maturation of the differentiated cells. When these cells were transplanted into diabetized mice, these animals achieved normoglycemia and were able to display glucose tolerance test (OGTT) response very similar to that of normal mice. In the second part of this work, we analyzed upregulated genes described in previous work from our group, comparing undifferentiated mESCs to IPCs using a microarray platform. One of these genes is that coding for the Purkinje cell protein 4 (Pcp4), which is 3,700 more expressed than in undifferentiated mESC cells. We adopted a functional genomics approach to investigate the role played by the Pcp4 gene in β-cells and in β-cell differentiation, by inducing overexpression and knocking down this gene in MIN-6 and mESC cells. Although the differential expression of Pcp4 in MIN-6 was not able to interfere with the expression of the genes analyzed, we observed different cell growth rates, with increased doubling time and decreased cell viability when its expression was knocked down. In addition, overexpression of Pcp4 in mESCs subjected to differentiation into IPCs apparently increases the expression of genes related to β-cell differentiation. In conclusion, we developed a new protocol for ESCs differentiation into IPCs, which is able to revert diabetes in diabetized mice, and we also describe here, for the first time, the Pcp4 gene as being expressed in pancreatic β-cells and possibly being related to maintenance of cell viability and β-cell maturation.