Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-08-03T12:16:33Z No. of bitstreams: 1 gabriellafreitasferreira.pdf: 1111733 bytes, checksum: 4b8a7e3965e36b834dcb1890165ad008 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-03T12:21:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gabriellafreitasferreira.pdf: 1111733 bytes, checksum: 4b8a7e3965e36b834dcb1890165ad008 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T12:21:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gabriellafreitasferreira.pdf: 1111733 bytes, checksum: 4b8a7e3965e36b834dcb1890165ad008 (MD5) Previous issue date: 2015-07-03 / PROQUALI (UFJF) / Embora os principais mecanismos de ação do fluconazol, itraconazol e anfotericina B estejam relacionados ao egosterol, é possível que essas drogas tenham outros efeitos nas células fúngicas. Além dos mais, a heterorresistência é considerada um mecanismo de adaptação frente a um estresse induzido por concentrações crescentes de antifúngicos no ambiente. Sendo o itraconazol um dos azólicos usados no tratamento da criptococose, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência do estresse oxidativo e nitrosativo gerado pelos antifúngicos em células de C. gattii e sua influência no surgimento de clones heterorresistentes. Foram estudados distintos parâmetros para avaliar os estresses oxidativo e nitrosativo induzidos pelo fluconazol, itraconazol e anfotericina B em C. gattii. Já os efeitos da heterorresistência ao itraconazol foram estudados por meio de ensaios in vitro e em modelo murino. O itraconazol simultaneamente reduziu o conteúdo de ergosterol das células de C. gattii e induziu a produção de espécies reativas de oxigênio no início do tratamento, o que levou ao aumento da atividade das enzimas peroxidase e superoxidodismutase. O mesmo não aconteceu com o fluconazol. Já a anfotericina B promoveu grande estresse oxidativo e nitrosativo nas células de C. gattii, o que levou a uma elevada peroxidação lipídica e ineficiente ativação do sistema antioxidante celular. A heterorresistência ao itraconazol foi intrínseca para todas as linhagens testaddas, alterou parâmetros farmacodinâmicos, diminuiu o diâmetro celular e o tamanho da cápsula e ativação do sistema antioxidante celular. Observou-se uma correlação positiva entre a razão superfície/volume e o nível de heterorresistência ao itraconazol. Além do mais, a heterorresistência levou a maior internalização das células criptocócicas pelos macrófagos, mas também a uma maior proliferação dentro dessa célula fagocítica, o que culminou com o aumento da virulência dos clones heterorresistentes e alta carga fúngica nos pulmões e cérebro dos camundongos. Diante desses resultados, concluiu-se que o estresse oxidativo possuiu um importante papel no mecanismo de ação do itraconazol e pode ser um dos mecanismos que levam a heterorresistência e o aumento da virulência das células de C. gattii. / Although the most accepted mechanisms of action of amphotericin B and azoles are related to ergosterol, it is possible that these drugs have other effects on the fungal cell. Moreover, heteroresistance is an adaptive mechanism developed by the microorganism to counteract the stress of increasing drug concentration in the environment. Since itraconazole is used in the therapy of cryptococcosis, the aim of this study was to evaluate the role of endogenous reactive oxygen species (ROS) and peroxynitrite produced by azoles and amphotericin B in the fungus C. gattii and its influence on emergence of heteroresistante clones to itraconazole. We studied distinct parameters to evaluate the effect of oxidative and nitrosative stresses induced by fluconazole, itraconazole and amphotericin B in C. gattii cells. The effects of the heteroresistance to itraconazole were studied by performing tests in vitro and in a murine model. Itraconazole reduces the level of ergosterol and led to ROS production in C. gattii cells in the early stages of the treatment, enhancing the antioxidant activity. The same did not happen with fluconazole. Amphotericin B caused lipid peroxidation in C. gattii cells through a greatly enhanced production of oxidative and nitrosative radicals with increased lipid peroxidation and inefficient ativaction of antioxidant cellular system. Heteroresistance to itraconazole was intrinsic in all strains tested and changed pharmacodynamics parameters, diminished cell and capsule sizes, reduced ergosterol content and enhanced the antioxidant system of heteroresistant clones. Indeed, heteroresistance to itraconazole led to the increased internalization of cryptococcal cells by macrophages, but also to a prominent proliferation inside these phagocytic cells, culminating in the higher virulence of heteroresistant clones. Based on these results, we conclude that oxidative bursts play an important role in the antifungal activity of itraconazole and may be one of the mechanisms that lead to heteroresistance and the increased virulence of C. gattii.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system