A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-28T14:36:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL PDF DIGITAL.pdf: 1241777 bytes, checksum: 0031dd125d40fe083cb1ec9da8552635 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T14:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL PDF DIGITAL.pdf: 1241777 bytes, checksum: 0031dd125d40fe083cb1ec9da8552635 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CNPq / Pacientes acometidos por neoplasias hematológicas realizam tratamento quimioterápico intenso e têm alto risco de desenvolver infecções invasivas por espécies de Candida spp. devido à baixa resposta imune, neutropenia e outros fatores de risco, contribuindo para uma elevada morbimortalidade. Entretanto, devido a peculiaridades da imunossupressão a que são submetidos, a distinção entre os processos infecciosos ainda não é uma tarefa fácil podendo levar o paciente a óbito. O presente estudo teve como objetivo diagnosticar candidemias e avaliar o perfil epidemiológico e sensibilidade antifúngica em pacientes acometidos por neoplasias hematológicas. O diagnóstico micológico foi realizado através da taxonomia clássica e automatizada e confirmado pela técnica molecular (PCR-Reação em Cadeia da Polimerase) e identificação proteômica (MALDI-TOF MS). O teste de sensibilidade antifúngica seguiu as recomendações M27-A3 do Clinical & Laboratory Standards Institute (2008). A análise estatística descritiva foi realizada no programa GraphPad Prism6 através do teste exato de Fisher e cálculo do Odds ratio (intervalo de confiança de 95% para p < 0,05). Foram analisadas 105 amostras sanguíneas de 62 pacientes internados no serviço de Onco-hematologia do Hospital de Câncer de Pernambuco (HCP) no período de janeiro de 2015 a setembro de 2015. Dentre estas, foram isoladas nove (8,57%) leveduras do gênero Candida, sendo seis (66,66%) C. tropicalis e três (33,34%) C. albicans. O óbito ocorreu em 66,6% dos casos de candidemia demonstrando haver associação estatística significativa (p = 0,03, Odds Ratio = 5,53). O internamento em UTI, como fator de risco, foi associado à candidemia (p = 0,0008 Odds ratio = 24,8) e o choque séptico ao óbito (p= 0,0476 Odds ratio= 25,67). Ao teste de sensibilidade antifúngica, os isolados mostraram sensibilidade aos antimicóticos anfotericina B, caspofungina, micafungina, anidulafungina e fluconazol. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que candidemia é uma infecção invasiva frequente causada por espécies de Candida não-albicans, em pacientes com neoplasias hematológicas, como a espécie C. tropicalis. / Patients affected by neoplasia hematological which require intense chemotherapy treatment have high risk of developing invasive infections by Candida spp species due to low immune response, neutropenia and other risk factors contributing to high morbimortality. However, due to peculiarities of the immunosuppression that are submitted, the distinction between the infectious processes is still not an easy task and may progress rapidly and take the patient to death. The study aimed to identify the candidemia and epidemiological profile in patients with hematologic neoplasia. The mycological diagnosis was performed by classical taxonomy and automated and confirmed to molecular technique (PCR-polymerase chain reaction) and proteomics (MALDI-TOF MS). The antifungal susceptibility testing followed the M27 -A3 & recommendations of the Clinical Laboratory Standards Institute (2008). The descriptive statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 program through the Fisher exact test and calculation of Odds ratio (95% confidence interval for p < 0.05) .Blood samples (105) were analysed of 62 patients admitted in the oncohematology service of the Hospital of Pernambuco (HCP) from January 2015 to September 2015. Among samples studied, nine (8,57%) were found positive for yeasts of the genus Candida in which identified six (66,66%) species C. tropicalis and three (33,34%) C. albicans. The death occurred in 66.6 % of cases of candidemia demonstrated significant statistical association (p = 0,03, Odds ratio = 5,53). The admission to the ICU, as a risk factor was associated with candidemia (p = 0.0008 Odds ratio = 24.8) and septic shock with death (p = 0.0476 Odds ratio = 25.67). The antifungal susceptibility testing, isolates were presented, in its entirety, sensitive to antifungal agents amphotericin B, caspofungin, micafungin, anidulafungin and fluconazole. Among the patients with candidemia 66,6% evolved to death. Based on these results, one can conclude that candidemia is a common invasive infection caused by Candida non-albicans species in patients with hematological malignancies, such as C. tropicalis species.

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The prevalence of Candida spp. as commensal of the oral cavity can reach 70%. However, oral cavity colonization not always culminates in oral candidiasis, however it can be considered a preliminary condition for the development of it. Oral candidiasis is the most common fungal infection among individuals with HIV, due the result of immune deficiency. Considering the importance of this type of infection in HIV-positive, we proposed to carry out this work with the following objectives: determine the frequency of HIV positive individuals colonized by Candida spp., Candida species isolated; determine the main predisposing factors for oral colonization by Candida spp., to relate the microbial load of colonization with the count of lymphocytes TCD4+, viral load and antiretroviral therapy used at the time of collection; determine the sensitivity of isolates of Candida spp. antifungal fluconazole, itraconazole, voriconazole, amphotericin B and nystatin, by the methodology of disk diffusion and search for the exoenzymes proteinases, phospholipases, hemolysin and DNase in isolates of Candida spp. From May to October 2012 saliva samples from HIV patients attended at Clinical Hospital - Federal University of Uberlândia and HIV negative individuals were collected, which were seeded onto plates containing Sabouraud Dextrose Agar and CHROMagar Candida plates and incubated in a bacteriological incubator at 30ºC for 72 hours. The identification of the isolates was done by classical methodology, using chromogenic agar and assimilation of carbon sources and nitrogen, the differentiation between C. dubliniensis and C. albicans was made by PCR. Candida spp. were isolated from 89 of the 147 patients studied, a total of 111 isolates, C. albicans the most common species among the isolates (67.6%). The average colony count was 8.8x10³ CFU/mL. In the control group 51 of the 150 saliva samples were positive for Candida, obtained 57 isolates, of which 77.2% were C. albicans. The average of CFU/mL was 9.8x10². The predisposing factors for oral colonization were use of antibiotics and oral prosthesis and a low CD4 + cells count and high viral load. The combined use of antiretroviral class of reverse transcriptase inhibitors had a greater protective effect on the colonization than the use of these drugs associated with protease inhibitors. The nystatin antifungal, voriconazole and amphotericin B showed the highest number of samples of Candida spp. sensitive in both groups followed by fluconazole and itraconazole. The phospholipase production was observed in 69.3% and 72.6% of the isolates from the group of patients and HIV negative, respectively. The production of haemolysin by isolates of HIV positive and non-positive patients, respectively, was to 98.2% and 96.5%, DNAse was produced by 27% and 21% of the isolates from patients and non-patients of HIV. Finally, with the exception of DNAse, there was no statistically significant difference between isolates from the two study groups in the characters studied. / A prevalência de Candida spp. como comensal da cavidade oral pode chegar a 70%. Entretanto, a colonização da cavidade oral nem sempre culmina na candidíase bucal, porém pode ser considerada uma condição preliminar para o desenvolvimento da mesma. A candidiase bucal é a infecção fúngica mais comum entre os indivíduos portadores do HIV, resultado do comprometimento imunológico dos mesmos. Considerando a importância desse tipo de infecção em HIV positivos, propusemos a realização do presente trabalho com os seguintes objetivos: determinar a frequência de indivíduos HIV positivos colonizados por Candida spp., bem como as espécies de Candida isoladas; determinar os principais fatores predisponentes para a colonização oral por Candida spp., relacionar a carga microbiana de colonização com a contagem de linfócitos T CD4+, carga viral e terapia antirretroviral utilizada no momento da coleta; determinar a sensibilidade dos isolados de Candida spp. aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, voriconazol, anfotericina B e nistatina, pela metodologia de difusão de disco e pesquisar as exoenzimas proteinases, fosfolipases, DNAse e hemolisina nos isolados de Candida spp. No período de maio a outubro de 2012 foram coletadas amostras de saliva de portadores do HIV atendidos no HC-UFU e de indivíduos HIV negativos, as quais foram semeadas em placas contendo Ágar Sabouraud Dextrose e em placas com CHROMágar Candida e incubadas em estufa bacteriológica à 30ºC por 72 horas. A identificação dos isolados foi feita pela metodologia clássica, utilização de ágar cromogênico e assimilação de fontes de carbono e nitrogênio, sendo a diferenciação de C. albicans e C. dubliniensis feita através de PCR. Os testes de sensibilidade e pesquisa de fatores de virulência foram feitos conforme descrito no documento da CLSI (2009) e na literatura. Candida spp. foram isoladas de 89 dos 147 pacientes estudados, totalizando 111 isolados, sendo C. albicans a espécie mais freqüente entre os isolados (67,6%). A contagem média de colônias foi de 8,8x103 UFC/mL. Já no grupo controle 51 das 150 amostras de saliva foram positivas para gênero Candida, obtendo 57 isolados, dos quais 77,2% eram C. albicans. A média de UFC/mL foi de 9,8x10². Os fatores predisponentes para colonização bucal foram uso de antibióticos e prótese oral, bem como uma baixa contagem de CD4+ e alta carga viral. O uso combinado de antirretrovirais da classe dos inibidores de trancriptase reversa apresentou um maior efeito protetor para a colonização do que o uso desses medicamentos associados com inibidores de protease. Os antifúngicos nistatina, voriconazol e anfotericina B apresentaram o maior número de amostras de Candida spp. sensíveis em ambos os grupos, seguidos pelo fluconazol e itraconazol. A produção de fosfolipase foi observada em 69,3% e 72,6% dos isolados provenientes do grupo de pacientes e de HIV negativos, respectivamente. Proteinase foi produzida por 77,5% e 90,7% das espécies de Candida obtidas do grupo de pacientes e de HIV negativos, respectivamente. A produção de hemolisina pelos isolados do grupo de HIV positivos e não portadores, respectivamente, foi igual a 98,2% e 96,5%. DNAse foi produzida por 27% e 21% dos isolados proveniente dos pacientes e dos não HIV. Por fim, com exceção da DNAse, não houve diferença estatisticamente significativa entre os isolados dos dois grupos de estudo em relação às características estudadas. / Mestre em Ciências da Saúde

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety