A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

Candida dubliniensis é uma espécie descrita como fenotipicamente semelhante a Candida albicans. Desde sua descrição, em 1995, em Dublin, Irlanda, por Sullivan et al, inúmeros relatos sobre esta levedura são encontrados com o objetivo de se conhecer a origem desta espécie, bem como distinguir as semelhanças e diferenças que existem entre elas. Alguns autores têm observado que esta levedura apresenta resistência a alguns antifúngicos, mais utilizados na prática médica, principalmente sob o ponto de vista imunológico, caso dos portadores de HIV. A gênese do processo de infecção se mostra pouco conhecida. A capacidade de adesão a superfície celular e a produção de exoenzimas são fatores determinantes para o desencadeamento da infecção. A susceptibilidade a toxinas Killer necessita ser estudada, pois permite determinar um significante número de tipos sensíveis de cepas de leveduras. Frente ao exposto, buscamos avaliar o comportamento desta espécie por meio da pesquisa de capacidade de adesão, produção de proteinase e fosfolipase, susceptibilidade a toxinas Killer e resistência a antifúngicos. O ensaio de adesão foi fortemente aderente para a amostra padrão ATCC 777, e aderente para os demais isolados. A atividade enzimática para produção de proteinase mostrou-se se fortemente positiva para a amostra padrão ATCC 777, amostra ATCC 778, CD 07 e CD 14 de C dubliniensis. Entre os isolados presuntivos de C dubliniensis 1 (038), positivo e nos demais 013, 058, 096 e 107, não se observou atividade enzimática. Para a produção de fosfolipase não houve um comportamento distinto entre as amostras de C dubliniensis e os isolados presuntivos. Nenhuma amostra deixou de produzir esta enzima. Os testes de sensibilidade das amostras frente às cepas padrão produtoras de toxinas Killer mostraram dois biótipos diferentes. Os mais freqüentes foram 888 e 688 do total dos 9 isolados estudados. O isolado biótipo 688 (ATCC- 777) de C dubliniensis foi sensível a toxina K2. As demais amostras de C dubliniensis, bem como os isolados presuntivos apesar de serem provenientes de indivíduos HIV+ foram resistentes a K2 e à todas as demais toxinas. Em relação à pesquisa de resistência a antifúngicos, as amostras e isolados presuntivos de C. dubliniensis utilizando se o E-test, foram sensíveis a família dos azóis com valores de CIM de 0.002 1.0 mg/ml e para Anfotericina B os valores de CMI estavam entre 0.002- 0.032. As condições desse estudo permitimo-nos comentar que excetuando a amostra padrão ATCC 777 que teve comportamento distinto em relação às demais amostras, identificadas por genotipagem, como C. dubliniensis e isolados presuntivos, todas apresentaram um comportamento semelhante entre si. Estudos com um maior número de amostras de C. dubliniensis e utilizando-se esses testes ainda são necessários para elucidar se realmente existe um comportamento fenotípico diferencial dessa levedura em relação a C. albicans. / Candida dubliniensis is a newly described specie which is closely related phylogenetically to Candida albicans. It was first identified as a new specie by Sullivan et al., in Dublin, Ireland, 1995.Numerous researches are attempting to identify more detailed characteristics of C. dubliniensis and similitudes and differences between the two related species.The resistence of C. dubliniensis to the usual drugs employed to treat candidosis, particularly in human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals has been emphasizely described. The susceptibility to killer toxins may also contribute to explain some aspects of the resistence process in Candidal infection. Other characteristics such as adhesion capability and exoenzymes activity have been studied in comparision with this newer specie.The aim of this study was to evaluate adhesion capability, exoenzymes activity (proteinase and phospholipase), susceptibility to Killer toxins and sensibility to antifungal agents (azoles and amphotericin B) through E-test of 9 Candida dubliniensis isolates from HIV+ individuals.The adhesion test was strongly positive for the strain ATCC 777 and positive for the other strains. Proteinase activity was strongly posive for the strains ATCC 777, ATCC 778, CD 07, and CD 14, positive for the strain 038 and negative for the other. Phospholipase activity revealed strongly positive results for the strains ATCC 777, CD14, 038, 107. The strains ATCC 778, CD 07, 013, 058, and 096 had positive activity and activity was no absent. The Susceptibility to killer toxin showed to different biotypes: 888 and 688. Only the ATCC 777 strain was susceptible to K2 toxin. No strains presented resistance to azoles or amphotericin-B. The results showed MICs ranged between 0.002 1.0 mg/ml e 0.002- 0.032 respectively.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The prevalence of Candida spp. as commensal of the oral cavity can reach 70%. However, oral cavity colonization not always culminates in oral candidiasis, however it can be considered a preliminary condition for the development of it. Oral candidiasis is the most common fungal infection among individuals with HIV, due the result of immune deficiency. Considering the importance of this type of infection in HIV-positive, we proposed to carry out this work with the following objectives: determine the frequency of HIV positive individuals colonized by Candida spp., Candida species isolated; determine the main predisposing factors for oral colonization by Candida spp., to relate the microbial load of colonization with the count of lymphocytes TCD4+, viral load and antiretroviral therapy used at the time of collection; determine the sensitivity of isolates of Candida spp. antifungal fluconazole, itraconazole, voriconazole, amphotericin B and nystatin, by the methodology of disk diffusion and search for the exoenzymes proteinases, phospholipases, hemolysin and DNase in isolates of Candida spp. From May to October 2012 saliva samples from HIV patients attended at Clinical Hospital - Federal University of Uberlândia and HIV negative individuals were collected, which were seeded onto plates containing Sabouraud Dextrose Agar and CHROMagar Candida plates and incubated in a bacteriological incubator at 30ºC for 72 hours. The identification of the isolates was done by classical methodology, using chromogenic agar and assimilation of carbon sources and nitrogen, the differentiation between C. dubliniensis and C. albicans was made by PCR. Candida spp. were isolated from 89 of the 147 patients studied, a total of 111 isolates, C. albicans the most common species among the isolates (67.6%). The average colony count was 8.8x10³ CFU/mL. In the control group 51 of the 150 saliva samples were positive for Candida, obtained 57 isolates, of which 77.2% were C. albicans. The average of CFU/mL was 9.8x10². The predisposing factors for oral colonization were use of antibiotics and oral prosthesis and a low CD4 + cells count and high viral load. The combined use of antiretroviral class of reverse transcriptase inhibitors had a greater protective effect on the colonization than the use of these drugs associated with protease inhibitors. The nystatin antifungal, voriconazole and amphotericin B showed the highest number of samples of Candida spp. sensitive in both groups followed by fluconazole and itraconazole. The phospholipase production was observed in 69.3% and 72.6% of the isolates from the group of patients and HIV negative, respectively. The production of haemolysin by isolates of HIV positive and non-positive patients, respectively, was to 98.2% and 96.5%, DNAse was produced by 27% and 21% of the isolates from patients and non-patients of HIV. Finally, with the exception of DNAse, there was no statistically significant difference between isolates from the two study groups in the characters studied. / A prevalência de Candida spp. como comensal da cavidade oral pode chegar a 70%. Entretanto, a colonização da cavidade oral nem sempre culmina na candidíase bucal, porém pode ser considerada uma condição preliminar para o desenvolvimento da mesma. A candidiase bucal é a infecção fúngica mais comum entre os indivíduos portadores do HIV, resultado do comprometimento imunológico dos mesmos. Considerando a importância desse tipo de infecção em HIV positivos, propusemos a realização do presente trabalho com os seguintes objetivos: determinar a frequência de indivíduos HIV positivos colonizados por Candida spp., bem como as espécies de Candida isoladas; determinar os principais fatores predisponentes para a colonização oral por Candida spp., relacionar a carga microbiana de colonização com a contagem de linfócitos T CD4+, carga viral e terapia antirretroviral utilizada no momento da coleta; determinar a sensibilidade dos isolados de Candida spp. aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, voriconazol, anfotericina B e nistatina, pela metodologia de difusão de disco e pesquisar as exoenzimas proteinases, fosfolipases, DNAse e hemolisina nos isolados de Candida spp. No período de maio a outubro de 2012 foram coletadas amostras de saliva de portadores do HIV atendidos no HC-UFU e de indivíduos HIV negativos, as quais foram semeadas em placas contendo Ágar Sabouraud Dextrose e em placas com CHROMágar Candida e incubadas em estufa bacteriológica à 30ºC por 72 horas. A identificação dos isolados foi feita pela metodologia clássica, utilização de ágar cromogênico e assimilação de fontes de carbono e nitrogênio, sendo a diferenciação de C. albicans e C. dubliniensis feita através de PCR. Os testes de sensibilidade e pesquisa de fatores de virulência foram feitos conforme descrito no documento da CLSI (2009) e na literatura. Candida spp. foram isoladas de 89 dos 147 pacientes estudados, totalizando 111 isolados, sendo C. albicans a espécie mais freqüente entre os isolados (67,6%). A contagem média de colônias foi de 8,8x103 UFC/mL. Já no grupo controle 51 das 150 amostras de saliva foram positivas para gênero Candida, obtendo 57 isolados, dos quais 77,2% eram C. albicans. A média de UFC/mL foi de 9,8x10². Os fatores predisponentes para colonização bucal foram uso de antibióticos e prótese oral, bem como uma baixa contagem de CD4+ e alta carga viral. O uso combinado de antirretrovirais da classe dos inibidores de trancriptase reversa apresentou um maior efeito protetor para a colonização do que o uso desses medicamentos associados com inibidores de protease. Os antifúngicos nistatina, voriconazol e anfotericina B apresentaram o maior número de amostras de Candida spp. sensíveis em ambos os grupos, seguidos pelo fluconazol e itraconazol. A produção de fosfolipase foi observada em 69,3% e 72,6% dos isolados provenientes do grupo de pacientes e de HIV negativos, respectivamente. Proteinase foi produzida por 77,5% e 90,7% das espécies de Candida obtidas do grupo de pacientes e de HIV negativos, respectivamente. A produção de hemolisina pelos isolados do grupo de HIV positivos e não portadores, respectivamente, foi igual a 98,2% e 96,5%. DNAse foi produzida por 27% e 21% dos isolados proveniente dos pacientes e dos não HIV. Por fim, com exceção da DNAse, não houve diferença estatisticamente significativa entre os isolados dos dois grupos de estudo em relação às características estudadas. / Mestre em Ciências da Saúde

Candida dubliniensis é uma espécie descrita como fenotipicamente semelhante a Candida albicans. Desde sua descrição, em 1995, em Dublin, Irlanda, por Sullivan et al, inúmeros relatos sobre esta levedura são encontrados com o objetivo de se conhecer a origem desta espécie, bem como distinguir as semelhanças e diferenças que existem entre elas. Alguns autores têm observado que esta levedura apresenta resistência a alguns antifúngicos, mais utilizados na prática médica, principalmente sob o ponto de vista imunológico, caso dos portadores de HIV. A gênese do processo de infecção se mostra pouco conhecida. A capacidade de adesão a superfície celular e a produção de exoenzimas são fatores determinantes para o desencadeamento da infecção. A susceptibilidade a toxinas Killer necessita ser estudada, pois permite determinar um significante número de tipos sensíveis de cepas de leveduras. Frente ao exposto, buscamos avaliar o comportamento desta espécie por meio da pesquisa de capacidade de adesão, produção de proteinase e fosfolipase, susceptibilidade a toxinas Killer e resistência a antifúngicos. O ensaio de adesão foi fortemente aderente para a amostra padrão ATCC 777, e aderente para os demais isolados. A atividade enzimática para produção de proteinase mostrou-se se fortemente positiva para a amostra padrão ATCC 777, amostra ATCC 778, CD 07 e CD 14 de C dubliniensis. Entre os isolados presuntivos de C dubliniensis 1 (038), positivo e nos demais 013, 058, 096 e 107, não se observou atividade enzimática. Para a produção de fosfolipase não houve um comportamento distinto entre as amostras de C dubliniensis e os isolados presuntivos. Nenhuma amostra deixou de produzir esta enzima. Os testes de sensibilidade das amostras frente às cepas padrão produtoras de toxinas Killer mostraram dois biótipos diferentes. Os mais freqüentes foram 888 e 688 do total dos 9 isolados estudados. O isolado biótipo 688 (ATCC- 777) de C dubliniensis foi sensível a toxina K2. As demais amostras de C dubliniensis, bem como os isolados presuntivos apesar de serem provenientes de indivíduos HIV+ foram resistentes a K2 e à todas as demais toxinas. Em relação à pesquisa de resistência a antifúngicos, as amostras e isolados presuntivos de C. dubliniensis utilizando se o E-test, foram sensíveis a família dos azóis com valores de CIM de 0.002 1.0 mg/ml e para Anfotericina B os valores de CMI estavam entre 0.002- 0.032. As condições desse estudo permitimo-nos comentar que excetuando a amostra padrão ATCC 777 que teve comportamento distinto em relação às demais amostras, identificadas por genotipagem, como C. dubliniensis e isolados presuntivos, todas apresentaram um comportamento semelhante entre si. Estudos com um maior número de amostras de C. dubliniensis e utilizando-se esses testes ainda são necessários para elucidar se realmente existe um comportamento fenotípico diferencial dessa levedura em relação a C. albicans. / Candida dubliniensis is a newly described specie which is closely related phylogenetically to Candida albicans. It was first identified as a new specie by Sullivan et al., in Dublin, Ireland, 1995.Numerous researches are attempting to identify more detailed characteristics of C. dubliniensis and similitudes and differences between the two related species.The resistence of C. dubliniensis to the usual drugs employed to treat candidosis, particularly in human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals has been emphasizely described. The susceptibility to killer toxins may also contribute to explain some aspects of the resistence process in Candidal infection. Other characteristics such as adhesion capability and exoenzymes activity have been studied in comparision with this newer specie.The aim of this study was to evaluate adhesion capability, exoenzymes activity (proteinase and phospholipase), susceptibility to Killer toxins and sensibility to antifungal agents (azoles and amphotericin B) through E-test of 9 Candida dubliniensis isolates from HIV+ individuals.The adhesion test was strongly positive for the strain ATCC 777 and positive for the other strains. Proteinase activity was strongly posive for the strains ATCC 777, ATCC 778, CD 07, and CD 14, positive for the strain 038 and negative for the other. Phospholipase activity revealed strongly positive results for the strains ATCC 777, CD14, 038, 107. The strains ATCC 778, CD 07, 013, 058, and 096 had positive activity and activity was no absent. The Susceptibility to killer toxin showed to different biotypes: 888 and 688. Only the ATCC 777 strain was susceptible to K2 toxin. No strains presented resistance to azoles or amphotericin-B. The results showed MICs ranged between 0.002 1.0 mg/ml e 0.002- 0.032 respectively.