Resumo: A estruturação dos serviços de saúde para o desenvolvimento de programas de controle de zoonoses como a raiva e leishmaniose se depara com recomendações sobre a importância de programas de controle populacional de cães, no entanto as normas do Estado de São Paulo para transporte de cães exigem apenas o atestado veterinário, inexistindo controle e registro da entrada de animais importados pelos órgãos oficiais, representando risco da introdução de novas doenças. O presente estudo foi realizado durante a 36ª campanha anual de vacinação anti-rábica de 2004, realizada pela Prefeitura de Botucatu em parceria com a FMVZ/UNESP de Botucatu/SP. O objetivo foi descrever a população de cães com ênfase em sua origem. Foi aplicado um questionário, a 676 proprietários, 4% dos 17.910 cães vacinados, em 20 postos de vacinação, representativos dos 47, distribuídos homogeneamente em cinco regiões da área territorial urbana. Para a escolha dos animais, considerou-se um plano de amostragem sistemática e para definição da amostra foi considerada a taxa de 10% de erro de estimação, com 95% de confiança. Cerca de 10% dos animais são originários de outras cidades, várias com transmissão de leishmaniose visceral, sendo um dos animais originário de outro estado. A maioria destes animais já residia na cidade há mais de um ano. Estes achados reforçam a importância de programas de controle populacional com registro e identificação de cães no estado, a fim de garantir informações para a tomada de decisão e definição de estratégias de contenção de doenças exóticas. / Abstract: The organization of the health services for development of zoonosis programs control, as rabies and leishmaniasis are based on recommendations about the importance of control population of dogs, however São Paulo stateþs norms to transport dogs requires just the veterinarian authorization, no existing control and register of official agencies on the entrance of imported animals, representing risk of new diseases introduction. The present study was realized during the 36ª anti-rabies campaign on 2004 for the Botucatu city and the FMVZ/UNESP of Botucatu/SP. The objective was to describe the population of dogs emphasing the source, it was applied a questionnaire on 676 owners, 4% of 17,910 vaccinated dogs, in 20 ranks of vaccination, representing from 47, with equal distribution in five regions of the urban area. For selection of the animals, a systematic sample was performed and for sample definition, it was considered the tax of 10% of estimate error, with 95% confidence interval. Around 10% of the animals are from other cities, several had transmission of visceral leishmaniasis. Being one of the animals from another state. The majority of these animals inhabited in this city over than one year. These findings strengthen the importance of programs identification, register and control population of dogs in the state, in order to guarantee information for the decision and definition of strategies to block exotic diseases. / Orientador: José Rafael Modolo / Coorientador: Hélio Langoni / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Sônia Regina Pinheiro / Mestre

Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina. / Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis.

As leishmanioses são um conjunto de doenças infecto parasitárias, de caráter zoonótico, que acometem os seres humanos, animais domésticos e silvestres, causadas por protozoários do gênero Leishmania. O presente trabalho objetivou comparar o desempenho de testes moleculares empregados no diagnóstico da leishmaniose visceral canina, em cães classificados em diferentes estágios clínicos da doença. Foram coletadas amostras biológicas, sangue e suabe conjuntival, em 215 cães, das cidades de Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina e Ilha Solteira, todas localizadas no Estado de São Paulo, e foram separados e classificados em quatro estágios clínicos: assintomáticos, doença leve, moderada e severa, conforme os sinais clínicos, além da sorologia, hemograma e perfil bioquímico. Além disso, os animais foram submetidos a testes moleculares de PCR convencional com os primers 13A/13B, MC1/MC2, Nested-PCR ITS1, com os primers LITSR e L58S, PCR em tempo real com os primers LEISH-1 e LEISH-2 e sonda TaqMan-MGB. Nos resultados foi observado que os primers 13A e 13B, direcionados a amplificar fragmentos de kDNA de Leishmania spp., possuem uma maior capacidade em detectar animais positivos no sangue em estágio inicial de sintomatologia clínica, quando comparados aos outros (p<0,05). Utilizando amostras de suabe conjuntival não houve diferença significativa na detecção de animais positivos entre as diferentes fases clínicas e diferentes testes moleculares avaliados (p>0,05), exceto com relação aos primers MC1 e MC2, que foram significativamente menos capazes de detectar cães positivos na fase inicial da doença que os outros (p<0,05). As amostras positivas ao ITS1 sequenciadas apresentaram 99 a 100% de similaridade com Leishmania infantum. Podemos concluir que a PCR com os primers MC1 e MC2 não é indicada na detecção de cães com leishmaniose e que a PCR de sangue com os primers 13A e 13B é mais eficiente na detecção de animais no início da doença. Os resultados reforçam a necessidade de se aprimorar as ferramentas de diagnóstico e de se associar mais de uma técnica e/ou tipo de amostra para a detecção eficiente da leishmaniose canina. / Leishmaniasis is a group of parasitic infectious diseases with zoonotic potential that affect humans, domestic, and wild animals caused by protozoa of the genus Leishmania. The present study aimed to compare the performance of molecular tests used in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in dogs classified in different clinical stages of the disease. Biological samples, blood and conjunctival swab, were collected from 215 dogs from cities of Pirassununga, Santa Cruz das Palmeiras, Andradina, and Ilha Solteira, all of them located in the State of São Paulo. The animals were separated into four clinical stages: asymptomatic, mild disease, moderate disease, and severe disease according to the clinical signs, serology, hemograma, and biochemical profile. In addition, the animals were submitted to conventional PCR molecular tests with primers 13A / 13B, MC1 / MC2, Nested-PCR ITS1, with primers LITSR and L58S, real-time PCR with LEISH-1 and LEISH-2 primers, and TaqMan-MGB probe. In the results, it was observed that primers 13A and 13B directed to amplify fragments of Leishmania spp. kDNA have greater capacity to detect positive animals in blood and initial stage of clinical symptomatology, when compared to others (p<0.05). There was no significant difference in the detection of positive animals between the different clinical phases and different molecular tests evaluated using conjunctival swab samples (p>0.05), except for primers MC1 and MC2, which were significantly less able to detect positive dogs in the initial phase of the disease than the others (p<0.05). Sequenced positive samples by ITS1 showed 99 to 100% similarity to Leishmania infantum. We can conclude that PCR with the primers MC1 and MC2 is not indicated in the detection of dogs with leishmaniasis, and the PCR of blood with the primers 13A and 13B is more efficient in the detection of animals at the beginning of the disease than others. The results reinforce the necessity to improve diagnostic tools and to associate more than one technique and/or type of sample for efficient detection of canine leishmaniasis.

Leishmaniose visceral canina (LVC) é um dos problemas de saúde pública mais importantes da América Latina, pois geralmente precede a doença humana, a leishmaniose visceral americana (LVA), causada pela Leishmania (L.) infantum chagasi. No presente estudo prospectivo analisou-se durante período de dois anos a prevalência, incidência e dinâmica da evolução clínico-imunológica da infecção canina pela L. (L.) i. chagasi em uma coorte de 316 cães mestiços que vivem em área endêmica de LVA no município de Barcarena, Pará, Amazônia Brasil, pelo uso combinado do teste de imunofluorescência indireta (RIFI-IgG) e de hipersensibilidade tardia (RIM), bem como a pesquisa do parasita pela aspiração do linfonodo poplíteo para o diagnóstico da infecção. A reatividade para RIFI e RIM reconheceu três diferentes perfis de resposta imunológica: (I) RIFI (+) / RIM (-) (81 cães), (II) RIFI (-) / RIM (+) (17 cães), e (III) RIFI (+) / RIM (+) (13 cães), proporcionando uma prevalência global da infecção de 35,1% (111/316). Desta forma, a prevalência específica do perfil I (25,6%) foi superior as dos perfis II e III, 5,4% e 4,1%, respectivamente. Além disso, a frequência destes perfis entre 111 cães infectados mostrou que a taxa de 73% do perfil I também foi maior do que os dos perfis II (15,3%) e III (11,7%). A prevalência da infecção de acordo com as faixas etárias revelou que a taxa de 27,5% do grupo ≥1ano <7 anos foi maior do que as de <1 ano (5,3%) e ≥7anos (2,2%), respectivamente. Por outro lado, a incidência global da infecção foi de 5,7% cães / mês (5,4% perfil I, 0,3% perfil II e 0,0% perfil III). No entanto, observou-se uma progressiva diminuição nas taxas de incidência nos seguintes pontos de tempo: seis (3,6% cães / mês), doze (1,7% cães / mês) e vinte e quatro (0,4% cães / mês) meses do estudo. Além disso, a incidência da infecção de acordo com os grupos etários demonstraram que a taxa de 6,6% cães / mês no grupo <1 ano foi maior em comparação com as de 5,3% e 3,3% cães / mês nos grupos ≥1ano e <7 anos, e <1 ano, respectivamente. O diagnóstico parasitológico da infecção foi confirmado em 19% (21/111) no estudo da prevalência, sendo a maioria dos cães (85,7%) do perfil I, onde 61,1% eram sintomáticos e 38,9% assintomáticos. Entre o restante (14,3%), o diagnóstico foi associado ao perfil III, sendo 66,6% assintomáticos e 33,3% sintomáticos. No levantamento da incidência, o diagnóstico foi confirmado em 11% dos cães, todos pertencentes ao perfil I, sendo 60% assintomáticos e 40% sintomáticos. Com relação ao estado clínico de todos os 179 cães diagnosticados infectados durante o período de dois anos, observou-se que entre 145 (81%) cães do perfil I, 82% eram assintomáticos e 18% sintomáticos; entre os 21 (11,7%) cães do perfil II, todos (100%) eram assintomáticos; e entre 13 (7,3%) cães do perfil III, 84,6% eram assintomáticos e 15,4% sintomáticos. Além disso, observou-se que a conversão do estado clínico assintomático ao sintomática foi registado principalmente em cães do perfil I (40,2%) do que aqueles dos perfis II (5,8%) e III (9%). Por outro lado, apenas 3,2% dos cães do perfil I [RIFI (+) / RIM (-)] converteu resposta RIM (+), enquanto 80% de cães do perfil II [RIFI (-) / RIM (+)] converteu resposta RIFI (+). Por fim, demonstrou-se que 100% dos óbitos por LVC ocorreu entre os cães do perfil I, sendo 85,7% na prevalência e 14,3% na incidência. Considerando todos esses resultados, parece razoável que a interação entre parasita e resposta imune canina é suportada principalmente pelo perfil imunológico claramente vulnerável, o perfil I [RIFI (+) / RIM (-)], o qual não oferece qualquer resistência ao parasita, tornando o cão altamente susceptível à infecção / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is one of the most important public health problems in Latin America because it usually precedes human disease, American visceral leishmaniais (AVL), being caused by Leishmania (L.) infantum chagasi. In the present prospective study it was analyzed during two years period the prevalence, incidence and dynamics of the clinical-immunological evolution of canine L. (L.) i. chagasi-infection in a cohort of 316 mongrel dogs living in endemic area of AVL in Barcarena municipality, Pará State, Amazonian Brazil, by the combined use of the indirect fluorescence antibody test (IFAT-IgG) and delayed-type hypersensitivity (DTH), as well as the parasite research by the popliteal lymph node aspiration for the diagnosis of infection. The IFAT and DTH reactivity recognized three different immune response profiles: (I) IFAT(+)/DTH(-) (81 dogs), (II) IFAT(-)/DTH(+) (17 dogs), and (III) IFAT(+)/DTH(+) (13 dogs), providing an overall infection prevalence of 35,1% (111/316). In this way, the specific prevalence of profile I 25,6% was higher than those of profiles II 5,4% and III 4,1%. Moreover, the frequency of these profiles among 111 infected dogs showed that the rate 73% of profile I was also higher than those of profiles II 15,3% and III 11,7%. The infection prevalence according to the age groups revealed that the rate 27,5% of ≥1year <7years was higher than those of <1year 5,3% and ≥7years 2,2%, respectively. On the other hand, the overall incidence of infection was 5,7% dogs/month (5,4% profile I, 0,3% profile II and 0,0% profile III). However, it was noted a progressive decreasing in the incidence rates at the following time-points: six (3,6% dogs/month), twelve (1,7% dogs/month) and twenty four (0,4% dogs/month) months of the study. In addition, the infection incidence according to the age groups demonstrated that the rate 6,6% dogs/month of <1year was higher compared to those of 5,3% and 3,3% dogs/month of ≥1year and <7years, and <1year, respectively. The parasitological diagnosis of infection was confirmed in 19% (21/111) at the prevalence survey, being most dogs (85,7%) of the profile I, 61,1% symptomatic and 38,9% asymptomatic ones. Among the remainder 14,3%, the diagnosis was associated to the profile III, 66,6% in asymptomatic and 33,3% in symptomatic dogs. At the incidence survey, the diagnosis was confirmed in 11% of dogs, all from the profile I, 60% asymptomatic and 40% symptomatic ones. With regards to clinical status of all 179 infected dogs diagnosed during two years period, it was observed that among 145 (81%) dogs from the profile I, 82% were asymptomatic and 18% symptomatic ones; among 21 (11,7%) from the profile II, all (100%) were asymptomatic; and among 13 (7,3%) from the profile III, 84,6% were asymptomatic and 15,4 % symptomatic ones. Besides this, it was noted that the clinical conversion from asymptomatic to symptomatic status was principally recorded in dogs from the profile I (40,2%) than those from the profiles II (5,8%) and III (9%). By the other side, only 3,2% dogs from the profile I [IFAT(+)/DTH(-)] converted DTH(+) response, while 80% dogs from the profile II [IFAT(-)/DTH(+)] converted IFAT(+) response. At last, it was demonstrated that 100% of death by CVL occurred amongst dogs from the profile I, being 85,7% from the prevalence and 14,3% from the incidence. Taking together all these results, it seems reasonable that interaction between parasite and canine immune response is principally supported by immunologic profile clearly vulnerable, the profile I [IFAT(+)/DTH(-)], which does not offer any resistance to parasite, became the dog highly susceptible to infection

Leishmaniose visceral canina (LVC) é um dos problemas de saúde pública mais importantes da América Latina, pois geralmente precede a doença humana, a leishmaniose visceral americana (LVA), causada pela Leishmania (L.) infantum chagasi. No presente estudo prospectivo analisou-se durante período de dois anos a prevalência, incidência e dinâmica da evolução clínico-imunológica da infecção canina pela L. (L.) i. chagasi em uma coorte de 316 cães mestiços que vivem em área endêmica de LVA no município de Barcarena, Pará, Amazônia Brasil, pelo uso combinado do teste de imunofluorescência indireta (RIFI-IgG) e de hipersensibilidade tardia (RIM), bem como a pesquisa do parasita pela aspiração do linfonodo poplíteo para o diagnóstico da infecção. A reatividade para RIFI e RIM reconheceu três diferentes perfis de resposta imunológica: (I) RIFI (+) / RIM (-) (81 cães), (II) RIFI (-) / RIM (+) (17 cães), e (III) RIFI (+) / RIM (+) (13 cães), proporcionando uma prevalência global da infecção de 35,1% (111/316). Desta forma, a prevalência específica do perfil I (25,6%) foi superior as dos perfis II e III, 5,4% e 4,1%, respectivamente. Além disso, a frequência destes perfis entre 111 cães infectados mostrou que a taxa de 73% do perfil I também foi maior do que os dos perfis II (15,3%) e III (11,7%). A prevalência da infecção de acordo com as faixas etárias revelou que a taxa de 27,5% do grupo ≥1ano <7 anos foi maior do que as de <1 ano (5,3%) e ≥7anos (2,2%), respectivamente. Por outro lado, a incidência global da infecção foi de 5,7% cães / mês (5,4% perfil I, 0,3% perfil II e 0,0% perfil III). No entanto, observou-se uma progressiva diminuição nas taxas de incidência nos seguintes pontos de tempo: seis (3,6% cães / mês), doze (1,7% cães / mês) e vinte e quatro (0,4% cães / mês) meses do estudo. Além disso, a incidência da infecção de acordo com os grupos etários demonstraram que a taxa de 6,6% cães / mês no grupo <1 ano foi maior em comparação com as de 5,3% e 3,3% cães / mês nos grupos ≥1ano e <7 anos, e <1 ano, respectivamente. O diagnóstico parasitológico da infecção foi confirmado em 19% (21/111) no estudo da prevalência, sendo a maioria dos cães (85,7%) do perfil I, onde 61,1% eram sintomáticos e 38,9% assintomáticos. Entre o restante (14,3%), o diagnóstico foi associado ao perfil III, sendo 66,6% assintomáticos e 33,3% sintomáticos. No levantamento da incidência, o diagnóstico foi confirmado em 11% dos cães, todos pertencentes ao perfil I, sendo 60% assintomáticos e 40% sintomáticos. Com relação ao estado clínico de todos os 179 cães diagnosticados infectados durante o período de dois anos, observou-se que entre 145 (81%) cães do perfil I, 82% eram assintomáticos e 18% sintomáticos; entre os 21 (11,7%) cães do perfil II, todos (100%) eram assintomáticos; e entre 13 (7,3%) cães do perfil III, 84,6% eram assintomáticos e 15,4% sintomáticos. Além disso, observou-se que a conversão do estado clínico assintomático ao sintomática foi registado principalmente em cães do perfil I (40,2%) do que aqueles dos perfis II (5,8%) e III (9%). Por outro lado, apenas 3,2% dos cães do perfil I [RIFI (+) / RIM (-)] converteu resposta RIM (+), enquanto 80% de cães do perfil II [RIFI (-) / RIM (+)] converteu resposta RIFI (+). Por fim, demonstrou-se que 100% dos óbitos por LVC ocorreu entre os cães do perfil I, sendo 85,7% na prevalência e 14,3% na incidência. Considerando todos esses resultados, parece razoável que a interação entre parasita e resposta imune canina é suportada principalmente pelo perfil imunológico claramente vulnerável, o perfil I [RIFI (+) / RIM (-)], o qual não oferece qualquer resistência ao parasita, tornando o cão altamente susceptível à infecção / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is one of the most important public health problems in Latin America because it usually precedes human disease, American visceral leishmaniais (AVL), being caused by Leishmania (L.) infantum chagasi. In the present prospective study it was analyzed during two years period the prevalence, incidence and dynamics of the clinical-immunological evolution of canine L. (L.) i. chagasi-infection in a cohort of 316 mongrel dogs living in endemic area of AVL in Barcarena municipality, Pará State, Amazonian Brazil, by the combined use of the indirect fluorescence antibody test (IFAT-IgG) and delayed-type hypersensitivity (DTH), as well as the parasite research by the popliteal lymph node aspiration for the diagnosis of infection. The IFAT and DTH reactivity recognized three different immune response profiles: (I) IFAT(+)/DTH(-) (81 dogs), (II) IFAT(-)/DTH(+) (17 dogs), and (III) IFAT(+)/DTH(+) (13 dogs), providing an overall infection prevalence of 35,1% (111/316). In this way, the specific prevalence of profile I 25,6% was higher than those of profiles II 5,4% and III 4,1%. Moreover, the frequency of these profiles among 111 infected dogs showed that the rate 73% of profile I was also higher than those of profiles II 15,3% and III 11,7%. The infection prevalence according to the age groups revealed that the rate 27,5% of ≥1year <7years was higher than those of <1year 5,3% and ≥7years 2,2%, respectively. On the other hand, the overall incidence of infection was 5,7% dogs/month (5,4% profile I, 0,3% profile II and 0,0% profile III). However, it was noted a progressive decreasing in the incidence rates at the following time-points: six (3,6% dogs/month), twelve (1,7% dogs/month) and twenty four (0,4% dogs/month) months of the study. In addition, the infection incidence according to the age groups demonstrated that the rate 6,6% dogs/month of <1year was higher compared to those of 5,3% and 3,3% dogs/month of ≥1year and <7years, and <1year, respectively. The parasitological diagnosis of infection was confirmed in 19% (21/111) at the prevalence survey, being most dogs (85,7%) of the profile I, 61,1% symptomatic and 38,9% asymptomatic ones. Among the remainder 14,3%, the diagnosis was associated to the profile III, 66,6% in asymptomatic and 33,3% in symptomatic dogs. At the incidence survey, the diagnosis was confirmed in 11% of dogs, all from the profile I, 60% asymptomatic and 40% symptomatic ones. With regards to clinical status of all 179 infected dogs diagnosed during two years period, it was observed that among 145 (81%) dogs from the profile I, 82% were asymptomatic and 18% symptomatic ones; among 21 (11,7%) from the profile II, all (100%) were asymptomatic; and among 13 (7,3%) from the profile III, 84,6% were asymptomatic and 15,4 % symptomatic ones. Besides this, it was noted that the clinical conversion from asymptomatic to symptomatic status was principally recorded in dogs from the profile I (40,2%) than those from the profiles II (5,8%) and III (9%). By the other side, only 3,2% dogs from the profile I [IFAT(+)/DTH(-)] converted DTH(+) response, while 80% dogs from the profile II [IFAT(-)/DTH(+)] converted IFAT(+) response. At last, it was demonstrated that 100% of death by CVL occurred amongst dogs from the profile I, being 85,7% from the prevalence and 14,3% from the incidence. Taking together all these results, it seems reasonable that interaction between parasite and canine immune response is principally supported by immunologic profile clearly vulnerable, the profile I [IFAT(+)/DTH(-)], which does not offer any resistance to parasite, became the dog highly susceptible to infection

Orientadora: Profa. Dra. Mirela Inês de Sairre / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / As licochalconas estão naturalmente presentes na raiz de Glycyrrhiza inflata (alcaçuz) e apresentam atividades biológicas, como antitumoral, antiparasitária, anti-oxidativa e bactericida. A licochalcona "A" apresentou atividade anti-leishmania, o que despertou o interesse em investigar e testar o uso para tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC), uma zoonose grave que atinge os cães domésticos, os quais são sacrificados em virtude da falta de uma terapia eficiente. O objetivo deste trabalho é realizar a síntese total da Licochalcona "A" a partir de um reagente comercial de baixo custo, empregando uma rota sintética de quatro etapas. A síntese inclui uma reação de rearranjo sigmatrópico e a clássica condensação de Claisen-Schmidt, etapas que foram estudadas para encontrar condições reacionais catalíticas apropriadas e de grande viabilidade de execução. Além da licochalcona A, diferentes análogos poderiam ser obtidos. Este trabalho está vinculado à empresa Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda e, portanto, se insere dentro de uma perspectiva de promoção do desenvolvimento científico-tecnológico com vínculos estreitos aos interesses da indústria farmacêutica, da medicina veterinária e do setor produtivo. Realizou-se um estudo detalhado das quatro etapas da rota, testando diferentes condições reacionais. A etapa de reação de prenilação foi realizada empregando diversos substratos para, em seguida, desenvolver um estudo sobre condições reacionais em rearranjos sigmatrópicos-[3,3]. Os produtos das reações de prenilação foram obtidos com sucesso e rendimentos moderados (47- 68%). Na etapa de condensação de Claisen-Schmidt, uma chalcona prenilada desejada foi obtida com sucesso, para a síntese de um análogo da Licochalcona A, mas a etapa final de rearranjo não foi conclusiva. / Licochalcones are naturally present in the root of Glycyrrhiza inflata (licorice) and have many biological activities, such as antitumor, antiparasitic, anti-oxidative and bactericidal. Licochalcone "A" showed anti-leishmania activity, which aroused interest in investigating and testing it for the treatment of canine visceral leishmaniasis (LVC), a serious zoonosis that affects domestic dogs, which are sacrificed due to the lack of an effective therapy. This work aimed to perform the total synthesis of Licochalcone "A" from a low cost commercial reagent using a four step synthetic route. The synthesis includes a sigmatropic rearrangement reaction and the classical Claisen-Schmidt condensation, steps that were studied to find suitable catalytic reaction conditions and viable execution. Besides licochalcone A, different analogues could be obtained. This work is linked to the Centagro - Centro Tecnológico Agropecuário Ltda company and, therefore, falls within a perspective of promoting scientific and technological development with close links to the interests of the pharmaceutical industry, veterinary medicine and the productive sector. A detailed study of the four stages of the route was carried out, testing different reaction conditions. The prenylation reaction step was performed employing several substrates to then develop a study on reaction conditions in sigmatropic rearrangements-[3,3]. The products of the prenylation reactions were obtained with success and moderate yields (47-68%). In the condensation step of Claisen-Schmidt, a desired prenylated chalcone was obtained for the synthesis of an analogue of Licochalcone A, but the final step of rearrangement was not conclusive.

Made available in DSpace on 2016-08-16T18:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE SOFIA SOUSA SALES.pdf: 1314406 bytes, checksum: cf0a23c2cfdc8d768fd9d2a3edfd3773 (MD5) Previous issue date: 2012-08-11 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The aim of this study was to evaluate the protective effect of the flagellar fraction of Leishmania (L) amazonensis and BCG in dogs from endemic area for canine visceral leishmaniasis (CVL). Initially a study was conducted on an epidemiological survey in order to determine the frequency of antibodies against Leishmania in dogs of both sexes, with aged above six months and their correlation with clinical variables such as : hypertrophy of popliteal lymph nodes, skin lesions , onychogryphosis, cachexia and ocular lesions. A total of 341 dogs were used in this study. The serum of these animals was submitted to ELISA/S7 ® test. The serological results shwoed that 173 (50.73%) were positive and 135 (39.59%) were negative for anti-Leishmania antibodies. Among Seropositive animals was observed that 79 (45.66%) presented lymph node hypertrophy, 25 (14.45%) skin lesions, 23 (13.29%) onychogryphosis, 22 (12.72%) cachexia and 11 (6.36%) with the presence of ocular lesions. To evaluate the protective effect of flagellar fraction and BCG were evaluated 90 seronegative animals divided in three groups of 30animals: Group I - animals immunized with flagellar fraction doses of BCG and Group II - animals immunized with BCG and Group III - control animals inoculated with PBS. After immunization the animals remained in the endemic area and they were followed up during 14 months. For immunohistochemical analysis just 06 dogs of each group were selected randomly. However, all dogs were negative for the presence of anti-Leishmania, the immunohistochemical analysis showed amastigotes of Leishmania in the skin of 2 animals, one belonging to the Group II (5 parasites / field) and another belonging to the Group III (18 parasites / field ). The animals of group I (immunized with BCG and flagellar fraction) did not present parasites in the skin. In conclusion this study reinforce the same results obtained in murine model that immunization with flagellar fraction of L. amazonensis in combination with BCG is able to protect dogs analyzed, and the immunohistochemistry was more efficient in the diagnosis of CVL in this study. / O propósito do presente estudo foi avaliar a capacidade protetora da fração flagelar de Leishmania (L) amazonensis sob imunomodulação do BCG em cães provenientes de área endêmica para leishmaniose visceral canina (LVC) por meio da avaliação sorológica, histológica e imunohistoquímica. A priori foi realizado um estudo do tipo inquérito, sobre a ocorrência de anticorpos anti-Leishmania em cães macho e fêmea, com idade igual ou superior a seis meses e sua correlação com as variáveis clínicas: hipertrofia de linfonodos poplíteos, alterações cutâneas, onicogrifose, caquexia e lesões oculares. Os cães foram analisados sorologicamente, através do teste de ELISA/S7®, utilizando-se amostras de sangue periférico num total de 341 amostras analisadas. Desse total, 173 (50,73%) foram soropositivos e 135 (39,59%) foram soronegativos para anticorpos anti-Leishmania. Dos animais com sorologia positiva observou-se 79 (45,66%) com hipertrofia de linfonodos, 25 (14,45%) com alterações cutâneas, 23 (13,29%) com onicogrifose, 22 (12,72%) com caquexia e 11 (6,36%) com presença de lesões oculares. Para avaliar a capacidade protetora da fração flagelar imunomodulada pelo BCG, foram avaliados 90 animais com sorologia negativa para LVC, divididos em três grupos de 30 animais: Grupo I animais imunizados com doses de fração flagelar e BCG; Grupo II animais imunizados apenas com BCG e o Grupo III animais controles inoculados com PBS. Após a imunização os animais foram deixados em área endêmica e acompanhados por 14 meses. Na etapa seguinte, 06 cães de cada grupo, escolhidos aleatoriamente, tiveram sangue e fragmentos de pele da ponta da orelha coletados para posterior realização de sorologia anti-Leishmania, imunohistoquímica, imprinting e histologia. A avaliação dos resultados mostrou que todas as amostras coletadas foram negativas para a presença de anticorpos anti-Leishmania. Já a análise imunohistoquímica evidenciou formas amastigotas de Leishmania sp na pele de 2 animais, um pertencente ao Grupo II (5 parasitos/campo) e outro pertencente ao Grupo III (18 parasitos/campo). Os animais do grupo I (imunizados com fração flagelar e BCG) não apresentaram positividade em nenhuma das análises. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que a imunização com fração flagelar de L. amazonensis em associação com BCG foi capaz de proteger os cães analisados e que a técnica de imunohistoquímica mostrou-se mais eficiente no diagnóstico da LVC no presente estudo.

O presente estudo teve como objetivo caracterizar as alterações histológicas de pele, linfonodo e baço, determinar a densidade de parasitas e de células iNOS+, assim como correlacionar o parasitismo com a expressão de iNOS em pele, baço e linfonodo de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. Foram selecionados aleatoriamente, 28 cães infectados com Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, oriundos do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araçatuba, os quais foram distribuídos em dois grupos, de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais, em sintomáticos (n=18) e assintomáticos (n=10). Um grupo de 6 animais oriundos de área não endêmica para leishmaniose visceral foram empregados como controle negativo. As alterações histológicas de pele foram similares em ambos os grupos clínicos, sintomáticos e assintomáticos, e se caracterizaram por um infiltrado inflamatório na derme, formado por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), que variou de discreto a intenso. No linfonodo, as alterações histológicas foram também semelhantes entre os grupos clínicos, e se caracterizaram por hiperplasia e hipertrofia da área cortical e para-cortical, que variou de discreta a intensa; e por hiperplasia e hipertrofia de macrófagos na região medular, caracterizando em muitos casos uma linfadenite granulomatosa. No baço, alterações histológicas da polpa branca e polpa vermelha foram similares entre os grupos sintomáticos e assintomáticos, com hipoplasia e atrofia de polpa branca e, hipertorfia e hiperplasia de macrófagos na polpa vermelha, variando de moderado a intenso. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 tanto na pele, como no linfonodo e baço, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos clínicos (p=0,2104), (p=0,2401) e (p=0,8869), respectivamente. Em relação à densidade de células iNOS+(células/mm2), observamos que a infecção por Leishmania levou ao aumento do número destas células na pele, no baço e no linfonodo em relação ao controle (p < 0,05). Porém, quando analisamos a densidade de células iNOS+ entre os grupos clínicos, sintomáticos e assintomáticos, não observamos diferença significativa tanto na pele (p=0,3026), como em linfonodo (p=0,3257) e baço (p=0,5940). Observou-se correlação fraca e não significativa entre a densidade de parasitas e a densidade de células expressando iNOS+ no tegumento; porém no linfonodo, verificou-se correlação negativa moderada e significante (p=0,0034) entre o parasitismo e a expressão de células iNOS+, assim como no baço (p=0,0329), sugerindo que o óxido nítrico deve exercer um papel importante no controle do parasitismo em vísceras / The present study aimed the characterization the histological features in skin, lymph nodes and spleen; determination of the parasitism density and the cells expressing iNOS; and correlation between the parasitism and the expression of iNOS in the skin, lymph nodes and spleen of dogs naturally committed by visceral leishmaniasis. Twenty-eight naturally infected dogs by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were selected randomly from the Zoonosis Control Center of Araçatuba municipality and distributed in two groups according to the clinical signs and laboratory exams, symptomatic (n=18) and asymptomatic (n=10) animals. A group of six animals from non-endemic region for visceral leishmaniais was used as negative control. Histological changes in skin were similar in both clinical groups, symptomatic and asymptomatic, and were characterized by a focal and diffuse inflammatory infiltrate in the dermis of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes, plasmocytes), that varied from discrete to intense. In lymph nodes, the histological changes were also similar in both clinical groups, and were characterized by hyperplasia and hypertrophy of the cortical and para-cortical area, that varied from discrete to intense; and hyperplasia and hypertrophy of macrophages in the medullar region characterizing in many cases a granulomatous lymphadenitis. In spleen, the histological alterations in the white pulp and red pulp were similar in both clinical groups, with hypoplasia and hypotrophy of the white pulp and hypertrophy and hyperplasia of macrophages in red pulp varying from moderate to intense. Regarding the results of parasitism density (amastigotes/mm2), we did not observe any significant difference between the clinical groups in skin (p=0.2104), lymph nodes (p=0.2401) and spleen (p=0.8869). Concerning to the density of iNOS+ cells, we observed that the infection by Leishmania caused an increase in the number of these cells in the skin, in spleen and lymph nodes in relation to the control group (p < 0.05). However, when we analyzed the density (cells /mm2) of iNOS+ expressing cells in clinical groups, symptomatic and asymptomatic, we did not observe any significant difference in the skin (p=0.3026), in lymph nodes (p=0.3257) and spleen (p=0.5940). A weak and non-significant correlation was observed between the parasite density and the density of iNOS+ cells in the skin. However, in the lymph node a significant and moderate correlation (p=0.0034) was observed between the parasitism and iNOS+ cells, as well as in the spleen (p=0.0329), suggesting that nitric oxide plays an important role in the control of the parasitism in the viscera

Introdução - A leishmaniose visceral no Estado de São Paulo vem acometendo populações caninas e humanas de vários centros urbanos e encontra-se em franca expansão. Desde a sua introdução no Estado de São Paulo, novas áreas na região metropolitana da Grande São Paulo têm sido identificadas com a infecção na população canina e felina, sem que a espécie vetora comprovada, Lutzomyia longipalpis, tenha sido encontrada. Diferentemente de outras áreas, onde a transmissão da leishmaniose visceral se dá em ambiente urbano consolidado, na Grande São Paulo, ocorre em ambiente de transição urbano-rural. Neste ocorrem resíduos de matas nos quais os flebotomíneos antropofílicos, Pintomyia fischeri e Migonemyia migonei se desenvolvem. A capacidade vetorial é definida como a taxa diária de picadas potencialmente infectivas que a população de um vetor levará a cabo ao se alimentar em um único tipo de hospedeiro (REISEN, 1989). Objetivo Comparar a capacidade vetorial de Pintomyia fischeri e Migonemyia migonei oriundas de foco de leishmaniose visceral canina da Grande São Paulo e compará-la com a de Lu. longipalpis, proveniente de área endêmica, Campo Grande, estado de Mato Grosso do Sul, para a transmissão do agente, Leishmania (L.) infantum chagasi, da leishmaniose visceral americana. Métodos A sobrevida infectiva de cada espécie de flebotomíneo foi calculada por meio da estimativa vertical (tábua de vida) de fêmeas de primeira geração cultivadas em laboratório. Os demais parâmetros compreenderam: atratividade do cão doméstico aos flebotomíneos (dado de campo); e, em condições de laboratório: infecção experimental dos flebotomíneos pela L. (L.) i. chagasi após sua alimentação em cães infectados, período de incubação extrínseca do parasita e duração do ciclo gonotrófico. Resultados Em relação aos parâmetros estudados, observou-se respectivamente para Lu. longipalpis, Pi. fischeri e Mg. migonei: densidade de fêmeas/cão/dia 3,5, 5,5 e 0,04; proporção de fêmeas alimentando-se no cão 0,71, 0,64 e 0,70; períodos de incubação extrínseca estimados (dias) 7, 4 e 7; mediana do ciclo gonotrófico (dias) 5, 6 e 7, e sobrevida infectiva (dias) 4,13, 0,74 e 2,14. A capacidade vetorial da população de Lutzomyia longipalpis foi de 2,02 novas infecções por dia de exposição de um cão infectado. Para Pintomyia fischeri este valor compreendeu 0,108 e para Migonemyia migonei, 0,0024. Conclusões. Lu. longipalpis apresenta a capacidade vetorial em relação a Leishmania infantum chagasi 18,7 vezes à de Pi. fischeri e esta espécie 45 vezes à de Mg. migonei. Portanto, no foco de leishmaniose visceral canina da região Embu/Cotia, se demonstrada a competência para as duas espécies de flebotomíneos, Pi. fischeri poderia atuar na transmissão desta Leishmania em virtude da sua densidade elevada e infecção experimental, enquanto que a participação de Mg. migonei parece pouco provável / Introduction - Visceral leishmaniasis has been affecting canine and human populations in various urban centers in São Paulo state and the area of its distribution has been growing steadily. Since its introduction into the state, the infection has been identified in canine and feline populations of Greater São Paulo. Differently from other areas, where the transmission of visceral leishmaniasis occurs in a consolidated urban environment, in Greater São Paulo it takes place in a transitional urban-rural environment, where in the residual forests the anthropophilic sandflies Pintomyia fischeri and Migonemyia migonei are found. Vectorial capacity is defined as the daily rate of the potentially infectious bites that a vector population will inflict on one single type of host while feeding on it (REISEN, 1989). Objective To compare the vectorial capacity of Pintomyia fischeri and Migonemyia migonei from a focus of visceral canine leishmaniasis of Greater São Paulo to that of Lu. longipalpis from Campo Grande, an endemic area of the Mato Grosso do Sul state, in terms of the transmission of Leishmania (L.) infantum chagasi, the agent of American visceral leishmaniasis. Methods The infective survival time of each phlebotomine species was calculated by means of vertical estimation (life table) of first generation females bred in the laboratory. The other parameters included: the attractiveness of the domestic dog to phlebotomines (field data) and; under laboratory conditions: the experimental infection of phlebotomines by L. (L.) i. chagasi after being fed on infected dogs; the extrinsic incubation period of the parasite and the duration of the gonotrophic cycle. Results As regards the studied parameters were respectively observed for Lu. longipalpis, Pi. fischeri and Mg. migonei: the density of females/dog/day 3.5, 5.5 and 0.04; the proportion of females that fed on the dog 0.71, 0.64 and 0.70; the extrinsic incubation period (days) 7, 4 and 7 (estimated); the median gonotrophic cycle (days) 5, 6 and 7, and the infective survival period(days) 4.13, 0.74 and 2.14. The vectorial capacity of the Lutzomyia longipalpis population was calculated as 2.02 new infections per day of the exposure of an infected dog. For Pintomyia fischeri this value was 0.108 and for Migonemyia migonei, 0.0024. Conclusions. The vectorial capacity of Lu. longipalpis in relation to Leishmania infantum chagasi was 18.7 times that of Pi. fischeri and that of this latter species was 45 times that of Mg. migonei. Thus, in the focus of visceral canine leishmaniasis in the Embu/Cotia region, if the vectorial competence of the two species be demonstrated, Pi. fischeri might be active in the transmission of this leishmania by virtue of its greater density and higher experimental infection rate, whereas the participation of Mg. migonei seems unlikely

O presente estudo teve como objetivo caracterizar as alterações histológicas de pele, linfonodo e baço, determinar a densidade de parasitas e de células iNOS+, assim como correlacionar o parasitismo com a expressão de iNOS em pele, baço e linfonodo de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. Foram selecionados aleatoriamente, 28 cães infectados com Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, oriundos do Centro de Controle de Zoonoses do município de Araçatuba, os quais foram distribuídos em dois grupos, de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais, em sintomáticos (n=18) e assintomáticos (n=10). Um grupo de 6 animais oriundos de área não endêmica para leishmaniose visceral foram empregados como controle negativo. As alterações histológicas de pele foram similares em ambos os grupos clínicos, sintomáticos e assintomáticos, e se caracterizaram por um infiltrado inflamatório na derme, formado por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), que variou de discreto a intenso. No linfonodo, as alterações histológicas foram também semelhantes entre os grupos clínicos, e se caracterizaram por hiperplasia e hipertrofia da área cortical e para-cortical, que variou de discreta a intensa; e por hiperplasia e hipertrofia de macrófagos na região medular, caracterizando em muitos casos uma linfadenite granulomatosa. No baço, alterações histológicas da polpa branca e polpa vermelha foram similares entre os grupos sintomáticos e assintomáticos, com hipoplasia e atrofia de polpa branca e, hipertorfia e hiperplasia de macrófagos na polpa vermelha, variando de moderado a intenso. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 tanto na pele, como no linfonodo e baço, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos clínicos (p=0,2104), (p=0,2401) e (p=0,8869), respectivamente. Em relação à densidade de células iNOS+(células/mm2), observamos que a infecção por Leishmania levou ao aumento do número destas células na pele, no baço e no linfonodo em relação ao controle (p < 0,05). Porém, quando analisamos a densidade de células iNOS+ entre os grupos clínicos, sintomáticos e assintomáticos, não observamos diferença significativa tanto na pele (p=0,3026), como em linfonodo (p=0,3257) e baço (p=0,5940). Observou-se correlação fraca e não significativa entre a densidade de parasitas e a densidade de células expressando iNOS+ no tegumento; porém no linfonodo, verificou-se correlação negativa moderada e significante (p=0,0034) entre o parasitismo e a expressão de células iNOS+, assim como no baço (p=0,0329), sugerindo que o óxido nítrico deve exercer um papel importante no controle do parasitismo em vísceras / The present study aimed the characterization the histological features in skin, lymph nodes and spleen; determination of the parasitism density and the cells expressing iNOS; and correlation between the parasitism and the expression of iNOS in the skin, lymph nodes and spleen of dogs naturally committed by visceral leishmaniasis. Twenty-eight naturally infected dogs by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were selected randomly from the Zoonosis Control Center of Araçatuba municipality and distributed in two groups according to the clinical signs and laboratory exams, symptomatic (n=18) and asymptomatic (n=10) animals. A group of six animals from non-endemic region for visceral leishmaniais was used as negative control. Histological changes in skin were similar in both clinical groups, symptomatic and asymptomatic, and were characterized by a focal and diffuse inflammatory infiltrate in the dermis of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes, plasmocytes), that varied from discrete to intense. In lymph nodes, the histological changes were also similar in both clinical groups, and were characterized by hyperplasia and hypertrophy of the cortical and para-cortical area, that varied from discrete to intense; and hyperplasia and hypertrophy of macrophages in the medullar region characterizing in many cases a granulomatous lymphadenitis. In spleen, the histological alterations in the white pulp and red pulp were similar in both clinical groups, with hypoplasia and hypotrophy of the white pulp and hypertrophy and hyperplasia of macrophages in red pulp varying from moderate to intense. Regarding the results of parasitism density (amastigotes/mm2), we did not observe any significant difference between the clinical groups in skin (p=0.2104), lymph nodes (p=0.2401) and spleen (p=0.8869). Concerning to the density of iNOS+ cells, we observed that the infection by Leishmania caused an increase in the number of these cells in the skin, in spleen and lymph nodes in relation to the control group (p < 0.05). However, when we analyzed the density (cells /mm2) of iNOS+ expressing cells in clinical groups, symptomatic and asymptomatic, we did not observe any significant difference in the skin (p=0.3026), in lymph nodes (p=0.3257) and spleen (p=0.5940). A weak and non-significant correlation was observed between the parasite density and the density of iNOS+ cells in the skin. However, in the lymph node a significant and moderate correlation (p=0.0034) was observed between the parasitism and iNOS+ cells, as well as in the spleen (p=0.0329), suggesting that nitric oxide plays an important role in the control of the parasitism in the viscera